CN116322949A - 经涂覆的超滤装置 - Google Patents

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CN116322949A CN202180058464.6A CN202180058464A CN116322949A CN 116322949 A CN116322949 A CN 116322949A CN 202180058464 A CN202180058464 A CN 202180058464A CN 116322949 A CN116322949 A CN 116322949A
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Abstract

经涂覆的超滤装置包括：靠上室；靠下室；布置在靠上室与靠下室之间的过滤室；以及绕着过滤室基本垂直布置的半透隔膜。半透隔膜包括半透隔膜暴露于过滤室的一部分上的涂层，其中，涂层包括不是源自动物来源的超低附着涂层。

Description

经涂覆的超滤装置
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119，要求2020年7月31日提交的美国临时申请系列第63/059,425号的优先权权益，本文其内容作为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本公开内容大体上涉及经涂覆的超滤装置。
背景技术
超滤技术被用于许多行业。例如，水净化和健康护理应用(诸如透析)使用超滤技术。在生物分子行业，超滤装置可以用于生物分子的浓缩或分离。然而，常规超滤装置遭遇生物分子与装置中的隔膜发生粘结的问题，导致从超滤装置回收的生物分子的损失。
发明内容
本发明的实施方式提供了用于从水性溶液分离生物分子的超滤装置。本公开内容的装置包含涂层，相比于标准超滤装置回收，其实现了从超滤装置回收的生物分子的增加。
在本发明的方面中，提供了经涂覆的超滤装置。装置包括：靠上室；靠下室；布置在靠上室与靠下室之间的过滤室；以及以基本垂直取向绕着过滤室布置的半透隔膜，所述半透隔膜在半透隔膜暴露于过滤室的一部分上包含涂层。
在一些实施方式中，涂层可以包括：非源自动物的超低附着涂层或者不是源自动物来源的超低附着涂层。
在一些实施方式中，超滤装置可以包括圆柱形管形状。在一些实施方式中，超滤装置可以包括锥形底部。
在一些实施方式中，半透隔膜可以包括聚醚砜(PES)隔膜。在一些实施方式中，半透隔膜可以包括绕着过滤室垂直布置的两个隔膜部分。在一些实施方式中，半透隔膜可以包括选自下组的分子量截留(MWCO)：5000MWCO、10000MWCO、30000MWCO、50000MWCO、100000MWCO以及300000MWCO。
在一些实施方式中，超滤装置可以适用于在使用前的室温下储存。在一些实施方式中，超滤装置可以在使用前储存在约4℃的温度。
在一些实施方式中，超滤装置包括盖子来密封靠上室。
在一些实施方式中，超滤装置还可以包括靠上部分和靠下部分。超滤装置的靠上部分可以包括：靠上室、过滤室和半透隔膜。靠下部分可以包括靠下室。在一些实施方式中，靠上部分以可释放的方式连接到靠下部分。
在一些实施方式中，超滤装置是无菌超滤装置。
在一些实施方式中，超滤装置的形状设置成接收到离心机中。在一些实施方式中，超滤装置包括具有500μL过滤室容量的1mL离心管。在一些实施方式中，超滤装置包括具有6mL过滤室容量的15mL离心管。在一些实施方式中，超滤装置包括具有20mL过滤室容量的50mL离心管。
在一些实施方式中，超滤装置被用于细胞外囊泡纯化。
附图说明
图1显示经涂覆的超滤装置的实施方式。
图2显示经涂覆的超滤装置的实施方式。
图3显示经涂覆的超滤装置的实施方式。
图4显示经涂覆的超滤装置的实施方式。
图5是标准超滤装置与经涂覆的超滤装置实施方式中的颗粒分离的对比图。
图6是从标准超滤装置与从经涂覆的超滤装置实施方式收集的颗粒计数的对比图。
具体实施方式
在本发明的实施方式中，提供的经涂覆的超滤装置降低了生物分子与超滤装置的半透隔膜的非特异性粘结(non-specific binding)。通过向隔膜施涂超低附着试剂实现了生物分子与半透隔膜的粘结降低。超低附着试剂是：非源自动物的超低附着试剂或者不是源自动物来源的超低附着试剂。向半透隔膜施涂非源自动物的超低附着试剂增加了会由于与超滤装置的隔膜的非特异性粘结所导致的损失的生物分子的回收。
通过使用非源自动物的超低附着试剂涂层，根据本发明实施方式的超滤装置在室温下是储存稳定的，并且不需要冷藏、储存在特定条件下或者特殊包装。此外，根据本发明实施方式的装置提供了从包装即可直接易于使用的无菌预涂覆超滤装置。不同于标准装置，根据本发明实施方式的装置不需要额外的加工步骤来制备超滤也不需要在这之后在短时间内(例如，在完成加工步骤之后的约72小时内)使用。
根据本发明实施方式的装置提供了相比于常规超滤装置而言改良的用户体验。用户可以拆开装置包装立即使用，不需要额外的冗长的对装置进行阻隔或涂覆的多步骤加工以尝试改善生物分子回收。例如，常规阻隔技术可能需要额外的加工步骤：用水对装置进行清洗以及通过装置旋转液体，通过移液去除残留水，同时尝试避免移液管对隔膜造成破坏，用阻隔溶液(例子包括源自动物的阻隔剂溶液，例如：奶粉和牛血清白蛋白(BSA)和表面活性剂)，对经过填充的装置进行至少两小时或者过夜孵育，将阻隔溶液倒出，用水冲洗装置多次，以及对装置进行旋转。然而，此类常规阻隔方案需要冷藏储存，并且经过阻隔的装置必须在完成阻隔方案之后的短时间内使用(例如，在阻隔之后的约72小时内)。
相反地，根据本发明实施方式的装置不需要通过用户进行阻隔或涂覆，并且不需要在这之后的短时间内使用该装置。根据本发明实施方式的装置易于从包装直接使用，并且能够储存在室温(例如，约15℃至约25℃)直到待用。根据本发明实施方式的装置也可以冷藏或者低温(例如，约4℃)储存，但是不需要冷藏储存来保持有效性。
本发明的实施方式提供了用于从水性溶液分离生物分子的超滤装置。本公开内容的装置包含涂层，相比于标准超滤装置回收，其实现了从超滤装置回收的生物分子的增加。根据本发明实施方式的装置可以用于生物流体和水性溶液。在一些实施方式中，装置可以用于生物样品的浓缩、生物样品的纯化，或其组合。
在一些实施方式中，超滤装置被用于细胞外囊泡纯化。细胞外囊泡(EV)是由细胞分泌的生物分子，并且EV因它们在细胞间通讯中的重要性而受到越来越多的关注。超滤是可以用于从细胞培养介质浓缩EV的一种方法。
根据本发明实施方式的装置可以是可抛弃型单次使用的超滤装置。在本发明的某些方面中，超滤装置经受离心力来对生物样品进行浓缩或纯化。在一些实施方式中，施加离心力减小了溶液的体积。在一些实施方式中，施加离心力改变(change out)了溶液中的溶剂，例如脱盐。在一些实施方式中，施加离心力以不加区分的方式基于分子量使得所需要的生物分子与不需要的生物分子发生分离。
图1-4显示根据本发明实施方式的超滤装置100。经涂覆的超滤装置100包括在装置的顶端101的靠上室10，以及在与装置的顶端101相对的底端103的靠下室20。靠下室20包括顶端21和底端23。靠上室20包括顶端11和底端13。过滤室30布置在靠上室10的底端13处，并且过滤室30布置在靠上室10与靠下室20之间。过滤室30包括：与靠上室10的底端13连通的开放顶端31，与顶端31相对的封闭底端33，以及布置在顶端31与底端33之间的侧壁37，从而形成了构造成容纳液体体积的锥形形状过滤室。半透隔膜40绕着过滤室30基本垂直布置，半透隔膜40在半透隔膜40暴露于过滤室30的部分或表面上包含涂层50。在一些实施方式中，涂层布置在隔膜40形成了过滤室30的侧壁37的至少一部分的表面上。绕着过滤室30基本垂直布置的半透隔膜40可以形成过滤室30的至少一部分的侧壁37。
超滤装置100的主体60可以是任意合适形状。在一些实施方式中，超滤装置100的主体60可以包括圆柱形管形状。在一些实施方式中，超滤装置100的主体60还可以包括锥形底部部分70。如图1所示，超滤装置100还可以包括盖子80，例如拧到超滤装置主体60的螺纹部分105上的螺纹盖子。在一些实施方式中，超滤装置100还可以包括用于靠上室10的刻度体积标记15以及用于过滤室30的刻度体积标记35。
在一些实施方式中，超滤装置100还可以包括靠上部分63和靠下部分67。靠上部分63可以包括靠上室10、过滤室30以及半透隔膜部分40。靠下部分67可以包括靠下室20。在一些实施方式中，靠上部分63与靠下部分67是可以相互脱离开的。在此类实施方式中，靠上部分63与靠下部分67可以通过任意合适的可释放连接件65附连，例如：螺纹连接、卡扣连接、互锁连接，或者任意其他合适的可释放连接件。
过滤室30布置在靠上室10的底端13处。过滤室30与靠上室10一起形成了超滤装置100的靠上部分63的体积。为了对靠上部分63的体积(例如用液体或者水性溶液)进行填充，用户可以移除盖子80从而将装置100的顶端101处的开口或孔口102暴露出来。可以通过孔口102添加液体或溶液，液体从孔口102向下流动到达靠上部分63的底端处的过滤室30。在用户添加液体的时候，靠上室63中的液体体积增加，液体水平从过滤室30的底端33向上上升到装置100的顶端101，从而填充了过滤室30然后填充了靠上室10。
在一些实施方式中，半透隔膜40可以包括低粘结聚醚砜(PES)隔膜。在一些实施方式中，装置包括具有特定分子量截留(MWCO)的半透隔膜。MWCO规定了当施加作用力时可以穿过半透隔膜的分子的尺寸。在一些实施方式中，半透隔膜40可以包括绕着过滤室30基本垂直取向布置的两个隔膜部分。例如，半透隔膜40可以形成薄通道过滤室30的相对侧，其与靠上室10一起将待浓缩(或者待脱盐)的溶液保持在管的靠上部分63中。
在实施方式中，通过离心施加作用力，以促使等于或小于MWCO的溶剂和生物分子穿过半透隔膜。作用力的非限制性例子包括定角转子离心装置和摆斗式转子离心装置，例如：带有TS-5.1-500摆动转子的Beckman Allegra 25R，其具有BUC 5铲斗和368327适配器(印第安纳州印第安纳波利斯市贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.,Indianapolis,IN))；Beckman TA-10.25025°定角转子，其具有356966适配器(印第安纳州印第安纳波利斯市贝克曼库尔特有限公司)；带有(Heraeus/Sorvall)75006445摆动转子的Heraeus Multifuge3S-R，其具有75006441铲斗(马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))。
图3显示超滤装置在离心之前的实施方式。图4显示超滤装置在离心之后的实施方式。一旦含有液体或水性溶液200的超滤装置100受力(例如，离心力)，小于或等于隔膜的MWCO的颗粒从靠上室10移动穿过管达到过滤室30，穿过隔膜40，并进入到靠下室20中，同时浓缩物201留在过滤室30中并且通常来说体积得到极大的减小。因此，当施力时，过滤室30中具有小于隔膜的MWCO的颗粒的溶液从过滤室30径向移动穿过半透隔膜40从而作为滤出物203收集在靠下室20中。在离心之后，可以从装置的靠下部分67中的靠下室20收集滤出物203，并且可以从装置的靠上部分63中的过滤室30收集浓缩物201。
超滤装置的组件可以由适用于生物流体和水性溶液的任意材料构成。在一些实施方式中，超滤装置的主体由聚碳酸酯形成。在一些实施方式中，过滤室由聚碳酸酯形成。在一些实施方式中，装置的盖子是聚丙烯。在一些实施方式中，隔膜是聚醚砜隔膜。根据本发明实施方式的装置可以采用乙醇溶液(例如，70％乙醇溶液)或者杀菌气体混合物进行灭菌。
在一些实施方式中，超滤装置是康宁
Figure BDA0004113568170000061
超滤(UF)浓缩器，例如：具有20mL容量的/>
Figure BDA0004113568170000062
UF 20浓缩器，具有6mL容量的/>
Figure BDA0004113568170000063
UF 6浓缩器，或者具有500μL容量的/>
Figure BDA0004113568170000064
UF 500浓缩器(由纽约州康宁市康宁有限公司制造)。在一些实施方式中，半透隔膜是具有如下分子量截留(MWCO)的低粘结聚醚砜(PES)隔膜：5,000、10,000、30,000、50,000、100,000或者300,000，从而满足浓缩要求。例如，应该选择比要浓缩的蛋白质小一半到三分之一的MWCO。在一些实施方式中，超滤装置内的隔膜可以具有5,000MWCO、10,000MWCO、30,000MWCO、50,000MWCO、100,000MWCO、300,000MWCO，或者其他合适的MWCO。
涂层50实现了相比于标准超滤装置回收而言超滤装置的生物分子回收的增加。在一些实施方式中，涂层50可以包括非源自动物的超低附着涂层。可以通过任意合适的涂覆方法来施涂涂层。涂覆方法的非限制性例子包括：液体涂覆、浸涂、喷涂、旋涂、化学气相沉积、等离子体强化化学气相沉积等。在一些实施方式中，非源自动物的超低附着涂层可以包括超低附着粉末和纯净水，例如通过诸如Milli-QTM参考超纯水纯化系统(马萨诸塞州伯灵顿市西格玛微孔公司(MilliporeSigma,Burlington,MA))的纯化系统等产生的超纯水。在一些实施方式中，可以通过UV交联使得ULA涂层共价结合到表面。在一些实施方式中，非源自动物的超低附着涂层可以包括水凝胶，例如琼脂糖、聚二甲基硅氧烷(PDMS)以及聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚HEMA)。在一些实施方式中，非源自动物的超低附着涂层可以包括2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱(MPC)，这是一种可用于产生低粘结表面的脂状分子。
本发明的一些实施方式涉及无菌预涂覆的超滤装置。例如，在对装置进行涂覆之后，可以通过任意合适方法(例如，伽马辐射)对装置进行灭菌。常规超滤装置要求用户对装置进行灭菌，并且由于要避免造成装置内的隔膜破坏，灭菌选项是受限制的。例如，用户受限于通过使得乙醇溶液通过装置来对常规超滤装置进行灭菌。相反地，本发明实施方式提供了易于使用的经预涂覆的无菌超滤装置。
根据本发明实施方式的装置不需要在使用前的特殊包装或者储存方案。例如，装置在使用之前可以储存在室温(例如，约15℃至约25℃)条件下。在一些情况下，用户可能要求样品的超滤必须保持在低温，在此类例子中，根据本发明实施方式的装置在使用前可以储存在低温或者冷藏温度(例如，约4℃)。
实施例
在一些实施方式中，超滤装置被用于细胞外囊泡纯化。细胞外囊泡(EV)是由细胞分泌的生物分子，并且EV因它们在细胞间通讯中的重要性而受到越来越多的关注。超滤是可以用于从细胞培养介质浓缩EV的一种方法。
图5显示根据标准超滤装置与根据本发明实施方式的装置(ULA涂覆的超滤装置)(n＝3)的对比。图5对比了浓缩自标准超滤装置(STD UF-C)与来自ULA涂覆的超滤装置(ULAUF-C)的EV。经受超滤用于EV收集的起始材料是胎牛血清(FBS)。蛋白质可以聚集并使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)作为颗粒计数。如图5所示，从标准超滤装置回收的颗粒数量(EV和蛋白质聚集)低于从ULA涂覆的超滤装置回收的颗粒数量。方框表示颗粒的典型尺寸。
标准超滤装置与ULA涂覆的超滤装置进行对比的另一种方式是利用以非特异性方式粘结到半透隔膜的颗粒数量并将来自滤出物中和与留在浓缩物中的颗粒(例如，EV)数量进行对比。图6显示未经涂覆的标准超滤装置与ULA涂覆的超滤装置之间的此类对比。两种装置都接收相同的起始颗粒量。用于这个实验的起始材料是已知量的混合了免疫球蛋白(IgG)蛋白的EV。颜色较深的条表示最终进入滤出物的颗粒数量(UF-F)。颜色较浅的条反映了浓缩物中的颗粒数量(UF-C)(n＝3)。如图6所示，在标准(STD)未经涂覆超滤装置的滤出物和浓缩物中收集的颗粒总数是2.4x 109，而在ULA涂覆的超滤装置的滤出物和浓缩物中收集的颗粒总数是1.1x 1010。因此，在标准(未经涂覆)超滤装置中，8.6x109个颗粒没有得到计数。这些损失的颗粒可能以非特异性方式粘结到了测试装置的半透隔膜。
如下实验方案用于产生如图5和图6所示的数据。
材料
所用材料包括：
Figure BDA0004113568170000071
UF20 100K MWCO浓缩器(康宁有限公司，目录编号431491，纽约州康宁市)，ULA溶液(制造方案如下)，胎牛血清(FBS，康宁有限公司，目录编号35-010-CV)，用于颗粒计数和尺寸分布的纳米追踪分析(NTA)的NanoSight NS300(MilliQTM等级水(0.22μm过滤))，冷冻外泌体(约～1×10e10)(SBI，目录编号EXOP-110A-1)，以及1xPBS(目录编号21-031-CM)(0.22μm过滤)。
ULA涂覆方法
称重0.1g的PA04(超低附着粉末，明尼苏达州伊甸草原市SurModics有限公司(SurModics,Inc.,Eden Prairie,MN))并添加到100mL的milliQ水(采用马萨诸塞州伯灵顿市西格玛微孔公司制造的Milli-QTM参考超纯水纯化系统产生的超纯水)，以及采用磁力搅拌棒和盘进行混合。一旦试剂溶解，从超滤装置移除盖子并在每个超滤装置中分配6mL的ULA溶液。这足以填充薄通道过滤室从而与暴露于通道的整个半透隔膜发生接触。将容器放置在UV“D”灯泡下(峰值波长300-440nm)以接收4500mJ的能量。在交联之后，ULA溶液从装置吸出并更换盖子。将
Figure BDA0004113568170000082
UF 20(纽约州康宁市康宁有限公司)装置储存在4℃直到使用。替代的涂覆方法包括在储存之前对隔膜进行空气干燥以实现室温储存。
UV浓缩的超滤
将10mL的FBS添加到4个标准(STD)与4个ULA涂覆(ULA)Spin-
Figure BDA0004113568170000081
UF 20装置(纽约州康宁市康宁有限公司)。采用离心机中的吊桶转子以设定为3,000x g持续20分钟对溶液进行浓缩。重复离心步骤直到浓缩物体积低于2mL。收集浓缩物(顶室，UF-C)和滤出物(底室，UF-F)。采用NS300仪器和NTA 3.3软件确定颗粒浓度和尺寸分布。在分析之前，样品用水稀释以实现每帧20至80个颗粒的颗粒计数范围。将NS300仪器设定为每个样品拍摄三个60秒视频用于NTA。
虽然参照附图以及前面的发明详述说明了本公开内容的许多实施方式，但是应理解的是，本公开内容不限于所公开的实施方式，而是在不偏离由所附权利要求书所阐述和限定的本公开内容的情况下能够进行各种重排、修改和替换。

Claims (20)

1.一种经涂覆的超滤装置，其包括：
靠上室；
靠下室；
布置在靠上室与靠下室之间的过滤室；以及
绕着过滤室基本垂直布置的半透隔膜，所述半透隔膜包括在半透隔膜暴露于过滤室的一部分上的涂层。
2.如权利要求1所述的装置，其中，涂层包括非源自动物的超低附着涂层。
3.如权利要求1所述的装置，其中，超滤装置包括圆柱形管形状。
4.如权利要求3所述的装置，其中，超滤装置包括锥形底部。
5.如权利要求1所述的装置，其中，过滤室是锥形形状的过滤室，其包括：
封闭底端，
与底端相对的开放顶端，以及
布置在底端与顶端之间的侧壁，从而形成了锥形形状的过滤室。
6.如权利要求5所述的装置，其中，开放顶端布置在靠上室的底端并且与靠上室是连通的。
7.如权利要求5所述的装置，其中，绕着过滤室基本垂直布置的半透隔膜形成过滤室的至少一部分的侧壁。
8.如权利要求1所述的装置，其中，半透隔膜包括聚醚砜隔膜。
9.如权利要求1所述的装置，其中，半透隔膜包括绕着过滤室垂直布置的两个隔膜部分。
10.如权利要求1所述的装置，其中，装置适用于在使用前在室温储存。
11.如权利要求1所述的装置，其中，装置在使用前在约4℃的温度储存。
12.如权利要求1所述的装置，其中，装置包括盖子来密封靠上室。
13.如权利要求1所述的装置，其还包括靠上部分和靠下部分，
其中，装置的靠上部分包括靠上室、过滤室和半透隔膜；以及
其中，靠下部分包括靠下室。
14.如权利要求13所述的装置，其中，靠上部分以可释放的方式连接到靠下部分。
15.如权利要求1所述的装置，其中，装置是无菌的。
16.如权利要求1所述的装置，其中，超滤装置的形状设置成接收到离心机中。
17.如权利要求1所述的装置，其中，装置包括具有500μL过滤室容量的1mL离心管。
18.如权利要求1所述的装置，其中，装置包括具有6mL过滤室容量的15mL离心管。
19.如权利要求1所述的装置，其中，装置包括具有20mL过滤室容量的50mL离心管。
20.如权利要求1所述的装置，其中，半透隔膜包括选自下组的分子量截留(MWCO)：5000MWCO、10000MWCO、30000MWCO、50000MWCO、100000MWCO以及300000MWCO。
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