CN116322921A - 包括用于尺寸排阻色谱法的亲水性非离子涂层的改进装置 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于色谱表面的涂覆方法。本公开的实施方案的特征在于用于在色谱系统中产生亲水性非离子表面的两步式气‑液相有机硅烷沉积方法。

Description

包括用于尺寸排阻色谱法的亲水性非离子涂层的改进装置
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2020年10月16日提交的且名称为“包括用于尺寸排阻色谱法的亲水性非离子涂层的改进装置(Device Including a Hydrophilic,Non-Ionic Coatingfor Size Exclusion Chromatography)”的美国临时专利申请号63/092,789的优先权和权益，该临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及一种用于色谱应用的涂覆方法，该色谱应用需要亲水性和/或非离子表面或受益于该亲水性和/或非离子表面。特别地，本公开涉及一种用于色谱柱和系统内的可润湿表面(诸如具有金属表面的部件)的两步式气-液相涂覆方法。此外，本公开涉及一种改进的尺寸排阻色谱法装置和方法。
背景技术
与金属相互作用的分析物通常被证明分离极具挑战性。这些挑战中的一些挑战源自分析物与用于构造分析物行进通过的流动路径的材料的相互作用。期望具有分散程度最低的高效色谱系统，这要求流动路径的直径减小并且能够承受越来越快的流速下的越来越高的压力。因此，色谱流动路径选择的材料本质上通常是金属的。尽管事实是已知生物分子的某些特性与金属表面具有不利的相互作用，即所谓的色谱次级相互作用。
纯金属和金属合金(连同它们的对应氧化物层)具有末端金属原子，该末端金属原子具有路易斯酸特性。更简单地，这些金属原子示出接受供体电子的倾向。对于带有正电荷的任何表面金属离子而言，这种倾向甚至更为明显。具有足够的路易斯碱特性的分析物(可提供非成键电子的任何物质)可潜在地吸附到这些位点，从而形成有问题的非共价络合物。具有足以以这种方式相互作用的路易斯碱特性的分析物被定义为金属相互作用分析物。
例如，某些生物分子的磷酸酯基团是能够进行高亲和力金属螯合的优异的多齿配体。这种相互作用导致磷酸化物质与流动路径金属结合，从而减少检测到的此类物质的量，这是特别麻烦的效应，因为磷酸化物质常常是测定中最重要的分析物。
通常存在于生物分子分析物中的羧酸酯基团也具有螯合到金属的能力，尽管亲和力比磷酸酯基团低。然而，某些生物分子分析物中大量羧酸酯基团的存在为累积的基于多齿的吸附损失提供了机会。这些复杂性不仅可存在于肽和蛋白质中，而且还存在于聚糖中。例如，N-聚糖物质有时可以包括一个或多个磷酸酯基团以及一个或多个含羧酸酯的唾液酸残基。另外，较小的生物分子(诸如核苷酸和糖类，比如糖磷酸酯)可表现出与前述N-聚糖分子类似的行为。此外，色谱次级相互作用对于生物分子特别是较大的结构可能尤其成问题，因为它们具有形成微环境的能力(通过其大小和结构顺序)，该微环境可能与分离部件和流动路径表面发生不利的相互作用。在这种情况下，生物分子可呈现具有化学性质的结构区域，该化学性质放大与流动路径的材料的次级相互作用。这种放大的次级相互作用，与累积的金属螯合效应相结合，缩减生物分子的总体有效分离。
使用金属流动路径的替代方案是使用由聚合物材料诸如聚醚醚酮(PEEK)构成的流动路径。PEEK管材与大多数聚合物材料一样，通过挤出方法形成。利用聚合物树脂，该制造方法可导致高度可变的内径。因此，PEEK柱硬件在保留时间中产生了不利的差异，如可从一根柱和下一根柱之间的切换所观察到的。通常，这种变化可以比金属构造的柱高三倍。此外，用于制造基于聚合物的熔块的技术尚未充分优化，无法为商业HPLC柱提供合适的坚固部件。例如，可商购获得的PEEK熔块往往表现出不可接受的低渗透性。
因此，本领域期望提供减少生物分子分析物与它们在色谱分离期间所暴露的金属表面的螯合和次级相互作用的方法和材料。
发明内容
本发明总体上涉及一种用于改进的尺寸排阻色谱法(SEC)或阴离子交换分离的装置和方法。特别地，该装置和方法利用提供改进的性能和减少的次级相互作用的柱。一般来讲，该装置和方法特征在于金属流动路径，其中其润湿表面的至少一部分包括包含聚乙二醇硅烷的亲水性非离子涂层。在一些实施方案中，该装置和方法特征在于包括具有表面的多孔颗粒的固定相，其中至少一些部分用羟基封端的聚乙二醇改性。在一些实施方案中，该装置和方法特征在于包括阴离子交换树脂的固定相。本技术的方法的特征在于使用该装置进行分析物的SEC或阴离子交换分离，以提供改进的分离结果。
本公开还涉及一种用于使设置在流体系统的内部内的流体流动路径改性的方法。该方法通常包括使流体流动路径与有机硅烷在气相中接触以形成底漆涂层，随后使流体流动路径与液相有机硅烷接触以提供亲水性和/或非离子表面。
根据本公开现已发现，在两步式气相/溶液相方法中用某些疏水性和亲水性有机硅烷试剂涂覆仪器和色谱装置的金属流动路径提供了来自气相涂层的均匀底漆层，从而允许随后的基于溶液的涂层更均匀且完全地涂覆流动路径。所公开的方法可应用于不锈钢或其他金属流动路径部件，并且提供优于替代的非金属部件或非金属衬里部件的制造优点。即，本文方法中的一种或多种是有利的，因为它们允许由不锈钢或其他金属或高压材料制造出高压部件。然后可定制由高压材料制成的这些部件，因为可以用涂层使内部流动路径改性，以解决流动路径的疏水性。
因此，在一个方面，本技术涉及一种在色谱系统中产生亲水性非离子表面的方法。该方法包括：使用气相沉积在色谱部件的内表面上沉积底漆层；以及通过在该底漆层上沉积基于溶液的聚乙二醇(PEG)硅烷来形成该亲水性非离子表面。
在另一方面，本技术涉及用于分离样品中的分析物的色谱装置。该装置包括进样器，该进样器具有被构造用于将样品进样到流动相中的进样针；样品贮存器，该样品贮存器与该进样器流体连通；色谱柱，该色谱柱位于该进样器的下游并与该进样器流体连通，该色谱柱具有连接该进样器和该色谱柱的流体连接器和流体导管，所述流体导管、进样器、样品贮存器和色谱柱中的每一者具有内表面，所述内表面形成具有润湿表面的流体流动路径，该润湿表面的至少一部分具有如本文所述的亲水性非离子表面。在一些实施方案中，固定相包括具有表面的多孔颗粒，其中该表面的至少一些部分用羟基封端的聚乙二醇改性。在一些实施方案中，固定相包括多孔阴离子交换树脂。
在另一个方面，本技术涉及一种改进的尺寸排阻色谱法(SEC)方法，该方法包括将如本文所述的具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与基于羟基封端的PEG表面改性的二氧化硅或羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒的固定相材料结合使用。将具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与羟基封端的PEG表面改性的固定相材料结合用于SEC在减少分析物与整个系统的次级相互作用方面是特别有利的。具体地，涂覆的硬件和羟基封端的PEG表面改性的固定相材料两者的组合提供了优于常规SEC柱的优点。这些优点包括用弱缓冲流动相进行SEC分离的能力、简化的方法开发(包括降低对缓冲液、pH和柱温度的依赖性)、增强的分析物回收率、改进的分析物峰形、增强的峰分辨率、增强的再现性。
在又一个方面，本技术涉及一种改进的阴离子交换分离方法，该方法包括将如本文所述的具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与基于阴离子交换材料(例如季铵离子交换树脂)的固定相材料结合使用。在阴离子交换分离中使用具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件在减少分析物与整个系统的次级相互作用方面是特别有利的。具体地，使用具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件提供了优于常规阴离子交换柱的优点。这些优点包括增强的分析物回收率、增强的再现性和基于样品的钝化的减少。
附图说明
为了提供对本技术的实施方案的理解，参考附图，附图不一定是按比例绘制的。附图仅是示例性的，并且不应被解释为限制本技术。在附图中以示例而非限制的方式说明本文描述的公开内容。
图1是根据本技术的例示性实施方案的包括色谱柱和各种其他部件的色谱流动系统的示意图。流体被载送通过色谱流动系统，其中流体流动路径从流体管理器延伸到检测器。
图2描绘了根据所公开的方法的实施方案的改性的表面的非限制性卡通图示。
图3是示出所公开的方法的实施方案的流程图。
图4是描绘根据本公开的实施方案的在没有使用涂覆熔块的柱的SEC系统中以及对于两个参比熔块的mAb分析物标准品的示例性峰面积回收率的柱形图。
图5描绘了根据本公开的实施方案的在没有柱并且使用涂覆熔块的SEC系统中以及对于两个参比熔块的对mAb分析物标准品的示例性检测器响应。
图6A至图6T描绘了BEH200蛋白质标准品的示例性色谱分离，该示例性色谱分离在系统中的原型羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒SEC柱上使用不同的流动相(pH 6.0至8.0和NaCl浓度0mM至200mM)并使用参比不锈钢熔块进行。
图7A至图7T描绘了根据本公开的实施方案的BEH200蛋白质标准品的示例性色谱分离，该示例性色谱分离是在使用涂覆熔块的系统中的原型羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒SEC柱上使用不同的流动相(pH 6.0至8.0和NaCl浓度0mM至200mM)并使用参比不锈钢熔块进行的。
图8A至图8T描绘了恩美曲妥珠单抗(Kadcyla；Genentech)的示例性色谱分离，该示例性色谱分离是在使用参比不锈钢熔块的系统中的原型羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒SEC柱上使用不同的流动相(pH 6.0至8.0和NaCl浓度0mM至200mM)进行的。
图9A至图9T描绘了恩美曲妥珠单抗(Kadcyla；Genentech)的示例性色谱分离，该示例性色谱分离是在使用涂覆的熔块的系统中的原型羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒SEC柱上使用不同的流动相(pH 6.0至8.0和NaCl浓度0mM至200mM)并使用参比不锈钢熔块进行的。
图10是描绘参比材料和根据本公开的实施方案制备的材料的完整mAb(小鼠IgG1)的示例性％回收率与进样次数的图表。
图11是描绘参比材料和根据本公开的实施方案制备的材料的示例性％回收率与接触角的图表。
图12A至图12D描绘了根据本公开的实施方案的EPO mRNA在C2PEG涂覆的硬件阴离子交换柱上的示例性色谱分离，其中在增加的质量负荷下进行一系列重复进样。
图12E至图12H描绘了EPO mRNA在参比金属硬件阴离子交换柱上的示例性色谱分离，其中在增加的质量负荷下进行一系列重复进样。
图13A是描绘根据本公开的实施方案的在C2PEG涂覆的硬件阴离子交换柱上对EPOmRNA进行重复进样和随后的阴离子交换分离所产生的峰面积的图表。
图13B是描绘在参比金属硬件阴离子交换柱上对EPO mRNA进行重复进样和随后的阴离子交换分离所产生的峰面积的图表。
图14A是描绘根据本公开的实施方案的在C2PEG涂覆的硬件阴离子交换柱上对Cas9 mRNA进行重复进样和随后的阴离子交换分离所产生的峰面积的图表。
图14B是描绘在参比金属硬件阴离子交换柱上对Cas9 mRNA进行重复进样和随后的阴离子交换分离所产生的峰面积的图表。
具体实施方式
在描述本技术的几个示例实施方案之前，应当理解，本技术不限于在以下描述中阐述的构造或工艺步骤的细节。本技术能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。
一般来讲，本技术涉及一种用于使设置在流体系统的内部内的流体流动路径改性的方法。该方法通常包括使流体流动路径与有机硅烷在气相中接触，随后使流体流动路径与液相有机硅烷接触。通常，进行有机硅烷试剂的气相沉积，从而在流体系统(例如，液相色谱系统)的润湿表面的至少一部分上形成有机硅烷底漆涂层，并且随后进行不同有机硅烷试剂的液相沉积，从而在流体系统的润湿表面的至少一部分上形成有机二氧化硅涂层，并且与有机硅烷底漆涂层直接接触。此类涂层使流体路径改性并且减少了次级相互作用，诸如离子和/或疏水性相互作用，否则这些次级相互作用可能在某些分析物(诸如生物分子分析物)的色谱分离(例如尺寸排阻、离子交换或其他类型的色谱法)过程中发生。因此，改性的表面是生物惰性的或低结合的(意味着样品的分析物不与涂层相互作用或与涂层具有最小的相互作用)。此外，沉积的涂层是高度可调的，以提供一系列期望的接触角(例如，使润湿表面为亲水的或疏水的)、化学性质和特性，以实现对流动路径以及最终经过流动路径的分析物的期望效果。
令人惊讶地，根据本公开已经发现，有机硅烷试剂的气相沉积在高纵横比部件内提供均匀的涂层厚度，并且为随后有机硅烷试剂的随后液相沉积提供反应性底漆层。这种有机硅烷试剂(例如，聚乙二醇(PEG)衍生物)的液体涂层随后产生比没有底漆层所能实现的更致密且更均匀的涂层。根据本公开还发现，在蛋白质和疏水性分析物的尺寸排阻色谱法(SEC)分离中，将根据所公开的方法涂覆的流体系统部件(即，具有致密且更均匀的涂层亲水性涂层)与含有羟基封端的聚乙二醇表面改性的固定相颗粒的柱结合使用在SEC色谱法方面取得了显著改进。这些改进包括进一步减少疏水性相互作用。具体地，涂覆的硬件和羟基封端的PEG表面改性的固定相材料两者的组合提供了优于常规SEC柱的优点。这些优点包括用弱缓冲流动相进行SEC分离的能力、简化的方法开发(包括降低对缓冲液、pH和柱温度的依赖性)、增强的分析物回收率、改进的分析物峰形、增强的峰分辨率和增强的再现性。
根据本公开还发现，在核酸分析物(例如，mRNA)的阴离子交换分离中，使用根据所公开的方法涂覆的流体系统部件(即，具有致密且更均匀的涂层亲水性涂层)，相对于在未涂覆的流体系统部件上进行的分离，在阴离子交换分离方面取得了显著改进。这些改进包括增强的分析物回收率、增强的再现性和基于样品的钝化的减少。
虽然已经对参考非离子亲水性有机硅烷(例如聚乙二醇)的溶液相沉积的本文所公开的两步式沉积方法进行了描述，并且在本文中已经对关于SEC的所得非离子亲水性表面的使用进行了描述，但是本领域技术人员将认识到可以使用其他官能团来代替非离子亲水性有机硅烷。例如，非离子亲水性液相有机硅烷可以用例如具有离子官能度的液相有机硅烷代替。此类官能团包括但不限于磺酸、羧酸、胺、季铵基团、磷酸酯等，以及它们的组合。以这种方式改性的润湿表面可用于例如抗菌应用、金属螯合和离子色谱法。
定义
关于本公开中使用的术语，提供了以下定义。除非术语出现的文本的上下文需要不同的含义，否则本申请将使用如下定义的以下术语。
冠词“一”和“一个(种)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。贯穿本说明书使用的术语“约”用于描述和说明小波动。例如，术语“约”可以指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％、小于或等于±1％、小于或等于±0.5％、小于或等于±0.2％、小于或等于±0.1％或小于或等于±0.05％。无论是否明确指出，本文的所有数值均受术语“约”修饰。由术语“约”修饰的值当然包括具体值。例如，“约5.0”必须包括5.0。
色谱法是用于浓缩或分离存在于混合物中的一种或多种化合物(例如，生物分子)的分离方法。化合物(例如，生物分子)通常存在于样品中。本公开广泛使用术语“样品”表示个体可能期望分析的任何混合物。术语“混合物”用来表示含有一种或多种溶解的化合物(例如，生物分子)的流体。所述样品中存在的感兴趣的化合物被称为分析物。
色谱法是差速迁移过程。混合物中的化合物以不同的速率穿过柱，从而导致它们分离。迁移通过流体相(称为流动相)相对于颗粒填充床或多孔整体结构(称为固定相)的对流而发生。在色谱法的一些模式中，通过分析物与固定相和流动相的亲和力差异而发生差速迁移。
尺寸排阻色谱法(SEC)是一类基于流体动力学半径来分离或隔离混合物中的分析物的色谱法。在SEC中，由于分析物探测多孔固定相介质的体积的能力的差异而发生分离。参见例如A.M.Striegel等人的Modern Size-Exclusion Chromatography:Practice ofGel Permeation and Gel Filtration Chromatography(《现代尺寸排阻色谱法：凝胶渗透和凝胶过滤色谱法的实践》，第2版，威立出版社，新泽西州，2009年)。SEC通常用于大分子或分子络合物的分离。例如但非限制地，通过SEC分析许多生物来源的大分子(“生物分子”)，诸如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、抗体、多糖、抗体-药物缀合物及它们中任一者的片段和络合物。还通过SEC分析合成聚合物、塑料等。
通常使用具有颗粒填充床的柱来执行SEC。颗粒填充床是流动相将流动通过的分离介质或固定相。柱被放置成与泵和进样器流体连通。在压力下通过进样器将样品装载到柱上，并且通过泵将样品组分和流动相推动通过柱。样品中的组分离开柱或从柱洗脱，其中最大的分子(最大流体动力学半径)首先离开，并且最小的分子最后离开。
如针对SEC所述进行阴离子交换色谱法，不同之处在于固定相为阴离子交换树脂。在阴离子交换色谱法中，基于净表面电荷来分离或隔离混合物中的分析物。阴离子交换色谱法使用对具有净负表面电荷的分子具有亲和力的带正电的离子交换树脂。与SEC一样，阴离子交换色谱法可用于大分子或分子络合物的分离。例如但非限制地，可以分离生物分子诸如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、氨基酸或蛋白质。
在SEC和阴离子交换分离两者中，相应的柱被放置成与检测器流体连通，检测器可随着流动相离开柱而检测流动相性质的变化。检测器将登记这些变化并将其记录为曲线图，该曲线图称为色谱图，用于确定分析物是否存在，并且在以下实施方案中，用于确定分析物的浓度。分析物离开柱的时间(保留时间)指示分子的大小。分子的分子量可使用标准校准曲线来估计。用于SEC和阴离子交换色谱法的检测器的示例为但不限于折射率检测器、UV检测器、光散射检测器和质谱仪。
术语“聚乙二醇”和“聚氧化乙烯”在本文中同义使用，这两个术语都是指具有式-(O-CH2CH2)n-OH的低聚或聚合聚醚化合物。因此，“聚乙二醇”和“聚氧化乙烯”、“PEG”和“PEO”的缩写在本文中分别同义使用。
术语“甲氧基封端的聚乙二醇”，在本文中缩写为“MeO-PEO”或“MeO-PEG”，是指具有式-(O-CH2CH2)n-OMe的低聚或聚合的聚醚化合物。与羟基封端的聚乙二醇(HO-PEG)大不相同，MeO-PEG没有可用的游离羟基(OH)，已经被甲基帽化。
如本文所用，术语“使流体流动路径改性”是指通过改变表面(例如，可润湿表面)的物理特性和/或化学特性而使材料的表面改性以改进特性的过程。如本文所用，术语“改性的流体流动路径”是指已允许与至少两种不同的有机硅烷试剂反应以将有机硅烷试剂共价键合至材料的表面、彼此或两者的材料(例如，色谱系统的金属部件)。在某些实施方案中，有机硅烷试剂通过硅氧烷键附接到该材料的表面。例如，金属材料的表面含有金属氧化物和/或游离羟基基团，该金属氧化物和/或游离羟基可以与一种或多种反应性有机硅烷试剂(例如，卤素或烷氧基取代的硅烷)反应，从而产生至少M-O-Si-C连键。
如本文所用，术语“有机二氧化硅”是指将二氧化硅与各种有机化合物组合的一系列杂化材料中的任一者。
如本文所用，术语“有机硅烷”是指类似于烃的基于有机硅的单体化学品，该化学品在分子中的硅原子和碳原子之间具有至少一个直接键。
现详细描述本公开的实施方案，应理解此类实施方案仅是示例性的。此类实施方案构成本发明人现在认为是实践本技术的最佳模式的实施方案。本领域的技术人员将认识到，此类实施方案能够进行修改和更改。
装置
图1是可用于分离样品中的分析物的色谱流动系统/装置100的代表性示意图。色谱流动系统100包括若干部件，该若干部件包括流体管理器系统105(例如，控制流动通过系统的流动相)；管材110(其也可被微加工流体导管替换或与微加工流体导管配套使用)；流体连接器115(例如，流体帽)；熔块120；色谱柱125；进样器135，该进样器包括用于将样品插入或注入流动相中的针(未示出)；用于在注入之前盛装样品的小瓶、沉降器或样品贮存器130；检测器150；以及用于控制流压力的压力调节器140。色谱系统/装置的部件的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径可具有至少20、至少25、至少30、至少35或至少40的长度与直径比率。
检测器150可为质谱仪。流体流动路径可包括电喷针的润湿表面(未示出)。
润湿表面的至少一部分可涂覆有下文详细描述的有机二氧化硅涂层，以定制其疏水性并减少或消除与例如某些分析物的离子相互作用。通过气相和液相有机硅烷沉积的组合来施加涂层。因此，本技术的方法和装置提供以下优点：能够使用耐高压材料(例如，不锈钢)来形成流动系统，但也能够定制流体流动路径的润湿表面以提供适当的疏水性，因此对分析物的不利相互作用或不期望的化学效应可被最小化。
有机二氧化硅涂层可在整个系统中由从流体管理器系统105一直延伸到检测器150的管材或流体导管110提供。涂层也可被施加到流体流体路径的部分上。即，可选择涂覆一个或多个部件或部件的部分而不是整个流体路径。例如，可涂覆柱125的内部部分及其熔块120和端盖115，而流动路径的其余部分可保持不被改性。此外，可以对可移除/可替换的部件进行涂覆。例如，包含样品贮存器的小瓶或沉降器130以及熔块120可被涂覆。
在一个方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由管材的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由微加工流体导管的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由柱的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由通过熔块的通道限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由进样针的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径从进样针的内表面延伸穿过柱的内表面。在另一方面，流动路径从设置在流体系统的进样针的内表面上游并与进样针内表面流体连通的样品贮存器容器(例如，沉降器)延伸到连接器/检测器的端口。
在一些实施方案中，仅色谱柱的润湿表面和位于色谱柱上游的部件涂覆有本文所述的有机二氧化硅涂层，而位于柱下游的润湿表面未被涂覆。
流体流动路径的润湿表面的至少一部分涂覆有如本文所述的有机二氧化硅涂层。有机二氧化硅涂层对样品中的分析物中的至少一种是惰性的，诸如生物分子，包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、多糖、抗体、抗体-药物缀合物、聚糖、糖磷酸酯等。
在一些实施方案中，第一(即，底漆)涂层包含根据式I的结构
Figure BDA0004178757140000111
其中：
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为OH或ORA；
RA表示与流体流动路径的润湿表面的附接点，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一者为ORA；并且
Z为(C1-C20)烷基、-[O(CH2)2O]1-20-、-[(C1-C10)NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-[(C1-C10)烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20。
在一些实施方案中，Z为(C2-C10)烷基。
在一些实施方案中，Z为-(CH2CH2)-。
在图2中提供了非限制性的、简化的例示性实施方案。参考图2，根据本公开的实施方案的C2(乙烯)桥连硅氧烷涂层被示出为结合到金属色谱部件的表面羟基基团。
水在式I的有机二氧化硅涂层上的接触角可以变化。当将液滴(例如，水)放置在材料表面(例如，如本文所公开的有机二氧化硅涂层)上并且液滴在表面上形成圆顶形状时，形成接触角(也称为润湿角)。在表面和与液滴的边缘相切的线之间形成的角度被称为接触角Θ，在下面的图示中表示。接触角可以用例如接触角测角计测定。
Figure BDA0004178757140000121
当液滴在表面(例如亲水性表面)上扩散并且圆顶变得更平坦时，接触角变得更小。相反，当液滴在表面(例如疏水性表面)上呈珠状时，圆顶变得更高并且角度变得更大。
在一些实施方案中，式I的有机二氧化硅涂层与水的接触角为至少约15°。在一些实施方案中，式I的有机二氧化硅涂层与水的接触角可小于或等于30°。在一些实施方案中，式I的有机二氧化硅涂层与水的接触角可小于或等于90°。在一些实施方案中，式I的有机二氧化硅涂层与水的接触角介于约15°至约105°之间。例如，式I的有机二氧化硅涂层与水的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
式I的有机二氧化硅涂层的厚度可为至少约
Figure BDA0004178757140000122
例如，厚度可介于约/>
Figure BDA0004178757140000123
至约
Figure BDA0004178757140000124
之间。式I的有机二氧化硅涂层的厚度可为约/>
Figure BDA0004178757140000125
Figure BDA0004178757140000131
Figure BDA0004178757140000132
或/>
Figure BDA0004178757140000133
式I的有机二氧化硅涂层(例如，气相沉积的有机二氧化硅涂层)的厚度可通过肉眼光学检测。例如，较高的不透明度和着色指示较厚的涂层。因此，具有明显视觉区别的涂层是该技术的实施方案。当在全光谱光(诸如太阳光)下观察到涂覆的部件时，从薄到厚，颜色从黄色，变成紫色，变成蓝色，变成略微绿色，然后变回黄色。例如，当式I的有机二氧化硅涂层的厚度为/>
Figure BDA0004178757140000135
时，该涂层可呈现黄色并反射峰值波长在560nm和590nm之间的光。当式I的有机二氧化硅涂层的厚度为/>
Figure BDA0004178757140000136
时，该涂层可呈现紫色并反射峰值波长在400nm和450nm之间的光。当式I的有机二氧化硅涂层的厚度为/>
Figure BDA0004178757140000137
时，该涂层可呈现蓝色并反射峰值波长在450nm和490nm之间的光。参见例如Faucheu等人的PVDF涂层的光泽度损失与地形特征的关系(Relating Gloss Loss toTopographical Features of a PVDF Coating)，2004年10月6日公布；Bohlin、Erik的颜料涂层的表面和多孔结构(Surface and Porous Structure of Pigment Coatings)、与柔性版油墨的相互作用及其对印刷质量的影响(Interactions with flexographic ink andeffects of print quality)，Dissertation，Karlstad University Studies，2013:49。
第二有机二氧化硅涂层位于流体流动路径的润湿表面的至少一部分上，并且与第一涂层直接接触。在一些实施方案中，第二涂层包含根据式II的结构
Figure BDA0004178757140000134
其中：
R7、R8和R9各自独立地为OH或ORB；
RB表示与流体流动路径的润湿表面的附接点或表示与第一涂层的附接点，其中在任一情况下，R7、R8和R9中的至少一者为ORB；
Y为-(C1-C6)烷基-OR12、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH或苯基，其中所述(C1-C6)烷基被一个或多个卤素或选自由OH、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、氰基、-C(O)NH2、磺酸、季铵、磷酸酯和羧基组成的组的一个或多个官能团取代，并且其中所述苯基任选地被选自由(C1-C3)烷基、OH、卤素、氰基、-C(O)NH2和羧基组成的组的一个或多个基团取代。并且
R12为-(C1-C3)链烷二醇、-(C1-C3)烷基-3,4-环己二醇或-(C2-C4)烷基OH；
在一些实施方案中，RB表示与流体流动路径的润湿表面的附接点。
在一些实施方案中，RB表示与第一涂层的附接点。在此类实施方案中，本领域技术人员将认识到，当R1、R2、R3、R4、R5和R6中的一者或多者表示一个或多个羟基基团时，附接是指附接到与式I的涂层相关联的羟基基团，诸如R1、R2、R3、R4、R5和R6中的所述一者或多者。
在图2中提供了非限制性的、简化的例示性实施方案。参考图2，根据本公开的实施方案，烷基甲硅烷基聚乙二醇涂层结合到C2(乙烯)桥接硅氧烷涂层的游离羟基基团。
在一些实施方案中，Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基或-[O(C1-C3)烷基]1- 10OH。在一些实施方案中，Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10OH。
在一些实施方案中，包括根据式II的结构的第二涂层包括以下结构：
Figure BDA0004178757140000141
其中：
R7、R8和R9各自如以上所定义；
RB如以上所定义；
R13为H或CH3；
m为约1至约10的整数；并且
n为约2至约50的整数。
在一些实施方案中，m为3，并且n为约8至约12。在一些实施方案中，m为3，并且n为约6至约9。在一些实施方案中，m为3，n为约8至约12，并且R13为H。在一些实施方案中，m为3，n为约6至约9，并且R13为CH3。
水在式II的有机二氧化硅涂层上的接触角可以变化。在一些实施方案中，式II的有机二氧化硅涂层与水的接触角可为至少约15°。在一些实施方案中，式II的有机二氧化硅涂层与水的接触角可小于或等于105°。与水的接触角可小于或等于约90°。在一些实施方案中，与水的接触角介于约15°至约105°之间。例如，与水的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
式I和式II的多层有机二氧化硅涂层的组合厚度可为至少约
Figure BDA0004178757140000152
例如，厚度可介于约/>
Figure BDA0004178757140000153
至约/>
Figure BDA0004178757140000154
之间。式I和式II的多层有机二氧化硅涂层的组合厚度可为约
Figure BDA0004178757140000155
Figure BDA0004178757140000156
或/>
Figure BDA0004178757140000157
产生亲水性非离子表面的方法
在第一方面，提供了一种在色谱系统中产生亲水性非离子表面的方法，该方法包括：
a.使用气相沉积在色谱部件的内表面上沉积底漆层；以及
b.通过在该底漆层上沉积基于溶液的PEG硅烷来形成该亲水性非离子表面。图3提供了该方法的图示。
在另一方面，提供了一种使设置在流体系统的内部内的流体流动路径改性的方法，该流体流动路径具有包含羟基基团的润湿表面，该方法包括：
a.使流体流动路径与式I的汽化有机硅烷试剂接触
Figure BDA0004178757140000151
其中：
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤素组成的组；并且
Z为(C1-C20)烷基、-[O(CH2)2O]1-20-、-[(C1-C10)NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-[(C1-C10)烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20；
以形成沉积在流体流动路径的润湿表面的至少一部分上的第一涂层；以及
b.使其上沉积有第一涂层的流体流动路径与包含式II的有机硅烷试剂的溶液接触
Figure BDA0004178757140000161
其中：
R7、R8和R9各自独立地选自由C1-C6烷基、(C1-C6)烯基、-NHR10、-NR10R11、OH、OR10和卤素组成的组；
R10和R11各自独立地选自C1-C6烷基；
Y为-(C1-C6)烷基-OR12、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH或苯基，其中所述(C1-C6)烷基被一个或多个卤素或选自由OH、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、氰基、-C(O)NH2、磺酸和羧基组成的组的一个或多个官能团取代，并且其中所述苯基任选地被选自由(C1-C3)烷基、OH、卤素、氰基、-C(O)NH2和羧基组成的组的一个或多个基团取代；
R12为-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
以在流体流动路径的润湿表面的至少一部分上形成第二涂层，并且与第一涂层直接接触。
在一些实施方案中，Z为(C2-C10)烷基。在一些实施方案中，Z为-(CH2CH2)-。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由(C1-C2)烷氧基、-N((C1-C2)烷基)2和卤素组成的组。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为甲氧基或各自为氯。
在一些实施方案中，式I的试剂是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
在一些实施方案中，R7、R8和R9各自独立地选自由-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基和卤素组成的组。在一些实施方案中，R7、R8和R9各自为乙氧基或各自为二甲氨基。
在一些实施方案中，Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基或-[O(C1-C3)烷基]1- 10OH。在一些实施方案中，Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，其中Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10OH。
在一些实施方案中，式II的有机硅烷试剂具有以下结构：
Figure BDA0004178757140000171
其中
m为约1至约10的整数；
n为约2至约50的整数；并且
R13、R14和R15各自为OEt。
在一些实施方案中，m为约3，或为3。
在一些实施方案中，n是表示不同聚乙二醇链长的混合物的平均值。例如，在一些实施方案中，n可以为8至12，这意味着链长的平均分布落在8至12个聚乙二醇单元之间。在其他实施方案中，n可以是具体值，诸如约8、约9或约10至约11或约12。在一些实施方案中，m为3且n为约8至约12。
在一些实施方案中，式II的有机硅烷试剂具有以下结构：
Figure BDA0004178757140000172
其中
m为约1至约10的整数；
n为约2至约50的整数；并且
R13、R14和R15各自为Cl、OCH3或二甲氨基。
在一些实施方案中，m为约3，或为3。
在一些实施方案中，n是表示不同聚乙二醇链长的混合物的平均值。例如，在一些实施方案中，n可以为8至12，这意味着链长的平均分布落在8至12个聚乙二醇单元之间。在一些实施方案中，n可以为6至9。在其他实施方案中，n可以是具体值，诸如从约6、约7、约8、约9或约10至约11或约12。在一些实施方案中，m为3，并且n为约6至约9。
在一些实施方案中，式II的有机硅烷试剂为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)6-9丙基]三(二甲氨基)硅烷。
通常，溶液包括溶剂。合适的溶剂包括挥发性烃，诸如脂族或芳族有机溶剂。在一些实施方案中，溶剂是甲苯。
溶液可含有一定浓度范围内的有机硅烷试剂，诸如按体积计的量为约0.01％至约10％或约0.05％至约1％。在一些实施方案中，按体积计的浓度为约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1.0％至约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在某些实施方案中，有机硅烷试剂的浓度可以更高，诸如按体积计为15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或甚至99％或以上。
与式I或式II的有机硅烷试剂的接触可持续例如约1秒至约3天的持续时间。在一些实施方案中，与式I的有机硅烷试剂的接触的时间段为约1秒至约30分钟或约5秒至约15分钟。
在一些实施方案中，与式II的有机硅烷试剂的接触的时间段为约1小时至约96小时或约6小时至约48小时或约12小时至约24小时。
与式I或式II的有机硅烷试剂的接触可在多种不同的温度条件下发生。在一些实施方案中，与式I或式II的有机硅烷试剂的接触在约0℃至约100℃或约10℃至约25℃的温度下。在一些实施方案中，与式II的有机硅烷试剂的接触在约15℃至约25℃的温度下。
在一些实施方案中，第一涂层的至少一部分被水解。这通常可通过在所述接触期间将第一涂层和/或式I的有机硅烷试剂暴露于水来完成。
在一些实施方案中，第二涂层的至少一部分被水解。这通常可通过在与式II的有机硅烷试剂接触之后将流体流动路径暴露于水来完成。在进行此类水解时，任何残留R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8或R9基团的至少一部分被转化为OH基团或通过硅氧烷键彼此交联。
在一些实施方案中，在流体流动路径与包含有机硅烷试剂的溶液的接触之后，去除任何过量的有机硅烷试剂。通常，此类去除可通过洗涤、漂洗、浸渍、冲洗或以其他方式将流体流动路径至少一次暴露于至少一种溶剂来完成。在一些实施方案中，溶剂是甲苯。在一些实施方案中，溶剂是醇。在一些实施方案中，醇是异丙醇。在一些实施方案中，该方法包括洗涤、漂洗、浸渍、冲洗或以其他方式将流体流动路径依次暴露于两种不同的溶剂，诸如甲苯和异丙醇。
在一些实施方案中，流体流动路径是干燥的。可使用任何合适的方法，诸如暴露于真空、加热或两者。在一些实施方案中，该方法还包括在流体流动路径与包含有机硅烷试剂的溶液的接触之后干燥流体流动路径，该干燥包括将流体流动路径暴露于高温一段时间。
在一些实施方案中，将第一涂层退火。可使用任何合适的方法，诸如暴露于热一段时间。
在一些实施方案中，不锈钢流动路径部件(包括但不限于管材、微加工流体导管、柱熔块、柱入口管材和进样针)经由所公开的方法涂覆。在一个方面，将这些涂覆的部件退火以改变它们的化学或物理性质。
在一些实施方案中，由除不锈钢或其他金属以外的其他材料制成的流动路径部件(例如，聚合物、玻璃等)经由所公开的方法涂覆。具体地讲，对系统内使用的熔块或可连接到进样针的样品小瓶进行涂覆。
色谱装置
在另一方面，本技术涉及用于分离样品中的分析物的色谱装置。该装置包括进样器，该进样器具有被构造用于将样品进样到流动相中的进样针；样品贮存器，该样品贮存器与该进样器流体连通；色谱柱，该色谱柱位于该进样器的下游并与该进样器流体连通，该色谱柱具有连接该进样器和该色谱柱的流体连接器和流体导管，所述流体导管、进样器、样品贮存器和色谱柱中的每一者具有内表面，所述内表面形成具有润湿表面的流体流动路径，该润湿表面的至少一部分具有如本文所述的亲水性非离子表面。
进行尺寸排阻色谱法的方法
本文公开了一种改进的尺寸排阻色谱法(SEC)方法。该方法包括将如本文所述的具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与基于羟基封端的PEG表面改性的二氧化硅或羟基封端的PEG表面改性的无机-有机杂化颗粒的固定相材料结合使用。将具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与羟基封端的PEG表面改性的固定相材料结合用于SEC在减少分析物与整个系统的次级相互作用方面是特别有利的。该方法通常包括使含有至少一种分析物的样品与如本文所述的柱色谱装置接触；使流动相流过固定相材料一段时间；以及使该至少一种分析物在流动相中从固定的固定相洗脱。
固定相材料
尺寸排阻色谱法(SEC)在对分析物具有基于尺寸的亲和力的固定相材料上进行。具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件和利用如本文所述的金属流动路径部件的改进的尺寸排阻色谱法(SEC)方法与适用于SEC分离的典型固定相材料(例如，甲氧基封端的聚乙二醇和二醇键合/涂覆的键合相)相容。如上文所述，当与具有减少的次级(即，离子和疏水性)相互作用的固定相材料组合时，具有本公开的亲水性非离子表面的金属流动路径部件是特别有利的。此类固定相材料的一个示例为包括具有表面的多孔颗粒，其中该表面的至少相当大一部分用羟基封端的聚乙二醇(PEG)进行改性。改性的多孔颗粒可以是二氧化硅或无机-有机杂化颗粒。此类羟基封端的PEG改性的多孔颗粒的非限制性示例是其中羟基封端的聚乙二醇具有下式的那些：
Figure BDA0004178757140000201
其中：
m为约1至约10的整数；
n为约2至约50的整数；并且
其中波浪线指示与多孔颗粒的表面的附接点。
进行阴离子交换色谱法的方法
本文公开了一种改进的阴离子交换色谱法方法。该方法包括将如本文所述的具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件与基于离子交换树脂的固定相材料结合使用。该方法通常包括使含有至少一种分析物的样品与如本文所述的柱色谱装置接触；使流动相流过固定相材料一段时间；以及使该至少一种分析物在流动相中从固定的固定相洗脱。
固定相材料
在固定相材料上进行阴离子交换分离，该固定相材料是对具有净负表面电荷的分子具有亲和力的带正电的离子交换树脂。具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件和利用如本文所述的金属流动路径部件的改进的阴离子交换分离方法与适用于阴离子交换色谱法的典型阴离子交换树脂(诸如季铵离子交换树脂)相容。如上文所述，本公开的具有亲水性非离子表面的金属流动路径部件相对于在其中金属流动路径部件未被表面改性的系统上进行的阴离子交换分离而言在增强分析物回收率和增强再现性方面是有利的。
分析物
如本文所公开的用于进行SEC或阴离子交换分离的改进方法包括含有至少一种分析物的样品。值得注意的是，当前公开的方法的效用不限于生物药物或蛋白质分析物。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括小分子药物、天然产物或聚合物。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括一种或多种生物分子。在一些实施方案中，生物分子为核酸(例如，RNA、DNA、寡核苷酸)、蛋白质(例如，融合蛋白)、肽、抗体(例如，单克隆抗体(mAb)、抗体-药物缀合物(ADC)、多糖、病毒、病毒样颗粒、病毒载体(例如，基因疗法病毒载体、腺相关病毒载体)、生物类似物或它们的任何组合。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括核酸、多糖、肽、多肽、蛋白质、生长因子、碳水化合物、脂肪酸、脂质、聚糖、离子(例如，金属离子)或它们的任何组合。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括抗体。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括单克隆抗体(mAb)。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括抗体的高分子量物质或聚集体形式。在一些实施方案中，该至少一种分析物是抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，该至少一种分析物包括核酸，该核酸为RNA，诸如mRNA。在一些实施方案中，该至少一种分析物是聚糖、肽、除草剂或杀虫剂。在一些实施方案中，聚糖为磷酸聚糖。在一些实施方案中，肽为磷酸肽。在一些实施方案中，除草剂为草甘膦。
流动相
如本文公开的用于进行SEC和阴离子交换色谱法的方法包括使流动相流过固定的固定相一段时间。流动相通常包括水、缓冲液和任选的一种或多种盐。在某些具体实施方案中，通过高效液相色谱(HPLC)系统提供流动相和任选样品。
缓冲液用于控制流动相的离子强度和pH。根据分析物的性质，可以使用许多不同的物质作为缓冲液。合适缓冲液的非限制性实例包括磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷和乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸铵。在一些实施方案中，缓冲液是碱金属磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸钠或磷酸钾。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或它们的组合。缓冲液的浓度可根据期望的pH和流动相的离子强度而变化。
在一些实施方案中，流动相包含盐。如本文所用，术语“盐”是指包含碱金属或碱土金属和卤素(例如，氟化物、氯化物、溴化物、碘化物)的离子化合物。不期望的相互作用可以通过利用盐减少离子次级相互作用来减轻。然而，增加盐浓度可诱导聚集并因此导致天然单体的减少，并且添加高浓度的盐可加剧疏水相互作用，并使流动相优化复杂化。当存在时，合适的盐包括但不限于氯化钠和氯化钾。流动相中盐的合适浓度范围可为约10mM至约200mM。
如上文所述，已经主要结合SEC分离和减少或消除疏水性和离子次级相互作用讨论了方法(method)、装置和方法(process)的实施方案。本领域技术人员将认识到，在替代的实施方案中可利用其他官能团，并且本文设想可利用此类官能团的其他分离方法，例如疏水性相互作用和其他反相色谱法。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明材料和方法，并且不对范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素是所公开的材料和方法的实践必需的。
相关领域的普通技术人员将显而易见，在不脱离任何实施方案或其方面的范围的情况下，可对本文所述的组合物、方法和应用进行合适的修改和改变。所提供的组合物和方法是示例性的，并不旨在限制所要求保护的实施方案的范围。本文公开的各种实施方案、方面和选项全部可以在所有变型中组合。本文所述的组合物、配制物、方法和过程的范围包括本文的实施方案、方面、选项、实施例和优选方案的所有实际或潜在组合。
尽管已参考特定实施方案描述了本文的技术，但应理解这些实施方案仅说明本技术的原理和应用。对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术的方法和设备进行各种修改和变型。因此，本技术旨在包括在所附权利要求及其等同项的范围内的修改和变型。
在本说明书全篇提到“一个实施方案”、“某些实施方案”、“一个或多个实施方案”或“一实施方案”意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本技术的至少一个实施方案中。因此，诸如“在一个或多个实施方案中”、“在某些实施方案中”、“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”的短语在本说明书各处的出现不一定是指本技术的同一实施方案。此外，特定的特征、结构、材料或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。本文所引用的任何范围都包括在内。
参考以下实施例更全面地说明本技术的各方面。在描述本技术的几个示例性实施方案之前，应当理解，本技术不限于在以下描述中阐述的构造或工艺步骤的细节。本技术能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实践或进行。阐述以下实施例以说明本技术的某些方面且不应解释为对其的限制。
实施例
本发明可通过以下描述色谱装置和方法的非限制性实施例进一步说明。
材料
除非另有说明，否则所有试剂均按原样使用。本领域技术人员将认识到存在以下供应品和供应商的等同形式，因此，下面列出的任何供应商不应被解释为限制性的。
方法
实施例1.C2-C10气相沉积涂层(底漆)
使金属部件经受有机硅烷试剂的气相沉积以形成底漆层。在涂覆之前，根据硝酸钝化，将所有金属部件钝化。然后将钝化部件和硅晶片引入气相沉积室并建立真空。第一步骤是等离子体清洁步骤。接下来是第一气相沉积循环。每个气相沉积循环包括有机硅烷气相沉积，然后引入水蒸气以进行有机硅烷水解。在第一压力下递送有机硅烷蒸气，然后在第二压力下递送水蒸气。递送之后，使有机硅烷和水与基材反应。重复该循环以产生期望数量的层和涂层厚度。在该实施例中，使用双(三氯甲硅烷基)乙烷硅烷来建立约
Figure BDA0004178757140000242
的粘附或底漆层。涂覆后退火步骤可用于进一步交联并增加涂层的疏水性。通常，退火循环涉及在真空下使涂层经受高温。
硅晶片用作试样块以测量涂层的厚度和接触角。为了测量厚度，使用盖特纳科学公司(Gaertner Scientific Corporation)的斯托克斯椭圆仪模型LSE。通过分析光的偏振变化并与模型进行比较，可确定膜厚度。
实施例2.气相涂层上的PEG液相沉积涂层(C2PEG)
将根据实施例1制备的涂覆的金属部件用聚乙二醇(PEG)有机硅烷试剂的溶液处理。在这种情况下，将C2涂覆的4.6mm、0.2μm多孔钛熔块与有机硅烷试剂的稀甲苯溶液一起搅拌；例如2-[甲氧基(聚乙烯氧基)6-9丙基]三(二甲氨基)硅烷；Gelest SIM6492.77)。使试剂溶液与熔块反应约三天。弃去溶液，将熔块在甲苯中洗涤(浸渍)三次，在异丙醇中洗涤(浸渍)三次。熔块在70℃下真空干燥，然后冷却。
实施例3.单独的PEG液相沉积涂层(参比)
将十个未涂覆的4.6mm、0.2μm多孔钛熔块添加到含有稀有机硅烷溶液的瓶中；例如2-[甲氧基(聚乙烯氧基)6-9丙基]三(二甲氨基)硅烷；甲苯中的Gelest SIM6492.77)。使试剂溶液与熔块反应约三天。弃去溶液，将熔块在甲苯中洗涤(浸渍)三次，在异丙醇中洗涤(浸渍)三次。熔块在70℃下真空干燥，然后冷却。
实施例4.次级相互作用的评价-SEC条件，无柱
将根据实施例1、2和3制备的多孔钛熔块分别装载到没有柱的HPLC系统(
Figure BDA0004178757140000241
H-Class Bio系统；购自Waters Corporation,Milford,MA)中，并使用符合SEC应用的流动相和蛋白质标准品在H-Class Bio过滤器装配参数下进行测试。参数如下：/>
·样品：完整mAb质量检查标准品，0.667mg/mL
·样品稀释剂：25mM磷酸钠(pH 6.8)、75mM氯化钠
·流动相：25mM磷酸钠(pH 6.8)、75mM氯化钠
·针洗涤：90/10甲醇水溶液
·进样体积：0.5微升(0.33微克)
·UV波长：280nm
·流速：0.15mL/min
·30℃
在图4中提供的结果表明，在这些测量条件下，使用根据实施例2的两步式涂覆方法使蛋白质回收率最大化。具体地，气相沉积的底漆与液体PEG涂覆方法的组合产生最低的蛋白质吸附。不受理论束缚，据信气相沉积产生更具反应性的表面，该表面易于通过水解/缩合反应接受液相PEG硅烷，从而实现非特异性蛋白质结合的减少。在不存在底漆层的情况下(实施例3)，PEG硅烷未能结合到天然金属氧化物层，从而产生通过次级(离子)相互作用结合到蛋白质的大部分未涂覆的金属表面。单独的底漆层(实施例1)产生也通过非特异性结合位点结合到蛋白质的表面，导致如图5的代表性色谱图中所示差的蛋白质回收率。相反，根据实施例2制备的熔块(气相底漆和溶液相PEG)使蛋白质回收率最大化，如大的分析物峰所示(图5)。
实施例5.次级相互作用的评价-SEC
使用原型SEC柱(羟基封端的聚乙二醇表面改性的杂化颗粒)在SEC分离中评价参比(未处理的)标准不锈钢硬件和根据实施例2涂覆的硬件的性能。如下制备固定相颗粒。
在溶胶-凝胶合成中，使用Wyndham等人，Analytical Chemistry 2003,75,6781-6788和美国专利第6,686,035号中报道的程序通过1,2-双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(BTEE)与原硅酸四乙酯(TEOS)的共缩合合成具有经验式SiO2(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)0.25的有机/无机杂化颗粒，每个参考文献以引用方式全文并入本文。获得的无机-有机杂化乙烯桥连颗粒具有1.7μm的平均粒度和
Figure BDA0004178757140000251
的平均孔隙直径。表面积为171m2/g，孔隙容积为1.26cm3/g。然后将无机-有机杂化乙烯桥连颗粒键合以形成羟基封端的PEG键合的固定相颗粒。将无机-有机杂化乙烯桥连颗粒分散在甲苯中(10mL/g)。通过共沸蒸馏(110℃，1小时至2小时)从材料中去除残留的水。将反应温度降低至40℃以下并且添加浓盐酸(200μL/g颗粒)，接着添加[羟基(聚乙烯氧基)8-12丙基]三乙氧基硅烷(8μmol/m2)。将反应搅拌5分钟，并将温度增加至110℃保持20小时。然后将反应冷却至室温，并经由过滤分离颗粒。随后使用以下顺序洗涤颗粒：5×甲苯、1×丙酮、4×丙酮/水(1:1v/v)和2×丙酮。键合反应后，用乙酸铵进行残留乙氧基甲硅烷基的水解。将颗粒分散在丙酮(8.2mL/g颗粒)和0.12M乙酸铵溶液(1.8mL/g颗粒)的混合物中，并将混合物在59℃下搅拌2小时。然后将反应冷却至<40℃，并经由过滤分离颗粒。随后将分离的颗粒用丙酮/水(1:1v/v)洗涤三次并用丙酮洗涤两次。将分离的表面改性颗粒在70℃下真空干燥16小时。羟基封端的PEG的表面覆盖率为1.73μmol/m2。将羟基封端的PEG键合的固定相颗粒装载在4.6×150mm柱中。
分离使用可商购获得的高效液相色谱(HPLC)系统(
Figure BDA0004178757140000261
Figure BDA0004178757140000262
H-ClassBio系统；可从Waters Corporation,Milford,MA获得)进行。流动相的主要成分是pH 6-8的40mM磷酸钠和0mM至200mM氯化钠。分析物是BEH200蛋白质标准品混合物(甲状腺球蛋白、IgG、BSA、肌红蛋白和尿嘧啶)或恩美曲妥珠单抗(Kadcyla)。
使用参比硬件和根据实施例2涂覆的硬件的BEH200蛋白质标准品混合物的SEC的结果分别在图6A至图6T和图7A至图7T中提供。具体地，对于参比硬件，图6A至图6E是用不含NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图6F至图6J是用含50mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图6K至图6O是用含100mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；并且图6P至图6T是用含200mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图。对于涂覆的硬件，图7A至图7E是用不含NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图7F至图7J是用含50mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图7K至图7O是用含100mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；并且图7P至图7T是用含200mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图。其中的色谱图表明，涂覆的硬件在不太理想的流动相条件下极大地改进了峰形状和峰面积，并且涂覆的硬件不太依赖于盐浓度或pH。此外，当在羟基封端的聚乙二醇结合的SEC颗粒柱上与根据实施例2的涂覆的硬件组合进行SEC分离时，低缓冲液浓度(例如，40mM)对于利用典型蛋白质的几乎没有方法开发的质量色谱法是足够的。
使用参比硬件和根据实施例2涂覆的硬件的Kadcyla分析物的SEC的结果分别在图8A至图8T和图9A至图9T中提供。具体地，对于参比硬件，图8A至图8E是用不含NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图8F至图8J是用含50mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图8K至图8O是用含100mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；并且图8P至图8T是用含200mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图。对于涂覆的硬件，图9A至图9E是用不含NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图9F至图9J是用含50mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；图9K至图9O是用含100mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图；并且图9P至图9T是用含200mM NaCl的流动相在6.0至8.0的pH值下获得的色谱图。
其中的色谱图表明，涂覆的硬件极大地改进了疏水性抗体药物缀合物Kadcyla的色谱法。此外，涂覆的硬件允许相对于流动相组成的更大自由度。具体地，当使用未涂覆的参比硬件时，在不产生峰的条件下用涂覆的硬件观察到Kadcyla峰。当在与涂覆的硬件组合的原型羟基封端的聚乙二醇表面改性的杂化颗粒柱上进行SEC分离时，弱缓冲的流动相对于这种挑战性分析物是足够的。
特别地，图7A至图7T和图9A至图9T中显示的结果证明了与涂覆的硬件与原型羟基封端的聚乙二醇表面改性的混合颗粒柱的组合使用相关的显著优点。
实施例6.各种多孔材料的蛋白质吸附的评价
蛋白质吸附可限制色谱分离的准确度和精度。因此，最小的蛋白质吸附对于更准确和精确的SEC分析来说是期望的。蛋白质倾向于通过离子和疏水性相互作用粘到各种材料上，特别是在SEC中使用的含水流动相中。为了获得对各种材料的疏水性的理解并确定蛋白质吸附和疏水性之间是否存在相关性，进行实验以评价从几个LC过滤器组件的蛋白质回收率。具体地，评价以下4.6mm过滤器组件：
·0.2μm钛(参比)
·具有C2涂层的0.2μm钛(参比)
·具有C2-PEG涂层的0.2μm钛(本发明的；根据实施例1和2通过涂覆钛熔块制备)
·具有C2-C10涂层的0.2μm钛(参比)
·0.2μm 316不锈钢(参比)
·0.5μm PEEK(聚醚醚酮；参比)
在HPLC系统上使用定制的过滤器保持器进行完整mAb质量检查标准品(小鼠IgG1；Waters PN 186006552)的进样(
Figure BDA0004178757140000282
H-Class Bio系统；可从WatersCorporation,Milford,MA获得)进行。在表1中提供了测试参数。
表1.仪器测试参数
流动相 25mM磷酸钠pH 6.8、75mM氯化钠
流速 0.15mL/min
梯度 等度
密封洗涤 90/10水/甲醇
采集时间 1分钟
样品温度 4℃
过滤器组件温度 30℃
进样体积 1.7μL
样品稀释剂 25mM磷酸钠pH 6.8、75mM氯化钠
波长 280nm
取样速率 20点/秒
将每种过滤器组件类型中的一种过滤器组件类型放置在过滤器保持器内，并且进行完整mAb质量检查标准品的10次进样。对于每次进样，使用下式通过将每次进样的峰面积除以系统的平均峰面积来计算标准品回收率：
Figure BDA0004178757140000281
通过移除熔块保持器并用低体积活接头替换它来测定系统峰面积。将10次进样的平均面积用作从系统获得的峰面积。对每次进样和每种过滤器组件类型绘制完整mAb的回收率值(图10)。如图10所示，除C2-PEG涂层之外的所有材料表现出经多次进样的完整mAb回收率的增加。不受理论的束缚，据信这种回收率的增加可归因于用完整mAb逐渐装载过滤器组件，这限制了进一步完整mAb吸附的效果。在一些情况下，回收率稳定在低于100％回收率，这指示蛋白质(完整mAb)吸附和解吸之间的动态平衡。本发明的C2-PEG涂层允许从第1次进样到第10次进样的最大回收率，表明最小吸附。
实施例7.接触角测定
测定实施例6的过滤器组件中利用的各种参比材料和涂覆的材料的接触角(疏水性的量度)。获得待评价的每种材料的平坦平面试样块。对于参比未涂覆的316不锈钢，用阴离子洗涤剂溶液(例如，购自Alconox Inc.,White Plains,NY,USA的1％
Figure BDA0004178757140000292
溶液)清洁2"×2"金属片样品(#8Finish，0.06"厚)，用去离子水漂洗，用氮气吹干，并立即测定接触角。对于参比未涂覆的2级钛，如对于316不锈钢试样块所描述的那样，洗涤、漂洗和干燥2"×2"金属片样品(无光泽饰面，0.063"厚)，并立即测定接触角。为了获得涂覆的表面的准确读数，根据实施例1和2的程序涂覆硅晶片，并在沉积完成后立即测量接触角。
对于每个试样块，使用Rame-Hart测角计或轮廓曲线仪测量接触角。在每种情况下，将一滴反渗透纯化水(约3μL)分配在试样块表面上，并进行所得的接触角测量。在表2中提供了每个试样块的接触角。上述实施例6中获得的平均完整mAb回收率也在表2中提供。如图11所示，绘制了接触角与十次进样的平均回收率值之间的关系。
表2.接触角和平均回收率
Figure BDA0004178757140000291
Figure BDA0004178757140000301
*从Wang等人，“PEEK surface modification by fast ambient-temperaturesulfonation for bone implant applications”，《英国皇家学会界面杂志》(Journal ofthe Royal Society Interface)，2019年3月6日在线出版获得的接触角。
参考图11和表2，数据指示，一般来讲，接触角与蛋白质吸附之间没有相关性。普遍接受的是，亲水性表面对于限制疏水性蛋白质吸附是优选的，但显然涉及更多的因素，因为令人惊讶地，最具亲水性表面(即，钛)具有最差的平均回收率。换句话讲，仅基于接触角不能完全解释C2-PEG涂层的非结垢特性。例如，表面电荷、表面粗糙度和涂层组织/形态是用接触角测量不能检测到的因素中的一些因素，并且其可以进一步促成C2-PEG涂层的非结垢特性。总之，在C2-PEG涂覆的表面上没有蛋白质(完整mAb)吸附说明了可以通过使用具有这种表面涂层的硬件(例如，过滤器熔块)在色谱分离中实现的性能增益。
实施例8.各种多孔材料的蛋白质吸附的评价
信使RNA(mRNA)是重要的生物分子。mRNA是核糖体用于表达新蛋白质的DNA转录物。mRNA也代表了一类新的先进治疗医用产品。例如，mRNA现在用于针对SARS-CoV-2(负责COVID-19感染的β-冠状病毒)给患者接种疫苗。因此，需要建立灵敏和精确的方法以确保此类mRNA治疗剂在临床试验之前被良好地表征，并且它们在被批准用于商业化后可再现地制备。
阴离子交换分离是用于测量大的多阴离子分子(诸如mRNA)的异质性的有希望的方法。然而，当用传统的金属硬件LC柱分离mRNA时遇到挑战。特别地，对于金属硬件柱，给定质量负荷的重复进样倾向于显示大于10％的峰面积的RSD值。这种在重复分析中缺乏再现性是有问题的。
因此，在mRNA样品的代表性阴离子交换分离中评价根据本公开的实施方案制备的涂覆的金属硬件柱的性能。具体地，在强阴离子交换柱上以2ng至20ng范围的质量负荷进行两种不同mRNA样品(20μg/mL的EPO mRNA或Cas9 mRNA，可购自TriLink XYZ)的盐梯度分离。使用常规金属硬件柱或根据本公开制备的C2-PEG涂覆的金属硬件柱在HPLC系统(
Figure BDA0004178757140000311
H-Class Bio Plus(Premier)系统；购自Waters Corporation,Milford,MA)上进行分离。在每种情况下，流动相为5微米粒径的无孔季铵强阴离子交换剂(Protein-PakTM Hi Res IEX；柱尺寸100mm×4.6mm；可从Waters Corporation,Milford,MA获得)进行。洗脱液包括流动相A(25mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)；pH＝7.5(1.51g TRIS碱/0.5L水)和流动相B(流动相A中的2M NaCl(29.9g NaCl/0.5L“A”)，流速为0.2mL/min。用30％至70％流动相B的梯度洗脱8分钟。进样体积为0.1μL、0.2μL、0.5μL和1μL(5×重复和重复进样)。柱温为60℃。通过在280nm波长下监测的UV吸收进行检测。
在增加的质量负荷下用一系列重复进样分离EPO mRNA的结果示于图12A至图12H中。用本公开的C2-PEG涂覆的硬件阴离子交换柱进行的分离在图12A至图12D中提供。用参比金属硬件阴离子交换柱进行的分离在图12E至图12H中提供。报道了在每个给定质量负荷下5次重复进样的RSD值。在图13A和图13B中分别提供了C2-PEG涂覆的硬件柱和参比金属硬件柱由EPO mRNA的重复进样和随后的阴离子交换分离产生的峰面积。在图14A和图14B中分别提供了C2-PEG涂覆的硬件柱和参比金属硬件柱由Cas9 mRNA的重复进样和随后的阴离子交换分离产生的峰面积。
总体上，所获得的结果表明，在使用C2-PEG涂覆的硬件的情况下，在每个给定的质量负荷下实现了更高的峰面积以及因此更高的回收率。与参比金属硬件柱相比，通过使用C2-PEG涂覆的硬件表面获得了范围从15％至200％的峰面积增加。随着回收率和一致性的改进，注意到C2-PEG涂覆的硬件需要较少的基于样品的钝化。

Claims (36)

1.一种用于尺寸排阻色谱法的色谱装置，所述色谱装置包括：
色谱柱，所述色谱柱包括含有固定相的隔室和限定润湿表面的内壁，
其中所述润湿表面的至少一部分包括包含聚乙二醇硅烷的亲水性非离子涂层，并且其中所述固定相包括具有表面的多孔颗粒，其中所述表面的至少一些部分用羟基封端的聚乙二醇改性。
2.一种在色谱系统中产生亲水性非离子表面的方法，所述方法包括：
a.使用气相沉积在色谱部件的内表面上沉积底漆层；以及
b.通过在所述底漆层上沉积基于溶液的PEG硅烷来形成所述亲水性非离子表面。
3.一种使设置在流体系统的内部内的流体流动路径改性的方法，所述流体流动路径具有包含羟基基团的润湿表面，所述方法包括：
a.使所述流体流动路径与式I的汽化的有机硅烷试剂接触
Figure FDA0004178757130000011
其中：
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤素组成的组；并且
Z为(C1-C20)烷基、-[O(CH2)2O]1-20-、-[(C1-C10)NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-[(C1-C10)烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20；
以形成沉积在所述流体流动路径的所述润湿表面的至少一部分上的第一涂层；以及
b.使其上沉积有所述第一涂层的所述流体流动路径与包含式II的有机硅烷试剂的溶液接触
Figure FDA0004178757130000021
其中：
R7、R8和R9各自独立地选自由C1-C6烷基、(C1-C6)烯基、-NHR10、-NR10R11、OH、OR10和卤素组成的组；
R10和R11各自独立地选自C1-C6烷基；
Y为-(C1-C6)烷基-OR12、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH或苯基，其中所述(C1-C6)烷基被一个或多个卤素或选自由OH、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、氰基、-C(O)NH2、磺酸和羧基组成的组的一个或多个官能团取代，并且其中所述苯基任选地被选自由(C1-C3)烷基、OH、卤素、氰基、-C(O)NH2和羧基组成的组的一个或多个基团取代；
R12为-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
以在所述流体流动路径的所述润湿表面的至少一部分上形成第二涂层，并且与所述第一涂层直接接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中Z为(C2-C10)烷基。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中Z为-(CH2CH2)-。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由(C1-C2)烷氧基、-N((C1-C2)烷基)2和卤素组成的组。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为甲氧基或者各自为氯。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中式I的所述试剂为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中R7、R8和R9各自独立地选自由-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基和卤素组成的组。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中R7、R8和R9各自为乙氧基或者各自为二甲氨基。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的方法，其中Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基或-[O(C1-C3)烷基]1-10OH。
12.根据权利要求3-11中任一项所述的方法，其中Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基。
13.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其中Y为-[O(C1-C3)烷基]1-10OH。
14.根据权利要求3-13中任一项所述的方法，其中式II的有机硅烷试剂为2-[甲氧基(聚乙烯氧基)6-9丙基]三(二甲氨基)硅烷。
15.根据权利要求3-14中任一项所述的方法，其中式II的有机硅烷试剂具有以下结构：
Figure FDA0004178757130000031
其中
m为约1至约10的整数；
n为约2至约50的整数；并且
R1、R2和R3各自为OEt。
16.根据权利要求15所述的方法，其中m为3，并且n为约8至约12。
17.根据权利要求3-16中任一项所述的方法，其中所述溶液还包括脂族或芳族有机溶剂。
18.根据权利要求3-17中任一项所述的方法，其中所述溶液包括按体积计约0.01％至约10％或约0.05％至约1％的量的所述有机硅烷试剂。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述溶剂为甲苯。
20.根据权利要求3-19中任一项所述的方法，其中与所述有机硅烷试剂的所述接触的时间段为约1小时至约96小时、或约6小时至约48小时、或约12小时至约24小时。
21.根据权利要求3-20中任一项所述的方法，其中与所述有机硅烷试剂的所述接触是在约0℃至约100℃、或约10℃至约25℃的温度下进行的。
22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，还包括在所述流体流动路径与包括所述有机硅烷试剂的所述溶液的所述接触之后去除任何过量的有机硅烷试剂，去除包括用至少一种溶剂漂洗所述流体流动路径至少一次。
23.根据权利要求3-22中任一项所述的方法，还包括在所述流体流动路径与包括所述有机硅烷试剂的所述溶液的所述接触之后干燥所述流体流动路径，干燥包括将所述流体流动路径暴露于高温一段时间。
24.根据权利要求3-23中任一项所述的方法，还包括水解所述第一涂层、所述第二涂层或两者的至少一部分，所述水解包括使所述流体流动路径与水接触。
25.根据权利要求3-24中任一项所述的方法，还包括对所述第一涂层进行退火。
26.根据权利要求3-25中任一项所述的方法，其中所述第一涂层具有约
Figure FDA0004178757130000041
至约
Figure FDA0004178757130000042
的厚度。
27.根据权利要求3-26中任一项所述的方法，其中所述第一涂层具有约
Figure FDA0004178757130000043
至约
Figure FDA0004178757130000044
的厚度。
28.根据权利要求3-27中任一项所述的方法，其中所述第一涂层和所述第二涂层一起具有约
Figure FDA0004178757130000045
至约/>
Figure FDA0004178757130000046
的总厚度。
29.根据权利要求3-28中任一项所述的方法，其中所述第一涂层和所述第二涂层一起具有约
Figure FDA0004178757130000047
至约/>
Figure FDA0004178757130000048
的总厚度。
30.根据权利要求3-29中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径至少部分地由管材的内表面限定。
31.根据权利要求3-30中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径至少部分地由微制造流体导管的内表面限定。
32.根据权利要求3-31中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径至少部分地由柱的内表面限定。
33.根据权利要求3-32中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径至少部分地由穿过熔块的通道限定。
34.根据权利要求3-33中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径至少部分地由进样针的内表面限定。
35.根据权利要求3-34中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径从进样针的所述内表面延伸穿过柱的所述内表面。
36.根据权利要求3-35中任一项所述的方法，其中所述流体流动路径从设置在进样针的内表面上游并与所述进样针内表面流体连通的样品贮存器容器延伸到连接器/检测器的端口。
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