CN116287442A - 一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括检测人乳头瘤病毒引物和探针，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述探针选自核酸序列包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.25所示的探针中的任意一种或至少两种的组合。本发明巧妙设计能够特异性扩增人乳头瘤病毒的引物和分子信标探针，实现高灵敏度、特异性扩增，同时巧妙设计探针的Tm值，能够在熔解曲线分析中进行明显区分，从而实现快速、准确且高灵敏地对HPV合计23个型别进行分型检测，并精准判断每种型别。

Description

一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomvirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。目前已经确定HPV型别已经超过了120种，约30余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。不同亚型的HPV感染导致不同病变，根据病变的程度高低，将HPV亚型分为高危型和低危型。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变；高危型与子宫颈癌及子宫上皮内瘤变的发生有关，高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加，而从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展宫颈癌大约需要5-10年。因此，有针对性地对高危型HPV进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
目前常见的HPV检测方法包括测序法、杂交捕获法及荧光PCR法等。测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，灵敏度低，不适于临床应用；荧光PCR法由于仪器受通道的限制，每个反应管只能检测4-5个荧光通道且每个通道只能检测一个病原，使得每管检测的病原不超过4个；PCR杂交法不仅需要具有专业的扩增设备、杂交仪器和显色设备外，还需要经历开盖点样操作，容易导致产物污染从而造成假阳性，影响样本检测结果的准确性。
综上所述，开发高效、操作简单、低成本的HPV检测方法，能够进行高灵敏度检测以及精准分型，对于HPV检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用，本发明巧妙设计能够特异性扩增人乳头瘤病毒的引物和分子信标探针，具备高灵敏度和特异性，同时结合荧光PCR及熔解曲线分析，能够快速、准确且高灵敏地对HPV合计23个型别进行分型检测并精准分型。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测人乳头瘤病毒引物和探针，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的序列，所述探针选自核酸序列包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.25所示的探针中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，巧妙设计能够特异性扩增人乳头瘤病毒的引物和分子信标探针，分子信标探针在空间结构上能使荧光基团和淬灭基团达到无限接近的程度，结合高特异性引物，实现高灵敏度、特异性扩增，同时巧妙设计探针的Tm值，能够在熔解曲线分析中进行明显区分，从而实现快速、准确且高灵敏地对HPV合计23个型别进行分型检测，并精准判断每种型别。
本发明中，所述引物探针组合包括检测人乳头瘤病毒HPV-6、HPV-11-1、HPV-56、HPV-58、HPV-68、HPV-82、HPV-26、HPV-39、HPV-51、HPV-52-1、HPV-73、HPV-59、HPV-31、HPV-35、HPV-45-1、HPV-53、HPV-83、HPV-16-1、HPV-18-1、HPV-33、HPV-42、HPV-66和HPV-81的引物和探针。
所述HPV-6的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
所述HPV-11-1的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
所述HPV-56的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
所述HPV-58的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
所述HPV-68的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
所述HPV-82的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
所述HPV-26的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。所述HPV-39的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。所述HPV-51的探针的核酸序列包括SEQ IDNO.11所示的序列。所述HPV-52-1的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
所述HPV-73的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.13所示的序列。所述HPV-59的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.14所示的序列。所述HPV-31的探针的核酸序列包括SEQ IDNO.15所示的序列。所述HPV-35的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.16所示的序列。所述HPV-45-1的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.17所示的序列。
所述HPV-53的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.18所示的序列。所述HPV-83的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.19所示的序列。所述HPV-16-1的探针的核酸序列包括SEQ IDNO.20所示的序列。
所述HPV-18-1的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.21所示的序列。
所述HPV-33的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.22所示的序列。所述HPV-42的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.23所示的序列。所述HPV-66的探针的核酸序列包括SEQ IDNO.24所示的序列。所述HPV-81的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.25所示的序列。SEQ IDNO.1：gtccatcgattcttggtgttc。
SEQ ID NO.2：caataaagtcccgagggttg。
SEQ ID NO.3：cattatgtgcatccgtaactacatcttccacatacacc。
SEQ ID NO.4：catacactaattcagattataa。
SEQ ID NO.5：taagtaaatatgatgcacgaaaaattaatcag。
SEQ ID NO.6：ggtacatataaaaatgataattttaa。
SEQ ID NO.7：ttatgatcctaataagtttaaggaatatat。
SEQ ID NO.8：cattagcactgctgttactcaatctgttgcacaaacatttactccagc。SEQ IDNO.9：atttaaaccatctgattataaacaattta。
SEQ ID NO.10：gatccttctaagtttaaggaatataccaggcac。
SEQ ID NO.11：gccactgctgcggtttccccaacatttactcc。
SEQ ID NO.12：atataaaaatgaaaattttaa。
SEQ ID NO.13：ctctaattttaaagaatatttaagacatgcagaa。
SEQ ID NO.14：ctaatgtatacacacctaccagttttaaagaatatgccagacatgt。SEQ IDNO.15：tttaaaagtagtaattttaaagagt。
SEQ ID NO.16：cagtacatataaaaatgacaattttaag。
SEQ ID NO.17：tacatatgatcctactaagt。
SEQ ID NO.18：tccacatataattcaaagcaaattaaacag。
SEQ ID NO.19：cacaggctaatgaatacacagcctctaactttaaggaatacctccgcc。SEQ IDNO.20：tacatataaaaatactaactttaa。
SEQ ID NO.21：aatatgatgctaccaaatttaa。
SEQ ID NO.22：atataaaaatgaaaattttaaagaatatata。
SEQ ID NO.23：gtgatacatatacagctgctaa。
SEQ ID NO.24：ctaaatatgatgcacgtgaaatcaatcaataccttc。
SEQ ID NO.25：gctacatctgctgctgcagaatacaaggcctctaactttaaggaatttct。优选地，所述引物探针组合还包括内参基因的引物和探针。
优选地，所述内参基因包括RNase P基因。
优选地，所述内参基因的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的序列。
优选地，所述内参基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.28所示的序列。
SEQ ID NO.26：agatttggacctgcgagcg。
SEQ ID NO.27：gagcggctgtctccacaagt。
SEQ ID NO.28：ttctgacctgaaggctctgcgcg。
优选地，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、TexasRed或LC RED460中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3或TAMRA中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，巧妙设计探针的Tm值，即可实现在同一荧光通道内区分多个不同的曲线，通过合理分配，即可实现在4个荧光通道中同时精准辨别HPV 23个型别，例如，本发明一具体实施例中，将HPV-11、HPV-58、HPV-68、HPV-56、HPV-6和HPV-82探针修饰FAM荧光基团，则在FAM通道可能分别会在53℃出现HPV-11特异性熔解峰、在59℃出现HPV-58特异性熔解峰、在64℃出现HPV-68特异性熔解峰、在68.5℃出现HPV-56特异性熔解峰、在73℃出现HPV-6特异性熔解峰、在77.5℃出现HPV-82特异性熔解峰；将HPV-52、HPV-26、HPV-73、HPV-39、HPV-59和HPV-51探针修饰VIC荧光基团，则在VIC通道可能分别会在51℃出现HPV-52特异性熔解峰、在61℃出现HPV-26特异性熔解峰、在66℃出现HPV-73特异性熔解峰、在71℃出现HPV-39特异性熔解峰、在74.5℃出现HPV-59特异性熔解峰、在77℃出现HPV-51特异性熔解峰；将HPV-45、HPV-31、HPV-35、HPV-53、HPV-83和RNase P探针修饰ROX荧光基团，则在ROX通道可能分别会在52.4℃出现HPV-45特异性熔解峰、在58℃出现HPV-31特异性熔解峰、在63℃出现HPV-35特异性熔解峰、在66.5℃出现HPV-53特异性熔解峰、在73.4℃出现内标RNaseP特异性熔解峰、在78℃出现HPV-83特异性熔解峰；将HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-42、HPV-66和HPV-81探针修饰Cy5荧光基团，则在Cy5通道可能分别会在54℃出现HPV-16特异性熔解峰、在58℃出现HPV-18特异性熔解峰、在63℃出现HPV-33特异性熔解峰、在66℃出现HPV-42特异性熔解峰、在73℃出现HPV-66特异性熔解峰、在79℃出现HPV-81特异性熔解峰。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合在制备检测人乳头瘤病毒的产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合。
优选地，所试剂盒还包括荧光PCR试剂。
可以理解，本发明共设计了针对HPV 23个型别的引物和探针，选择其中不同的探针组合，即可制备检测不同数量、型别HPV的试剂盒。
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合在检测人乳头瘤病毒中的应用。
第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测人乳头瘤病毒的方法，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合进行荧光PCR，对荧光PCR产物进行熔解曲线分析，判断人乳头瘤病毒分型。
本发明中，采用特定的引物探针组合，结合荧光PCR及熔解曲线分析，实现了快速、准确且高灵敏地对HPV合计23个型别进行分型检测，并精准判断每种型别，具有广阔的应用前景，如环境样品、食物等安全检测，HPV基础行为研究等。
优选地，所述荧光PCR的条件为：(1)93～96℃预变性3～6min；(2)93～96℃、8～12s，58～62℃、25～35s，进行40～45个循环；
优选地，所述熔解曲线分析的条件为：(1)93～96℃、1～3min；(2)43～46℃、110～130s；(3)以1％速率升温至93～96℃。
第六方面，本发明提供一种检测人乳头瘤病毒的装置，所述装置包括扩增单元和熔解曲线分析单元；
所述扩增单元用于执行包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合进行荧光PCR；
所述熔解曲线分析单元用于执行包括：
对所述扩增单元的荧光PCR产物进行熔解曲线分析，判断人乳头瘤病毒分型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明巧妙设计特定引物探针组合，结合荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对HPV合计23个型别进行分型检测并分型，检测灵敏性性高(检出下限均可以达到1拷贝)、特异性好，具有高通量、低成本等特点；
(2)本发明荧光定量PCR反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小；
(3)本发明可以采用不对称+熔解曲线分析的方法，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限，本发明中的一个荧光通道可以检测至少两个靶标。
附图说明
图1为实施例4中FAM通道熔解曲线图；
图2为实施例4中VIC通道熔解曲线图；
图3为实施例4中ROX通道熔解曲线图；
图4为实施例4中Cy5通道熔解曲线图；
图5为实施例5中灵敏度分析结果图；
图6为实施例6中特异性分析结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测并区分HPV的试剂盒，包括分别针对HPV的4组特异性引物(表1)，通过扩增效果对比，筛选具备高特异性的引物，以及根据Tm值筛选的经过不同标记的分子信标；同时为了在检测中避免假阴性的出现，在体系中加入内标基因(RNase P)的检测靶标，具体的基因序列及其标记方法如表2所示。
表1
Figure BDA0004014913750000041
Figure BDA0004014913750000051
表2
Figure BDA0004014913750000052
实施例2
本实施例进行核酸样本的提取。
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头；
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
1.4分别移取900μL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；
1.5小心移取300μL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
1.6盖上Eppendorf管盖，25℃孵育10min；
1.713,000rpm、25℃离心20s；
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击Eppendorf管底部，使白色沉淀重悬；
1.11移取300μLNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
1.12打开Eppendorf管，移取100μLProtein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管盖，振荡器上剧烈振荡20s；13,000rpm、25℃离心3min；
1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；
1.14移取300μL异丙醇入Eppendorf管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；
1.1513,000rpm、25℃离心1min；
1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
1.17移取300μL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
1.1813,000rpm、25℃离心1min；
1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
1.21目测沉淀大小，加入80μL DNARehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用NanoDrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于等于20ng/μL且OD260/OD280为1.9±0.2视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution溶解核酸；
1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4℃冰箱。
实施例3
本实施例提供一种检测人乳头瘤病毒的方法。
2.1在试剂准备区配制25μL PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表3所示；
表3
酶反应液 12.5μL
HPV-GP5+-bc1(10μM) 0.7μL
HPV-GP6+-bc1(10μM) 3.5μL
RnaseP-F(1μM) 0.15μL
RnaseP-R(10μM) 0.2μL
各探针(100μM) 0.04μL*24
ddH2O 1.99μL
2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2.0μL至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号，PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；
2.3设置程序后在将PCR管放入适配器，并安装到扩增仪内，并按照下表4设置反应程序，所选通道(FAM/VIC/ROX/Cy5)；
表4
Figure BDA0004014913750000071
2.4点击“start”开始仪器运行。
3.结果判读：分别看对应的FAM、VIC、ROX和Cy5通道是否出现特异性的熔解峰，本实施例中，FAM通道可能分别会在53℃出现HPV-11特异性熔解峰、在59℃出现HPV-58特异性熔解峰、在64℃出现HPV-68特异性熔解峰、在68.5℃出现HPV-56特异性熔解峰、在73℃出现HPV-6特异性熔解峰、在77.5℃出现HPV-82特异性熔解峰(图1)，VIC通道可能分别会在51℃出现HPV-52特异性熔解峰、在61℃出现HPV-26特异性熔解峰、在66℃出现HPV-73特异性熔解峰、在71℃出现HPV-39特异性熔解峰、在74.5℃出现HPV-59特异性熔解峰、在77℃出现HPV-51特异性熔解峰(图2)，ROX通道可能分别会在52.4℃出现HPV-45特异性熔解峰、在58℃出现HPV-31特异性熔解峰、在63℃出现HPV-35特异性熔解峰、在66.5℃出现HPV-53特异性熔解峰、在73.4℃出现内标RNase P特异性熔解峰、在78℃出现HPV-83特异性熔解峰(图3)，Cy5通道可能分别会在54℃出现HPV-16特异性熔解峰、在58℃出现HPV-18特异性熔解峰、在63℃出现HPV-33特异性熔解峰、在66℃出现HPV-42特异性熔解峰、在73℃出现HPV-66特异性熔解峰、在79℃出现HPV-81特异性熔解峰(图4)。若出现对应特异性熔解峰，则可判断对应HPV分型阳性。
实施例4
本实施例对相同12例样本(来源于合作医院的经过荧光定量PCR验证阳性的临床样本)进行一代测序，并进行分型分析。
一代测序结果分析。
在“experiment”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“gene scaning”，点击“Calculate”键，对所有检测标本进行基因型分析。
将本发明方法检测12例样本结果与一代测序进行对比。
本发明方法12例样本检测1.5h+结果分析0.5h，合计2h。而一代测序检测8h+结果分析1h，合计9h。且本发明方法检测的荧光定量PCR检测为闭管操作，不需进行产物纯化测序等二次处理，因而也不存在扩增产物污染的风险。
本发明方法检测12例样本与一代测序检测结果的对比，如表5所示，对于来自临床的12例qPCR验证阳性样本所述本发明检测结果的型别与医院提供的结果一致，由于一代测序检出下限较差，部分阳性样本未检出。
表5
Figure BDA0004014913750000072
Figure BDA0004014913750000081
实施例5
本实施例分析本发明方法检出下限。
将待检测的各型别HPV扩增子区域分布克隆到同一个质粒上，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成并且进行质粒定量。将质粒依次10倍倍比稀释至10000copies/μL、1000copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，参照实施例3对上述稀释比的病毒进行检测，待检测各型的检测下限均为1copies/μL，表明本发明检测人乳头瘤病毒的方法具备高灵敏度，其中示例性结果图如图5所示，HPV-35、HPV-39、HPV-82在第一通道质粒梯度图谱，根据信号峰由高到低分别为100copies/μL、10copies/μL和1copies/μL。
实施例6
本实施例分析本发明方法特异性。
将HPV其他未检测型别40、43、44、54、61、67、69、70、71、72扩增子区域分布克隆到同一个质粒上，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成并且进行质粒定量。将质粒按照108copies/μL参照实施例3对上述稀释度的病毒进行检测，结果如图6所示，40、43、44、54、61、67、69、70、71、72扩增子在第一、第二、第三和第四通道质粒梯度图谱，均未出现明显的熔解峰，表明本发明检测人乳头瘤病毒的方法具备良好的特异性。
综上所述，本发明设计23个型别HPV的引物和分子信标探针，结合荧光PCR和熔解曲线分析策略，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济地在一管中检测23个型别HPV，同时能对HPV的各型别进行精准区分，能够满足实际检验工作中相关病原检测的要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测人乳头瘤病毒引物和探针；
所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；
所述探针选自核酸序列包括SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.25所示的探针中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参基因的引物和探针；
优选地，所述内参基因包括RNaseP基因；
优选地，所述内参基因的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的序列；
优选地，所述内参基因的探针的核酸序列包括SEQ ID NO.28所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、TexasRed或LCRED460中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3或TAMRA中任意一种或至少两种的组合。
4.权利要求1-3任一项所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合在制备检测人乳头瘤病毒的产品中的应用。
5.一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所试剂盒还包括荧光PCR试剂。
7.权利要求1-3任一项所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合在检测人乳头瘤病毒中的应用。
8.一种以非疾病诊断为目的的检测人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用权利要求1-3任一项所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合进行荧光PCR，对荧光PCR产物进行熔解曲线分析，判断人乳头瘤病毒分型。
9.根据权利要求8所述的以非疾病诊断为目的的检测人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，所述荧光PCR的条件为：(1)93～96℃预变性3～6min；(2)93～96℃、8～12s，58～62℃、25～35s，进行40～45个循环；
优选地，所述熔解曲线分析的条件为：(1)93～96℃、1～3min；(2)43～46℃、110～130s；(3)以1％速率升温至93～96℃。
10.一种检测人乳头瘤病毒的装置，其特征在于，所述装置包括扩增单元和熔解曲线分析单元；
所述扩增单元用于执行包括：
以待测样本中核酸为模板，权利要求1-3任一项所述的用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合进行荧光PCR；
所述熔解曲线分析单元用于执行包括：
对所述扩增单元的荧光PCR产物进行熔解曲线分析，判断人乳头瘤病毒分型。
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