CN116286934A - 恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，以P.putidaKT2440为原始菌，构建得到敲除菌ΔCapB和过表达菌株CapB，构建敲除菌ΔCspA1和过表达菌株CspA1，构建敲除菌ΔCspA2和过表达菌株CspA2，证明了冷休克蛋白作为一种调控蛋白作用于细胞，通过调控细胞释放OMV进而影响细胞对有机化合物的耐受性，这一发现对优化底盘细胞调控网络从而提高生物合成有机化合物的效益意义重大。
Description
技术领域
本发明属于微生物合成有机物技术领域，具体涉及到恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法。
背景技术
在微生物合成有机化合物的工业过程中，其耐受性是限制底盘生产效益的关键瓶颈之一。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida,P.putida)由于生物安全、有机化合物耐受性强是合成有机化合物的典型潜力微生物。该菌耐受有机化合物的因素包括：细胞膜屏障、外膜囊泡(outer membranevesicle,OMV)、外排泵、能量和氧化还原代谢、损伤修复、信号转导调控。其中，P.putida通过释放OMV清除有机化合物以耐受其胁迫，进而影响细胞生长与合成化合物的效率。然而，P.putida释放OMV耐受有机化合物的调控机制不清楚严重限制了该菌的开发。因此，迫切需要解析P.putida释放OMV耐受有机化合物的调控机制，对优化底盘细胞调控网络从而提高生物合成有机化合物的效益意义重大。
在原核生物中，温度急剧降低，一组小分子(约7kDa)的酸性应激蛋白表达上调，这组蛋白称为冷休克蛋白(Cold shockprotein,Csp)。冷休克蛋白控制生物过程和细菌应对环境变化，如冷冻、生长期、渗透压、饥饿、抗生素、紫外线、有机溶剂等。研究最多的冷休克蛋白是E.coli的CspA，其5’UTR长达159bp，可感知环境、调节基因表达；结构中有5个β折叠、7个芳香族氨基酸在同侧及结合单链核酸的YNP1和RNP2结构域，是RNA伴++侣。冷休克蛋白作为核酸伴侣，通过转录激活、转录抗终止、增强或抑制翻译调控基因表达，进而调控细胞膜生理和代谢。肉毒梭菌CspB和CspC在NaCl和乙醇耐受性中起重要作用；铜绿假单胞菌CapB表达响应温度和生长期的变化。
目前还没有冷休克蛋白CapB、CspA1和CspA2影响OMV释放耐受有机化合物的相关报道，而已知P.putida受有机化合物胁迫时，冷休克蛋白作为调节蛋白调控靶基因表达，从而上调OMV的释放，提高其耐受性，但是具体调控机制现在尚未明确报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，恶臭假单胞菌KT2440(P.putidaKT2440)为原始菌，确定菌株中冷休克蛋白基因的转录水平与有机物胁迫的相关性；还包括，
构建冷休克蛋白敲除菌株、过表达菌株以及回补菌株，检测冷休克蛋白在恶臭假单胞菌KT2440中对细胞生长状态以及OMW释放的影响；
检测添加有机化合物对恶臭假单胞菌KT2440细胞生长状态以及OMW释放的影响；
确定冷休克蛋白通过调控OMW的释放进而实现调控恶臭假单胞菌KT2440有机化合物耐受性的调控机制。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述冷休克蛋白包括CapB、CspA1、CspA2。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CapB敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-1和LR-1扩增目的基因上游同源臂获得片段1，利用引物RF-1和RR-1扩增目的基因下游同源臂获得片段2；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段1、片段2、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-1、引物LR-1、引物RF-1、引物RR-1、引物PKO-F、引物PKO-R的序列如SEQ ID NO:2～7所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CapB，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CapB敲除菌株。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CspA1敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-2和LR-2扩增目的基因上游同源臂获得片段4，序列如SEQ ID NO:8所示，利用引物RF-2和RR-2扩增目的基因下游同源臂获得片段5，序列如SEQ ID NO:9所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段4、片段5、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-2、引物LR-2、引物RF-2、引物RR-2的序列如SEQ IDNO:26～29所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CspA1，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CspA1敲除菌株。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CspA2敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-3和LR-3扩增目的基因上游同源臂获得片段6，序列如SEQ ID NO:10所示，利用引物RF-3和RR-3扩增目的基因下游同源臂获得片段7，序列如SEQ ID NO:11所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段6、片段7、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-3、引物LR-3、引物RF-3、引物RR-3的序列如SEQ IDNO:30～33所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CspA2，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CspA2敲除菌株。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CapB过表达菌株，包括，
设计引物CapB-F、CapB-R通过PCR将CapB基因编码区(228bp)即得到目的片段8，序列如SEQ ID NO:12所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRp TRC-linear-R，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段8和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F1和JUNP-R1进行PCR验证，即得到CapB过表达菌株；
其中，所述CapB-F、CapB-R、pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R、JUNP-F和JUNP-R的序列如SEQ ID NO:14～19所示。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CspA1过表达菌株，包括，
设计引物CspA1-F、CspA1-R通过PCR得到CspA1基因片段(210bp)即目的片段10，序列如SEQ ID NO:20所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRp TRC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段10和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F2和JUNP-R2进行PCR验证，即得到CspA1过表达菌株；
其中，所述CspA1-F、CspA1-R、JUNP-F2和JUNP-R2的序列如SEQ IDNO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CspA2过表达菌株，包括，
设计引物CspA2-F、CspA2-R通过PCR得到CspA2基因片段(213bp)，即目的片段11，序列如SEQ ID NO:21所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRp TRC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段11和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F3和JUNP-R3进行PCR验证，即得到CspA1过表达菌株；
其中，所述CspA2-F、CspA2-R、JUNP-F3和JUNP-R3的序列如SEQ IDNO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述构建回补菌株包括构建CapB敲除菌株的回补菌株，包括，
将pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒通过电击转化转入CapB敲除菌株感受态中，培养过夜挑取单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F1和JUNP-R2进行PCR验证，即可得到CapB敲除菌株的回补菌株。
作为本发明所述恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法的一种优选方案，其中：所述调控机制包括，冷休克蛋白作为一种调控蛋白作用于细胞，通过调节细胞释放OMW进而影响细胞对有机化合物的耐受性。
本发明有益效果：
(1)本发明以P.putida KT2440为原始菌，构建得到敲除菌ΔCapB和过表达菌株CapB，构建敲除菌ΔCspA1和过表达菌株CspA1，构建敲除菌ΔCspA2和过表达菌株CspA2。
(2)通过本发明研究方法，证明了冷休克蛋白作为一种调控蛋白作用于细胞，通过调控细胞释放OMV进而影响细胞对有机化合物的耐受性。
(3)本发明研究方法还证明了冷休克蛋白作用于细胞影响其对有机化合物的耐受性具有普适性，这一发现对优化底盘细胞调控网络从而提高生物合成有机化合物的效益意义重大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例4中不同冷休克蛋白的转录水平表达结果图。
图2为本发明实施例5中7种菌株细胞生长曲线图。
图3为本发明实施例5中7种菌株的生长状态、提取OMV蛋白浓度、单位OD下的OMV蛋白浓度及SDS-PAGE结果图。
图4为本发明实施例6中3种菌株的生长状态、提取OMV蛋白浓度、单位OD下的OMV蛋白浓度结果图。
图5为本发明实施例7中4种菌株的生长状态、提取OMV蛋白浓度、单位OD下的OMV蛋白浓度及SDS-PAGE结果图
图6为本发明实施例8中4种菌株添加不同有机化合物的生长曲线结果图。
图7为本发明实施例8中3种菌株添加不同有机化合物的半抑制浓度结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
以P.putida KT2440为原始菌，构建敲除菌ΔCapB、ΔCspA1、ΔCspA2。
本实施例的目的是获取敲除菌株进而验证基因CapB、CspA1和CspA2下调OMV的释放，其步骤如下：
基因敲除是利用pKl8mobsacB系统完成的，以P.putida KT2440基因组作为模板，利用引物LF-1和LR-1扩增目的基因上游同源臂(Up)即片段1，以引物RF-1和RR-1扩增目的基因下游同源臂(Down)即片段2；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R利用PCR技术得到PK18线性载体即片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段1、片段2和片段3在摩尔比例为3：3：1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间1h；
连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子，其中引物LF-1和LR-1、引物RF-1和RR-1、引物PKO-F和PKO-R的序列如SEQ ID NO:2～7所示；
挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到PK18-CapB质粒，将敲除质粒电击转化P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(LF-1和RR-1)进行PCR验证，验证为两条带的即为单交换菌株；
挑取单交换菌株5mL LB液体培养基30℃培养16h，菌液划线到包含有10％蔗糖的LB固体培养，30℃培养12-24h。挑取单菌落进行抗性筛选验(分子影印)，在无抗平板上生长而卡那抗性平板不生长的菌落初步视为阳性菌落；
将抗性筛选的阳性菌落进行PCR筛选，用敲除基因片段上的下游引物与上游同源臂的上游引物进行PCR扩增，无条带的即为CapB敲除菌株。
CspA1、CspA2敲除菌种方法同理：
CspA1利用引物LF-2和LR-2扩增目的基因上游同源臂(Up)即片段4，序列如SEQ IDNO:8所示；以引物RF-2和RR-2扩增目的基因下游同源臂(Down)即片段5，序列如SEQ ID NO:9所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R利用PCR技术得到PK18线性载体即片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段4、片段5和片段3在摩尔比例为3：3：1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间1h。连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子；其中，引物LF-2、引物LR-2、引物RF-2、引物RR-2的序列如SEQ ID NO:26～29所示；
挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到PK18-CapB质粒，将敲除质粒电击转化P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(LF-1和RR-1)进行PCR验证，验证为两条带的即为单交换菌株；
挑取单交换菌株5mL LB液体培养基30℃培养16h，菌液划线到包含有10％蔗糖的LB固体培养，30℃培养12-24h。挑取单菌落进行抗性筛选验(分子影印)，在无抗平板上生长而卡那抗性平板不生长的菌落初步视为阳性菌落；
将抗性筛选的阳性菌落进行PCR筛选，用敲除基因片段上的下游引物与上游同源臂的上游引物进行PCR扩增，无条带的即为CspA1敲除菌株。
CspA2利用引物LF-3和LR-3扩增目的基因上游同源臂(Up)即片段6，序列如SEQ IDNO:10所示；以引物RF-3和RR-3扩增目的基因下游同源臂(Down)即片段7，序列如SEQ IDNO:11所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R利用PCR技术得到PK18线性载体即片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段6、片段7和片段3在摩尔比例为3：3：1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间1h。连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子；其中，引物LF-3、引物LR-3、引物RF-3、引物RR-3的序列如SEQ ID NO:30～33所示；
挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到PK18-CapB质粒，将敲除质粒电击转化P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(LF-1和RR-1)进行PCR验证，验证为两条带的即为单交换菌株；
挑取单交换菌株5mL LB液体培养基30℃培养16h，菌液划线到包含有10％蔗糖的LB固体培养，30℃培养12-24h。挑取单菌落进行抗性筛选验(分子影印)，在无抗平板上生长而卡那抗性平板不生长的菌落初步视为阳性菌落；
将抗性筛选的阳性菌落进行PCR筛选，用敲除基因片段上的下游引物与上游同源臂的上游引物进行PCR扩增，无条带的即为CspA2敲除菌株。
以上引物均为金唯智公司设计，其中，PCR反应体系如表1所示，Gibson组装体系如表2所示。
表1PCR反应体系
表2组装体系
实施例2
以P.putida KT2440为原始菌，构建过表达菌CapB、CspA1、CspA2。
本实施例的目的是获取过表达菌株验证基因CapB、CspA1和CspA2上调OMV的释放，其步骤如下：
设计引物CapB-F、CapB-R通过PCR得到CapB基因编码区(228bp)，即目的片段8，序列如SEQ ID NO:12所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段8和片段9在摩尔比例为3:1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间30min；其中，CapB-F、CapB-R、pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R的序列如SEQ IDNO:14～17所示；
连接组装产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子，挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37摄氏度过夜培养，提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒；
进而将提取后的质粒通过电击转化进P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(JUNP-F1和JUNP-R1)进行PCR验证，即得到CapB过表达菌株，其中，JUNP-F1和JUNP-R1的序列如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19所示。
CspA1、CspA2过表达质粒构建同理：
设计引物CspA1-F、CspA1-R通过PCR得到CspA1基因片段(210bp)，即目的片段10，序列如SEQ ID NO:20所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段10和片段9在摩尔比例为3:1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间30min；其中，CspA1-F、CspA1-R、JUNP-F2和JUNP-R2的序列如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示；
连接组装产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子，挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37摄氏度过夜培养，提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CspA1质粒；
进而将提取后的质粒通过电击转化进P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(JUNP-F2和JUNP-R2)进行PCR验证，即得到CspA1过表达菌株。
设计引物CspA2-F、CspA2-R通过PCR，得到CspA2基因片段(213bp)即目的片段11，序列如SEQ ID NO:21所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SEQ ID NO:13所示；
片段11和片段9在摩尔比例为3:1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间30min；其中，CspA2-F、CspA2-R、JUNP-F3和JUNP-R3的序列如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示；
连接组装产物转化大肠杆菌JM109，涂布LB(Kan)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子，挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LB液体培养基中37摄氏度过夜培养，提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CspA2质粒；
进而将提取后的质粒通过电击转化进P.putida KT2440感受态细胞中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜，挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(JUNP-F3和JUNP-R3)进行PCR验证，即得到CspA2过表达菌株。
以上引物均为金唯智公司设计，其中，PCR反应体系如表3所示，Gibson组装体系如表4所示
表3PCR反应体系
表4组装体系
实施例3
本实施例的目的是构建CapB敲除菌株的回补菌株验证基因CapB上调OMV的释放，其步骤如下：
制作CapB敲除菌株感受态，将pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒通过电击转化转入CapB敲除菌株感受态中，恢复培养后感受态细胞均匀涂布于卡那霉素(50ug/mL)的LB固体培养基，30℃培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物(JUNP-F1和JUNP-R1)进行PCR验证，即可得到回补菌株。
实施例4
本实施例用以检测冷休克蛋白的转录水平与紫苏醇(有机化合物)的胁迫是否具有相关性。
将分别含有CapB、CspA1、CspA2基因的这3个不同菌株的各六个菌落接种到5mLLB培养基中，在30℃下培养作为种子液。
转接在10mL密封小瓶中，当OD600达到0.6～0.8后，向每个菌的三个菌落添加15mM紫苏醇，剩余三个作为对照，30℃培养24h后通过实验室离心机在4℃，6000rpm，10min条件下离心，收集菌体，提取RNA，测定RT-PCR，结果如图1所示。
从图1结果可知，在添加15mM紫苏醇培养细胞时，过表达CapB、CspA1、CspA2这三种不同菌株相较于不添加紫苏醇的RNA转录水平发生改变，而过表达CapB菌株最为明显，其转录水平为原来的17.86倍，说明细胞受到有机化合物胁迫时，冷休克蛋白的转录水平发生改变，二者具有相关性。
实施例5
本实施例用以证明冷休克蛋白CapB、CspA1、CspA2在P.putidaKT2440中对细胞生长及OMV释放情况的影响
将原始菌株KT2440、敲除菌株△CapB、过表达菌株CapB、敲除菌株△CspA1、过表达菌株CspA1、敲除菌株△CspA2、过表达菌株CspA2这7个不同菌株的各三个菌落接种到5mLLB培养基中，在30℃下培养作为种子液；
转接在10mL密封小瓶中，同时添加15mM紫苏醇，30℃培养，每隔3小时取一次样品，用酶标仪或分光光度计检测细胞的生长(OD600)，绘制生长曲线，结果如图2所示。
根据图2生长曲线的结果，我们可以观察到细胞生长的总体趋势是一致的，且过表达CapB、CspA1、CspA2基因的菌株生长状态均好于野生菌株，而敲除菌株CapB、CspA1、CspA2基因的菌株生长状态均低于野生菌株，而有机化合物作为毒性会抑制细菌的生长，但在过表达菌株中细菌的生长仍然高于野生型，说明冷休克蛋白会调控有机化合物的毒性，进而影响细胞的生长状态。
进一步的，将种子液转接在50mL密封小瓶中，同时添加15mM紫苏醇，30℃培养24h，24小时后，通过实验室离心机在4℃，6000rpm，10min条件下离心，收集上清；将上清液过0.45μm膜去除杂质，而后在4℃，100000×g，3h条件下离心，收集OMV，利用SDS-PAGE和BCA法(参照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书)检测OMV中蛋白浓度定量OMV的产量，结果如图3所示。
根据图3的OD600结果可知，过表达CapB、CspA1、CspA2基因的菌株生长状态均好于野生菌株，而敲除菌株CapB、CspA1、CspA2基因的菌株生长状态均低于野生菌株；其蛋白浓度及SDS-PAGE的结果与OD600是一致的，说明冷休克蛋白会通过调节OMV的释放进而影响细胞的生长状态。
实施例6
本实施例用以证明有机化合物影响P.putidaKT2440细胞生长状态并调控细胞产生OMV，进而影响细胞对有机化合物的耐受性。
将原始菌株KT2440、敲除菌株△CapB、过表达菌株CapB三个不同菌株的各三个菌落接种到5mL LB培养基中，在30℃下培养作为种子液。
转接在50mL密封小瓶中，分别添加0、5、15mM紫苏醇，30℃培养24h。
24小时后，通过实验室离心机在4℃，6000rpm，10min条件下离心，收集上清。将上清液过0.45μm膜去除杂质，而后在4℃，100000×g，3h条件下离心，收集OMV，利用BCA法(参照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书)检测OMV中蛋白浓度定量OMV的产量，结果如图4所示。
从图4可以看出，添加不同浓度(0、5、15mM)的紫苏醇培养细胞，随着紫苏醇浓度的升高，无论是野生菌株还是过表达、敲除菌株的OD都是降低的，而OMV的蛋白浓度是与紫苏醇的浓度显著正相关的，在野生型(WT)菌株里，紫苏醇添加浓度为15mM时，其OMV的蛋白浓度为原来的3.26倍。在过表达CapB菌株并且添加了15mM紫苏醇培养的情况下将OMV的产量提高到了野生型(WT)的289％，说明不同浓度的紫苏醇均对细胞生长有影响，而CapB的表达提高了细胞对有机化合物的耐受性。
实施例7
本实施例用以证明冷休克蛋白CapB对细胞生长的影响以及OMV释放情况、进而调控有机化合物耐受性。
将原始菌株KT2440、敲除菌株△CapB、过表达菌株CapB以及回补菌株△CapB/CapB四个不同菌株的各三个菌落接种到5mL LB培养基中，在30℃下培养作为种子液。
转接在50mL密封小瓶中，同时添加15mM紫苏醇，30℃培养24h。
24小时后，通过实验室离心机在4℃，6000rpm，10min条件下离心，收集上清。将上清液过0.45μm膜去除杂质，而后在4℃，100000×g，3h条件下离心，收集OMV，利用SDS-PAGE和BCA法(参照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书)检测OMV中蛋白浓度定量OMV的产量，结果如图5所示。
本实施例添加了回补菌株进行验证，而从图5结果可以得知，无论是OD还是OMV中的蛋白浓度均与之前的实验结果一致，且回补菌株的OD及OMV蛋白浓度也相较于敲除菌株上升，说明冷休克蛋白CapB确实影响细胞的生长，间接说明其促进细胞对有机化合物的耐受性。
实施例8
本实施例用以证明冷休克蛋白CapB对在P.putidaKT2440中添加不同有机化合物影响细胞生长状态及半抑制浓度，且对于有机化合物具有普适性。
将原始菌株KT2440、敲除菌株△CapB、过表达菌株CapB、回补菌株△CapB/CapB四个不同菌株的各三个菌落接种到5mLLB养基中，在30℃下培养作为种子液。
转接在10mL密封小瓶中，三种不同菌株在LB培养基种各分别添加15mM紫苏醇(Perilla alcohol，POH)、柠檬烯(Limonene)、甲苯(methylbenzene；Toluene，PhMe)、乙醇(ethanol)，30℃培养，每隔3小时取一次样品，用酶标仪或分光光度计检测细胞的生长(OD600)，并绘制生长曲线，结果如图6所示。
从图6结果可以看出，无论添加哪一种有机化合物，在冷休克蛋白CapB的培养下其细菌的生长趋势均是一致的，过表达CapB基因的菌株生长状态均好于野生菌株，而敲除菌株CapB基因的菌株生长状态均低于野生菌株，只不过是不同的有机化合物对细胞的抑制程度不同。
分别用含0、1、5、15、30和60mM紫苏醇、柠檬烯、甲苯、乙醇的LB培养基分别培养原始菌KT2440、敲除菌ΔCapB、过表达菌株CapB和回补菌株ΔCapB/CapB，用酶标仪或分光光度计检测细胞的生长(OD600)，用各添加紫苏醇的OD比不添加紫苏醇的OD计算结合率，绘制生长曲线、紫苏醇浓度对结合率的曲线，当结合率为50％时对应的紫苏醇浓度为半抑制浓度，结果如图7所示。
从图7结果可以看出，冷休克蛋白CapB敲除菌株的半抑制浓度相较于野生菌株是降低的，而回补菌株的半抑制浓度又上升，说明冷休克蛋白CapB对细胞的生长是有影响的。
本发明以P.putida KT2440为原始菌，构建得到敲除菌ΔCapB和过表达菌株CapB，构建敲除菌ΔCspA1和过表达菌株CspA1，构建敲除菌ΔCspA2和过表达菌株CspA2，证明了冷休克蛋白作为一种调控蛋白作用于细胞，通过调控细胞释放OMV进而影响细胞对有机化合物的耐受性，还证明了冷休克蛋白作用于细胞影响其对有机化合物的耐受性具有普适性，这一发现对优化底盘细胞调控网络从而提高生物合成有机化合物的效益意义重大。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：包括，恶臭假单胞菌KT2440(P.putidaKT2440)为原始菌，确定菌株中冷休克蛋白基因的转录水平与有机物胁迫的相关性；还包括，
构建冷休克蛋白敲除菌株、过表达菌株以及回补菌株，检测冷休克蛋白在恶臭假单胞菌KT2440中对细胞生长状态以及OMW释放的影响；
检测添加有机化合物对恶臭假单胞菌KT2440细胞生长状态以及OMW释放的影响；
确定冷休克蛋白通过调控OMW的释放进而实现调控恶臭假单胞菌KT2440有机化合物耐受性的调控机制。
2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述冷休克蛋白包括CapB、CspA1、CspA2。
3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CapB敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-1和LR-1扩增目的基因上游同源臂获得片段1，利用引物RF-1和RR-1扩增目的基因下游同源臂获得片段2；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段1、片段2、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-1、引物LR-1、引物RF-1、引物RR-1、引物PKO-F、引物PKO-R的序列如SEQ ID NO:2～7所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CapB，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CapB敲除菌株。
4.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CspA1敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-2和LR-2扩增目的基因上游同源臂获得片段4，序列如SEQ ID NO:8所示，利用引物RF-2和RR-2扩增目的基因下游同源臂获得片段5，序列如SEQ ID NO:9所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段4、片段5、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-2、引物LR-2、引物RF-2、引物RR-2的序列如SEQ IDNO:26～29所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CspA1，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CspA1敲除菌株。
5.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白敲除菌株包括构建CspA2敲除菌株，
以P.putidaKT2440基因组作为模板，利用引物LF-3和LR-3扩增目的基因上游同源臂获得片段6，序列如SEQ ID NO:10所示，利用引物RF-3和RR-3扩增目的基因下游同源臂获得片段7，序列如SEQ ID NO:11所示；
将两段片段与pK18载体连接，以引物PKO-F和PKO-R通过PCR技术得到PK18线性载体片段3，序列如SEQ ID NO:1所示；
片段6、片段7、片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
其中，所述引物LF-3、引物LR-3、引物RF-3、引物RR-3的序列如SEQ IDNO:30～33所示；
转化子单菌落于培养基中过夜培养，提取质粒，即得到敲除质粒PK18-CspA2，电击转化至P.putidaKT2440感受态细胞中；
恢复培养后进行抗性筛选，筛选得到的阳性菌落再进行PCR筛选，最终得到CspA2敲除菌株。
6.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CapB过表达菌株，包括，
设计引物CapB-F、CapB-R通过PCR得到CapB基因片段(228bp)，即目的片段8，序列如SEQID NO:12所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpT RC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SE Q ID NO:13所示；
片段8和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F和JUNP-R进行PCR验证，即得到Ca pB过表达菌株；
其中，所述CapB-F、CapB-R、pBBRpTRC-linear-F、pBBRpTRC-linear-R、JUNP-F1和JUNP-R1的序列如SEQ ID NO:14～19所示。
7.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CspA1过表达菌株，包括，
设计引物CspA1-F、CspA1-R通过PCR得到CspA1基因片段(210bp)即目的片段10，序列如SEQ ID NO:20所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpT RC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SE Q ID NO:13所示；
片段10和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F2和JUNP-R2进行PCR验证，即得到CspA1过表达菌株；
其中，所述CspA1-F、CspA1-R、JUNP-F2、JUNP-R2的序列如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35所示。
8.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建冷休克蛋白过表达菌株包括构建CspA2过表达菌株，包括，
设计引物CspA2-F、CspA2-R通过PCR得到CspA2基因片段(213bp)，即目的片段11，序列如SEQ ID NO:21所示；
以质粒pbbr1mcs-2-ptrc99a为模板，通过引物pBBRpTRC-linear-F、pBBRpT RC-linear-R进行PCR处理，产物通过胶回收得到线性化载体片段9，序列如SE Q ID NO:13所示；
片段11和片段9进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，即可获得转化子；
转化子单菌落培养后提取质粒，即得到pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒，将质粒电击转化至P.putida KT2440感受态细胞中，培养过夜后挑取平板上的单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F3和JUNP-R3进行PCR验证，即得到CspA1过表达菌株；
其中，所述CspA2-F、CspA2-R、JUNP-F3和JUNP-R3的序列如SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37所示。
9.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述构建回补菌株包括构建CapB敲除菌株的回补菌株，
将pBBR1MCS-2-pTrc99a-CapB质粒通过电击转化转入CapB敲除菌株感受态中，培养过夜挑取单菌落，利用目的基因两端引物JUNP-F1和JUNP-R1进行PCR验证，即可得到CapB敲除菌株的回补菌株。
10.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌中冷休克蛋白调控有机化合物耐受性的研究方法，其特征在于：所述调控机制包括，冷休克蛋白作为一种调控蛋白作用于细胞，通过调节细胞释放OMW进而影响细胞对有机化合物的耐受性。
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