CN116286891A - 一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 - Google Patents
一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286891A CN116286891A CN202310186362.3A CN202310186362A CN116286891A CN 116286891 A CN116286891 A CN 116286891A CN 202310186362 A CN202310186362 A CN 202310186362A CN 116286891 A CN116286891 A CN 116286891A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scd5
- scd1
- gene
- pig
- porcine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 10
- 101100041818 Sus scrofa SCD gene Proteins 0.000 title abstract description 5
- 102100028897 Stearoyl-CoA desaturase Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 101150097713 SCD1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 101100041816 Homo sapiens SCD gene Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 101000639987 Homo sapiens Stearoyl-CoA desaturase 5 Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102100033930 Stearoyl-CoA desaturase 5 Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 101000631836 Sus scrofa Stearoyl-CoA desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 113
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 claims description 42
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 40
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 26
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 13
- 101150093807 SCD5 gene Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 4
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000009482 thermal adhesion granulation Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 101150048395 SCD gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011557 fetal akinesia deformation sequence 4 Diseases 0.000 description 1
- 208000012154 fetal akinesia deformation sequence syndrome 4 Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000006250 specific catalysis Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- -1 sterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Abstract
本发明提供了一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法，涉及生物医学技术领域。本发明从猪SCD1基因中分离出1个基因编辑靶位点，从猪SCD5基因中分离出2个基因编辑靶位点，均可应用于基因编辑。统计结果表明，以上位点的打靶效率分别为90％和82％。提供的猪SCD1和SCD5双基因编辑位点为对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员进行精确编辑提供了有效靶标，同时提供了一个猪SCD1和SCD5双基因突变的细胞模型，为脂质代谢及猪种肉质改良提供了可靠的研究材料，也为优良肉质猪品种的研究和开发提供了新策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法。
背景技术
基因编辑技术发展至今，已在动物基因功能研究及畜禽改良育种领域得到了广泛的应用。基因编辑主要是通过对目的基因进行修饰、敲除及插入进而影响其表达和功能，目前主要有锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术以及成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术，特别是CRISPR-Cas9基因编辑技术的发现和广泛的应用，使得在目标基因组中能够简单、高效地完成碱基的删除、插入和替换等修饰。相比于ZFNs和TALEN技术，CRISPR-Cas9系统的构建和使用更加便捷精准高效和更短周期更低成本，并且其具有同时对多个基因进行编辑修饰的巨大潜力。
脂肪沉积是指脂肪组织的形成过程，脂肪组织由成熟的脂肪细胞经过变大、增殖和聚集而形成。脂肪细胞的大部分空间被脂质液滴(Lipid droplets，LD)占据，LD是由甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)的疏水核心和胆固醇酯组成的脂肪储存细胞器，可以在几乎所有细胞中形成。在LD核心中，初级中性脂质是甾醇酯和TAG，其主要形式是TAG(Guo etal.,2009b)。LD包括脂肪酶、膜运输和结构蛋白的酶，参与脂质合成，通过含有各种蛋白质的磷脂单层将疏水核心与水性胞质溶胶分离。甘油三酯是含量最为丰富的一类脂肪，多为含16个或18个碳原子的饱和脂肪酸(SFAs)及不饱和脂肪酸(UFAs)，SFAs与UFAs尤其是硬脂酸与油酸的不同比例能调节细胞膜流动性和信号转导，进而影响细胞的生长和分化。
哺乳动物硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是一种普遍表达的脂肪酸Δ9去饱和酶，是SFA转化为MUFA的一种限速酶。现已鉴别出5种SCD亚型，但在猪上，目前只发现SCD1及SCD5亚型，且这2个亚型具有66.3％的核酸相似度和61.7％的氨基酸相似度，均显示出相似的Δ9去饱和酶活性，特别是其特异性催化16：0和18：0形成16：1和18：1，是一个脂肪酸代谢控制的重要靶点。SCD介导的这两种脂肪酸代谢的紊乱与人类的几种常见疾病有关，包括肥胖、糖尿病、脂肪肝以及心血管和肿瘤疾病(Richard et al.,2009)。且研究表明SCD缺失的小鼠能够抵抗高碳水和高脂饲粮导致的肥胖和脂肪酸变性(Ntmabi et al.,2002)。
猪SCD1基因位于14号染色体上，包含6个外显子，编码359个氨基酸。主要在脂肪组织、大脑、肝脏和肌肉组织中表达，可作为肌内脂肪沉积的潜在生物标志物，其基因标记可用于选择猪肉的最佳脂肪酸谱。SCD5也叫ACOD4、FADS4，猪SCD5基因位于8号染色体上，包含5个外显子，编码332个氨基酸。在大脑、肾脏和肌肉组织中表达，现已被证明在脂肪酸组成和脂肪沉积中发挥重要作用(Ren et al.,2020)。
虽然已有研究针对SCD1和SCD5之间的补偿效应进行了部分探讨，但均仅仅局限于单个基因成员的功能研究，仍然缺乏对其基因家族整体生物学功能作用的揭示，且由于SCD5目前被发现仅存在于包括人类在内的几种脊椎动物中，导致对其的研究受到较大的限制，现有研究不足以阐述完全其具体功能作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法，构建SCD1和SCD5双基因突变的细胞模型，为脂质代谢及猪种肉质改良提供研究材料和方法。
本发明提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，以猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点作为标靶，所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
优选的，所述SCD1的编辑位点包括SEQ ID No.1所示的序列；
所述SCD5的编辑位点包括SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的序列。
本发明提供了一组针对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点设计的sgRNA，包括针对SCD1设计的sgRNA1-F和sgRNA1-R，所述sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
针对SCD5设计的sgRNA2-F、sgRNA2-R、sgRNA3-F和sgRNA3-R，所述sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述sgRNA3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述sgRNA3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
本发明还提供了一组制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的Cas9gRNA表达载体，所述Cas9gRNA表达载体分别含有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
优选的，以pSpCas9(BB)-2A-Puro载体为骨架。
本发明还提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系的方法，包括以下步骤：(1)将上述sgRNA中的sgRNA1-F和sgRNA1-R、sgRNA2-F和sgRNA2-R以及sgRNA3-F和sgRNA3-R分别退火后，连接进线性化的pSpCas9(BB)-2A-Puro载体中，得Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3；
(2)分别将Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，分别提取质粒；
(3)将步骤(2)提取得到的三种质粒混合后共转染猪体细胞，筛选阳性细胞得到所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
优选的，步骤(3)所述猪体细胞包括猪肾上皮细胞。
本发明还提供了利用上述方法构建得到的猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
优选的，所述突变包括缺失和/或插入。
本发明还提供了利用上述sgRNA或上述Cas9gRNA表达载体或上述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系在培育改良动物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，并具体公开了猪基因组中猪哺乳动物硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5基因编辑位点及其应用。本发明从猪SCD1基因中分离出1个基因编辑靶位点，从猪SCD5基因中分离出2个基因编辑靶位点，以上位点均位于基因编码区1号外显子，均能被Cas9核酸内切酶特异性识别，从而介导双链断裂，在自我修复系统的作用下通过非同源末端连接的方式使基因发生突变。统计结果表明，以上位点的打靶效率分别为90％和82％。提供的猪SCD1和SCD5双基因编辑位点为对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员进行精确编辑提供了有效靶标，同时提供了一个猪SCD1和SCD5双基因突变的细胞模型，为脂质代谢及猪种肉质改良提供了可靠的研究材料，也为优良肉质猪品种的研究和开发提供了新策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基因编辑靶位点在SCD1与SCD5基因上的示意图，SCD1基因为一个sgRNA引导的单位点定点编辑，SCD5基因为两个sgRNA引导的双位点定点编辑；
图2为包含sgRNA在PX459质粒中的插入位点在内的部分PX459质粒元件示意图，BbsI为线性化酶切位点；
图3为PX459质粒线性化电泳图；
图4为重组质粒测序检测结果图；
图5为单克隆细胞系SCD1和SCD5基因PCR电泳图，图中1、2、3均为单克隆细胞系；SCD1基因PCR电泳图中M为DL100 bp DNAMarker，4为空白对照，5为阳性对照；SCD5基因PCR电泳图中M为DL2000bp DNAMarker，4、5为杂合子阳性对照，6为空白对照；
图6为单克隆细胞系SCD1基因突变位点测序图；
图7为单克隆细胞系SCD5基因突变位点测序图；
图8为单克隆细胞系PCR检测电泳图，图中为部分单克隆细胞系SCD1和SCD5基因PCR检测电泳图，图中M为DL100 bp DNAMarker，数字代表不同单克隆细胞系。
具体实施方式
本发明提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，以猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点作为标靶，所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
本发明所述猪SCD1和SCD5双基因编辑位点，优选为三段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，第一段序列为：5’-AAGTAATGGCCCCCAGACCGCGG-3’(SEQ ID No.1)，该位点在猪基因组的准确定位是14号染色体SCD1基因(NC_010456.5)的462～484处，染色体的坐标为111462022～111462044，位于SCD1基因第一外显子(图1)。第二段序列为：5’-CTTAGGCCACGGTGAACGCCTGG-3’(SEQ ID No.2)，该位点在猪基因组的准确定位是8号染色体SCD5基因(NC_010450.4)的12～34处，染色体的坐标为135507358～135507380(图1)。第三段序列为：5’-CGCGGCAGGACATCGTCTGGAGG-3’(SEQ ID No.3)，该位点在猪基因组的准确定位是8号染色体SCD5基因的323～345处，染色体的坐标为135507669-135507691(图1)。第二和第三段序列均位于SCD5基因第一外显子。本发明所称猪基因组的版本号优选为NCBI:txid9823。
本发明提供了一组针对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点设计的sgRNA，包括针对SCD1设计的sgRNA1-F和sgRNA1-R，所述sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
针对SCD5设计的sgRNA2-F、sgRNA2-R、sgRNA3-F和sgRNA3-R，所述sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述sgRNA3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述sgRNA3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
本发明优选在上述三个编辑靶位点(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)对应的sgRNA(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3)互补序列有义链5’端添加CACCG，模板链5’端添加AAAC酶切位点，使寡核苷酸链与载体质粒黏性末端互补，从而得到每个编辑靶位点对应的sgRNA序列，如表1所示。
表1 oligo序列
本发明还提供了一组制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的Cas9gRNA表达载体，所述Cas9gRNA表达载体分别含有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
本发明优选以pSpCas9(BB)-2A-Puro(简称PX459)载体为骨架，分别构建插入有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶家族(SCD)成员SCD1和SCD5编辑靶位点的Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2与PX459-SCD5-sgRNA3。
本发明对所述Cas9gRNA表达载体的构建方法并没有特殊限定，优选包括将上述sgRNA中的sgRNA1-F和sgRNA1-R、sgRNA2-F和sgRNA2-R以及sgRNA3-F和sgRNA3-R分别退火后，连接进线性化的pSpCas9(BB)-2A-Puro载体中，得Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3。本发明优选分别将sgRNA对混合后进行退火，而后插入到线性化的PX459载体中，所述线性化优选包括利用BbsⅠ酶对所述PX459载体进行酶切。
本发明还提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系的方法，包括以下步骤：(1)将上述sgRNA中的sgRNA1-F和sgRNA1-R、sgRNA2-F和sgRNA2-R以及sgRNA3-F和sgRNA3-R分别退火后，连接进线性化的pSpCas9(BB)-2A-Puro载体中，得Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3；
(2)分别将Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，分别提取质粒；
(3)将步骤(2)提取得到的三种质粒混合后共转染猪体细胞，筛选阳性细胞得到所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
本发明步骤(1)中内容与上述Cas9gRNA表达载体的构建方法相同，在此不再赘述。
得Cas9gRNA表达载体后，本发明分别将Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，分别提取质粒。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，优选包括热激法，并在所述转化后进行复苏，并在含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上培养，挑选单克隆至含有Amp的LB培养基中继续培养，将菌液送公司用U6引物进行测序检测，将测序正确的阳性单克隆进行扩大培养，并提取质粒。
得质粒后，本发明将步骤(2)提取得到的三种质粒混合后共转染猪体细胞，筛选阳性细胞得到所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
本发明三种质粒的比例优选为1：1：1(每100μL体系总浓度为10μg)。本发明所述转染的方法优选包括电穿孔法。本发明对所述猪体细胞的类型并没有特殊限定，实施例中采用猪肾上皮细胞(PK-15)进行实验，但是不能将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了利用上述方法构建得到的猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
本发明所述突变优选包括缺失和/或插入。在本发明实施例中，利用上述技术方案，从92个阳性单克隆细胞系中随机选择50个细胞系进行检测，其中23个细胞系的SCD1基因缺失AGAC碱基，7个细胞系的SCD1基因缺失CCGCGGG碱基，另有15个细胞系的SCD1基因出现增加碱基A、CC或杂峰等，经统计，共有45个细胞系的SCD1基因发生碱基编辑，编辑效率达到90％。在上述50个单克隆细胞系中共有41个细胞系的SCD5基因发生碱基编辑，编辑效率为82％，其中纯合细胞系27个，且均在设计的靶位点处出现剪切，实现了两条sgRNA引导的基因定点缺失。在50个单克隆细胞系中共38个细胞的SCD1与SCD5基因均发生碱基编辑，双基因编辑效率达到76％，其中3个克隆为纯合有效双基因缺失细胞系。
本发明还提供了利用上述sgRNA或上述Cas9gRNA表达载体或上述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系在培育改良动物中的应用。
利用本发明所述的双基因突变技术，为脂质代谢及猪种肉质改良提供了可靠的手段和素材，对于畜牧优良经济性状的研究和优质猪肉品种的选育具有十分重要的作用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
分别插入有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶家族(SCD)成员SCD1和SCD5编辑靶位点的Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3的构建
(1)主要试剂和材料来源
pSpCas9(BB)-2A-Puro载体质粒由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存；单核苷酸链、试验所用引物及DH5α感受态细胞，购自上海生工有限公司。BbsI限制性内切酶购自Fermentas。重组载体按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
Cas9gRNA表达载体是以PX459载体为骨架，然后按照固定的oligo设计模式插入所需的引导序列即可。引导序列及测序引物如表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用灭菌后的ddH2O稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
对应三个编辑靶位点(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)设计sgRNA(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3)，并在两条互补序列的有义链5’端添加CACCG，模板链5’端添加AAAC酶切位点，使寡核苷酸链与载体质粒黏性末端互补。将上述寡核苷酸链送公司合成。
将合成的sgRNA样品稀释为10μmol/L工作液，配制20μL体系：10×NEB Buffer 2μL、oligo sgRNA F 2μL、oligo sgRNA R 2μL和ddH2O 14μL。混匀并简短离心后于95℃反应5min，室温下自然退火。
将图2所示PX459质粒用BbsⅠ酶进行酶切，配制20μL体系：10×FD Buffer 2μL、BbsI(10U/μL)2μL、PX459质粒(1000ng/μL)2μL和ddH2O 14μL。于37℃酶切40min进行线性化，琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度为1％，电泳电压为120V，时间为35min)后回收目的片段，结果如图3所示，酶切后条带大小正确。
分别将退火产物与酶切产物配制20μL体系：2×Solution I 10μL、PX459酶切产物(50ng/μL)2μL、退火产物(2μmol/L)5μL和ddH2O 3μL。于37℃连接2h。
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，将10μL连接产物和10μL DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激90s后立即置于冰上静置2min；
加入1mL无抗LB培养基，于恒温摇床37℃，200rpm/min复苏45min；
在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心1min，将菌体沉淀下来，然后去除900μL LB培养基；将剩余的100μL样品悬浮混匀后涂布在含有氨苄青霉素(100ng/mlAmp)的LB平板上，置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养16h。
挑取单克隆至含有100ng/mlAmp的LB培养基中继续培养，将菌液送公司用U6引物(引物序列见表1)进行测序检测。测序结果如图4所示，3对sgRNA均按预期整合在PX459相应位点，PX459-SCD1-sgRNA1测序图对应表1中sgRNA1-R，PX459-SCD5-sgRNA2测序图对应表1中sgRNA2-R，PX459-SCD5-sgRNA3测序图对应表1中sgRNA3-R。
实施例2
电穿孔转染后猪转基因细胞系的筛选
(1)主要试剂和材料来源
野生型PK-15(猪肾上皮细胞)由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存；胎牛血清和DMEM高糖培养基，购自Gibco公司。抗生素购自Sigma。DMSO购自Invitrogen。电转缓冲液实验室自行配制。BTX2001细胞电融合仪购自美国BTX公司。
(2)操作步骤
细胞铺板：
将PK15细胞接种于细胞培养六孔板，在进行电穿孔转染前使其生长密度达到80％左右。
消化细胞：
待细胞生长汇合至约80％且形态良好时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞(正常细胞培养六孔板一般按照200μL～500μL/孔的0.25％胰酶进行消化，在显微镜下观察待细胞变圆脱离接触且部分细胞出现脱落悬浮时，立即加入含有血清的培养基终止消化)，反复吹打使贴壁细胞完全脱离下来并分散成单个细胞。
收集、漂洗细胞
将消化并吹散后的细胞悬液收集至1.5mL无菌离心管中，用DPBS重悬漂洗细胞，1500rpm离心3min，弃上清，加入电转缓冲液(KCl 120mM、CaCl20.15mM、Hepes 25mM、EDTA2mM、无水MgCl25mM和K2HPO410mM，pH7.6)重悬润洗细胞，再次离心，1500rpm离心3min，弃上清。按照100μL体系(细胞量为1×106)中5μg重组质粒加入适量电转缓冲液，轻轻吹打重悬细胞，使其混合均匀。
电穿孔法转染细胞
在细胞消化时提前开启电转仪，并设置好电压、电击时间和脉冲次数等参数使其预运行。将细胞电转混合液转置合适大小的无菌洁净电转杯中，利用电穿孔法于220V/cm，3ms，一次脉冲，对细胞进行转染，电转完成后用含有12％FBS的DMEM培养基培养细胞。
细胞筛选及培养
电转后培养细胞48h，使其恢复正常生长状态，用含有2μg/mL Puromycin的12％FBS/DMEM筛选培养基培养并筛选细胞，每天更换新的筛选培养基，使细胞成为单个细胞，待经过筛选后的单个细胞增殖为细胞团后挑取单克隆并扩大培养。
实施例3
转基因纯合细胞系鉴定及打靶效率统计分析
(1)主要试剂与材料来源
PowerPol 2×PCR Mix购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；哺乳动物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；核酸浓度测定仪为美国Thermo公司产品。测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
检测阳性克隆SCD1的一对特异性引物为SCD1-F和SCD1-R，预期原始PCR产物的长度约为368bp，检测SCD5的一对特异性引物为SCD5-F和SCD5-R，预期原始PCR产物的长度约为473bp，缺失后条带为162bp。
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用灭菌后的ddH2O稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。
(2)操作步骤
按照天根生物公司的哺乳动物基因组DNA提取试剂盒说明书提取单克隆细胞系的基因组DNA，使用核酸浓度测定仪检测其浓度并进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，最后将浓度调整为500ng/μL备用以进行PCR检测。
25μLPCR反应体系：PowerPol 2×PCRMix 12.5μL、上游引物(10μmol/L)0.5μL、下游引物(10μmol/L)0.5μL、DNA模板(500ng/μL)和ddH2O 10.5μL。在冰上加入以上成分并充分混匀后，于PCR仪进行如下程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，32循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
将PCR反应产物取5μL于120V电压，2％琼脂糖凝胶中电泳30min，凝胶成像仪中观察其条带大小，结果如图5所示，条带大小符合预期，将余下产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，以确认基因编辑准确序列，结果如图6和图7所示，单克隆细胞系SCD1基因在预期位点发生基因编辑，产生多个突变型，分别为缺失CCGCGGG碱基共7bp、缺失AGAC碱基共4bp以及增加CC碱基和增加A碱基，均能造成移码突变，为有效编辑；单克隆细胞系中SCD5基因均在两个sgRNA引导的预设位点发生基因编辑，共缺失311bp，能造成移码突变，为有效编辑。
统计基因编辑效率：
待经过Puromycin筛选后的单个细胞系增殖为细胞团后挑取其单克隆并扩大培养(由48孔板至24孔再到12孔和六孔板)。待细胞传代至12孔板或24孔板时即可用胰酶消化后提取其基因组DNA进行PCR检测，剩下的部分细胞继续培养，若鉴定结果为阳性克隆则扩大培养并冻存细胞，若鉴定结果为阴性克隆则将其销毁。
结果如图8所示，实验中共挑选有92个单克隆细胞系，随机选择50个细胞系进行检测，其中23个细胞系的SCD1基因缺失AGAC碱基，7个细胞系的SCD1基因缺失CCGCGGG碱基，另有15个细胞系的SCD1基因出现增加碱基A、CC或杂峰等，经统计，共有45个细胞系的SCD1基因发生碱基编辑，编辑效率达到90％。在上述50个单克隆细胞系中共有41个细胞系的SCD5基因发生碱基编辑，编辑效率为82％，其中纯合细胞系27个，且均在设计的靶位点处出现剪切，实现了两条sgRNA引导的基因定点缺失。在50个单克隆细胞系中共38个细胞的SCD1与SCD5基因均发生碱基编辑，双基因编辑效率达到76％，其中3个克隆为有效双基因缺失细胞系。
表2打靶效率统计
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，其特征在于，以猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点作为标靶，所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述SCD1的编辑位点包括SEQ ID No.1所示的序列；
所述SCD5的编辑位点包括SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的序列。
3.一组针对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点设计的sgRNA，其特征在于，包括针对SCD1设计的sgRNA1-F和sgRNA1-R，所述sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
针对SCD5设计的sgRNA2-F、sgRNA2-R、sgRNA3-F和sgRNA3-R，所述sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述sgRNA3-F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述sgRNA3-R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
4.一组制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的Cas9gRNA表达载体，其特征在于，所述Cas9gRNA表达载体分别含有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点；
所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
5.根据权利要求4所述Cas9gRNA表达载体，其特征在于，以pSpCas9(BB)-2A-Puro载体为骨架。
6.一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求3所述sgRNA中的sgRNA1-F和sgRNA1-R、sgRNA2-F和sgRNA2-R以及sgRNA3-F和sgRNA3-R分别退火后，连接进线性化的pSpCas9(BB)-2A-Puro载体中，得Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3；
(2)分别将Cas9gRNA表达载体PX459-SCD1-sgRNA1、PX459-SCD5-sgRNA2和PX459-SCD5-sgRNA3转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，分别提取质粒；
(3)将步骤(2)提取得到的三种质粒混合后共转染猪体细胞，筛选阳性细胞得到所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(3)所述猪体细胞包括猪肾上皮细胞。
8.利用权利要求6或7所述方法构建得到的猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系。
9.根据权利要求8所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系，其特征在于，所述突变包括缺失和/或插入。
10.利用权利要求3所述sgRNA或权利要求4或5所述Cas9gRNA表达载体或权利要求8或9所述猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系在培育改良动物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310186362.3A CN116286891A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310186362.3A CN116286891A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286891A true CN116286891A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86837282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310186362.3A Pending CN116286891A (zh) | 2023-03-02 | 2023-03-02 | 一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286891A (zh) |
-
2023
- 2023-03-02 CN CN202310186362.3A patent/CN116286891A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106244557B (zh) | 定点突变ApoE基因与LDLR基因的方法 | |
| Zhang et al. | Comparison of gene editing efficiencies of CRISPR/Cas9 and TALEN for generation of MSTN knock-out cashmere goats | |
| CN111742051A (zh) | 延伸的单向导rna及其用途 | |
| CN106191113A (zh) | 一种mc3r基因敲除猪的制备方法 | |
| CN111778252B (zh) | 一种靶向敲除SST基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9系统和应用 | |
| CN113278619A (zh) | 双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法 | |
| Su et al. | Production of microhomologous-mediated site-specific integrated LacS gene cow using TALENs | |
| CN106148406B (zh) | 猪ApoE基因敲除载体及其构建方法与应用 | |
| CN106754949B (zh) | 猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用 | |
| CN106282230B (zh) | 定点突变ldlr基因的方法 | |
| CN108048487A (zh) | 一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的bmpr-ib基因方法 | |
| CN110938629B (zh) | 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品 | |
| CN106244556B (zh) | 定点突变ApoE基因的方法 | |
| CN113005141A (zh) | 高活性突变体构成的基因编辑工具及制备方法和修复先天性视网膜劈裂症致病基因的方法 | |
| CN116286891A (zh) | 一种猪scd基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法 | |
| CN110862988A (zh) | 一种sgRNA及其构建的CREBRF点图变型巴马香猪和应用 | |
| CN111549070B (zh) | 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法 | |
| CN111944810B (zh) | 靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用 | |
| CN110184302B (zh) | 一种sirt1基因敲除的ipec-j2细胞系的构建方法 | |
| CN114891791B (zh) | 特异性靶向犬Rosa26基因的sgRNA及其应用 | |
| CN113667674B (zh) | 一种靶向切除猪cd164基因编码区dna的成对编辑位点、使用方法及其应用 | |
| CN109576267A (zh) | 一种用于单碱基编辑的gRNA、载体、细胞及其制备方法 | |
| CN114891786B (zh) | 犬Rosa26基因及其应用 | |
| WO2024032398A1 (zh) | 特异性提高乳铁蛋白基因表达量的方法及应用 | |
| CN116179543A (zh) | 基于CRISPR特异性靶向猪Cavin-1基因的sgRNA及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |