CN116286829A - 一种沉默调节蛋白2的适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种沉默调节蛋白2的适配体及其应用。该适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其解决了目前识别沉默调节蛋白2的抗体存在的稳定性较差、成本高的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体公开了一种沉默调节蛋白2的适配体及其应用。
背景技术
沉默调节蛋白2(Silent information regulator 2，SIRT2)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的去乙酰化酶Sirtuins相关蛋白家族的重要一员，其通过去乙酰化底物的方式参与调控细胞增殖与凋亡、DNA损伤、炎症反应等多种生物学过程。建立细胞中SIRT2蛋白的快速且成本低廉的检测方法，对于研究其在相关生物学过程中的具体作用具有重要意义。
目前，SIRT2的检测方法主要有基于抗原抗体相互作用原理的免疫荧光法、蛋白质免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等，但抗体存在易受温度和pH的影响、稳定性较差、易失活变性、生产成本高等缺点。目前，尚缺乏针对SIRT2的快速、经济的检测方法。
核酸适配体(Aptamer)，简称适配体、适配子，是经过体外反复筛选得到能与靶标分子高亲和力、高特异性结合的特定核酸序列，其本质是单链脱氧核酸或核糖核酸(DNA/RNA)，碱基长度一般为10～80nt。适配体可通过指数富集的配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)方法筛选得到。适配体具有特定的三维结构，核苷酸之间主要通过氢键、范德华力、静电作用、芳香基团与碱基之间的堆叠、疏水亲脂等作用形成包括发夹结构、茎环结构、三链杂交和G四聚体等特定的结构，进而与相应靶标结合并相互作用，影响靶标的结构与功能。几乎所有己报道的适配体都对靶标具有高亲和性，其解离常数(Kd值)一般在微摩尔至纳摩尔范围内，因此适配体也被称为“化学抗体”。适配体具有亲和力强、特异性好、低免疫原性、成本低、稳定性好等优点。因此，适配体在食品和环境安全检测、医学生物检测、肿瘤诊断及靶向治疗等多个领域有着广阔的应用前景，基于适配体的荧光探针或生物传感器检测方法因其能有效弥补常规蛋白检测方法的不足而备受关注。
但是，已筛选出的可有效使用的蛋白适配体非常有限，靶标蛋白的检测对象主要集中于凝血酶、甲胎蛋白、癌胚抗原等与疾病诊断相关的少数几个靶标，目前，尚无SIRT2适配体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种沉默调节蛋白2的适配体，其解决了目前识别沉默调节蛋白2的抗体存在的稳定性较差、成本高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种沉默调节蛋白2的适配体在溶液中沉默调节蛋白2的应用，以实现溶液或细胞裂解液中沉默调节蛋白2的快速检测。
本发明的第三目的在于提供一种沉默调节蛋白2的适配体在活细胞原位检测沉默调节蛋白2中的应用，以实现对细胞内的沉默调节蛋白2进行活细胞原位成像检测，解决了目前常用的免疫荧光成像方法难以进行活细胞成像的技术问题。
与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：
本发明提供了一种沉默调节蛋白2的适配体及其应用，该适配体能够用于快速检测溶液中沉默调节蛋白2浓度大小，并且能稳定识别细胞内沉默调节蛋白2，从而对活细胞内的沉默调节蛋白2进行原位成像，成像效果优异，为活细胞沉默调节蛋白2的原位成像检测提供了一种经济、可行性强的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中候选适配体的亲和力表征示意图；
图2为本发明实施例中的候选适配体中p-45的亲和力测定及二级结构示意图；
图3为本发明试验例1中适配体传感器荧光检测值对SIRT2蛋白浓度的线性回归图；
图4为本发明试验例2中适配体传感器用于三种不同细胞系中SIRT2蛋白原位成像图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本发明提供了一种沉默调节蛋白2的适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其次，一种沉默调节蛋白2的适配体在溶液中沉默调节蛋白2的应用。最后，本发明提供了一种沉默调节蛋白2的适配体在活细胞原位检测沉默调节蛋白2中的应用。
实施例
SIRT2适配体筛选：
本发明采用磁珠-SELEX方法筛选得到SIRT2适配体。
初始文库随机序列：
5'-ATTGGCACTCCACGCATAGG-N(40)-CCTATGCGTGCTACCGTGA A-3'(N为A/T/C/G随机脱氧核苷酸)。
筛选过程：
首先，用杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)将1OD初始文库稀释为10μM终浓度，95℃加热10min，冰水浴5min，平衡至室温待用。其次，取50μL磁珠，加入200μL DPBS缓冲液，混匀混悬液后磁铁垂钓磁珠，吸弃上清，重复洗涤3次。将50μL 0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与50μL0.4M 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚氨盐酸盐(EDC)混匀，加入到磁珠中，室温孵育20min。磁铁垂钓磁珠，吸弃上清，并用200μL DPBS缓冲液洗涤磁珠1次。
将靶标蛋白SIRT2用pH 4.5醋酸钠溶液稀释为终浓度0.15mg/mL，总体积为100μL的蛋白溶液，并加入到上步磁珠中，室温孵育30min。磁铁垂钓磁珠，吸弃上清，加入100μL1M乙醇胺封闭10min。磁铁垂钓磁珠，吸弃上清，用200μL DPBS缓冲液洗涤3次，即得磁珠-SIRT2(MB-SIRT2)。最后，将变复性后的适配体文库溶液加入到MB-SIRT2中，室温孵育45min。磁铁垂钓磁珠，吸弃上清，加入200μL DPBS缓冲液洗涤，重复洗涤3次。加入200μLDPBS缓冲液，混匀混悬液，100℃水浴加热10min使蛋白变性，磁铁垂钓磁珠，收集上清液Elution。
第1轮筛选以SIRT2作为靶标蛋白，第2轮筛选引入牛血清白蛋白(BSA)作为反筛蛋白，收集与反筛蛋白孵育后不结合的上清溶液作为第2轮正筛的适配体文库。共进行15轮筛选。
文库扩增：
对第1轮筛选得到的适配体次级文库溶液Elution进行常规PCR扩增。将2mL PCRmix溶液融解离心，加入到10mL离心管中，再加入Elution，涡旋使溶液混匀，按照每孔100μL分装至8联排PCR管中，PCR扩增程序为：95℃1min，95℃30s，60℃30s，72℃30s,从95℃30s开始重复25个循环，最后在72℃保持5min。
对第2轮及以后的次级文库采用乳浊液扩增。将2mL PCR mix溶液融解离心，加入到50mL离心管中，再加入Elution，涡旋震荡离心管使混合液充分混匀，加入8mL ePCR微液滴生成油，涡旋混合1-2min，按照每孔100μL将涡旋后的乳浊液平均分装到8联排PCR管中，乳浊液PCR扩增程序为：95℃1min，95℃1min，60℃1min，72℃1min,从第二个95℃1min开始重复25个循环，最后在72℃保持5min。
单链DNA次级文库制备：
将扩增的文库浓缩至约100μL，加入等体积2×TBE尿素上样缓冲液中，颠倒离心混匀，95℃加热10min，冰上冷却5min备用。采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(300V)分离处理后的文库，电泳结束后，取出凝胶，在手持紫外灯照射下，用刀片切下绿色荧光的目的条带。将目的条带碎胶后放入2mL离心管中，加入DPBS缓冲液，沸水浴10min，12000rpm离心1min，将上清液浓缩至100μL左右。将该溶液在DPBS缓冲液中于4℃透析过夜。
ELISA法测定次级文库亲和力：
将第3-15轮筛选得到的适配体次级文库浓度均稀释为1μM；将连接Biotin的正向引物和反向引物均稀释为10μM。分别取次级文库10μL、正反向引物各40μL和PCR Super Mix1mL和无酶水910μL进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃2min,95℃20s,60℃20s,72℃20s,从第二个95℃1min开始重复35个循环，最后在72℃保持5min。回收扩增产物，用正丁醇浓缩至体积约100μL，加入等体积2×TBE尿素上样缓冲液混合，离心，95℃加热10min，冰浴5min后，采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(300V)分离处理后的文库，电泳结束后，取出凝胶，放置在3×GelRed染色液中室温染色30min。取出凝胶，在手持紫外灯照射下，回收80nt处红色荧光条带。将目的条带碎胶后放入2mL离心管中，加入DPBS缓冲液，沸水浴10min，12000rpm离心1min，将上清液浓缩至100μL左右。将该溶液在DPBS缓冲液中于4℃透析过夜。将SIRT2用蛋白包被液稀释为10μg/mL，用移液枪移取100μL加至高亲和蛋白包被酶标板中，贴上封板膜，4℃冰箱过夜。次日，用100μL 1×洗涤缓冲液清洗蛋白包被孔3次，每次浸泡洗涤1min，加入100μL 1％ BSA-PBS缓冲液，37℃条件下封闭1h。用100μL 1×洗涤缓冲液清洗3次，每次浸泡洗涤1min，再加入100μL连有5’-biotin的亚文库，37℃条件下孵育90min使SIRT2蛋白与亚文库特异性结合。用100μL 1×洗涤缓冲液清洗3次，每次浸泡洗涤1min，加100μLABC工作液，贴封板膜，在37℃条件下孵育1h。用100μL 1×洗涤缓冲液清洗5次，每次浸泡洗涤1min，加90μL TMB底物，在37℃条件下避光孵育15min。最后，每孔依次加入100μL TMB终止液，酶标仪测量其在450nm波长处的O.D值。
次级文库测序和候选适配体：
对8个代表性次级文库进行高通量测序。将得到的测序结果按照序列总条数排列，一些序列通过筛选被富集，对这些有富集趋势的序列再进行同源性分析，挑选同源性较低的12条DNA序列作为候选适配体，这12条候选适配体的序列如表1所示。
表1适配体序列
候选适配体的亲和力表征：
采用ELISA法对12条候选适配体与SIRT2的亲和力进行表征，如图1所示，12条候选适配体与SIRT2均有较好的亲和力，根据图2结果显示，其中p-45的亲和力最好，解离常数为116.7±30.5nM。
试验例1
SIRT2适配体传感器用于溶液中不同浓度SIRT2的检测：
以DMEM细胞培养基为缓冲液，配制SIRT2适配体传感器溶液(100nM aptamer-50μg/mL MnO2)，避光孵育10min，加入SIRT2蛋白使其终浓度分别为0、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，37℃避光孵育60min，使荧光恢复。使用荧光分光光度计进行荧光强度测定，设定激发波长为480nm，记录发射波长520nm处的荧光强度，平行3次实验。
以各平均荧光强度对SIRT2浓度进行线性回归，结果如图3所示。从图中可见，荧光强度与SIRT2浓度呈较好的线性关系，R2为0.98，表明此适配体传感器能够检测SIRT2的浓度大小。
试验例2
SIRT2适配体传感器用于三种细胞系中SIRT2原位成像检测：
将重悬在含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中的RSC96细胞以5000个/孔的密度接种在96孔板中，放入37℃，5％ CO2的恒温培养箱中培养24h。同样，将H9c2细胞与HUVECs细胞以5000个/孔的密度接种在96孔板中，放入37℃，5％ CO2的恒温培养箱中培养24h。24h后吸弃培养基，每孔加入100μL适配体传感器(100nM aptamer-50μg/mL MnO2)于37℃、5％ CO2的恒温培养箱中与细胞孵育4h。吸弃含有适配体传感器的培养基，加入浓度为2μg/mL的Hoechst溶液染细胞核10min，并用PBS缓冲液洗涤三次。最后，使用激光扫描共聚焦荧光显微镜在FITC和DAPI通道下进行细胞成像。
SIRT2蛋白在RSC96细胞、H9c2细胞及HUVECs细胞中广泛表达，因此，我们将适配体传感器与以上三种细胞孵育后，观察其是否能对3种细胞系中SIRT2进行原位成像。所得结果如图4所示，从图4可见：与传感器孵育后，各细胞系的细胞质中可以看到较强的绿色荧光信号，表明适配体传感器可以被细胞胞吞进入细胞进行SIRT2成像检测。因此，所构建适配体传感器可以用于上述三种细胞系中SIRT2相关生物学功能研究。
综上所述，本发明提供了一种沉默调节蛋白2的适配体其应用：
该适配体能够用于快速检测溶液中沉默调节蛋白2浓度大小，并且能稳定识别细胞内沉默调节蛋白2，从而对活细胞内的沉默调节蛋白2进行原位成像，成像效果优异，为活细胞沉默调节蛋白2的原位成像检测提供了一种经济、可行性强的方法。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (3)
1.一种沉默调节蛋白2的适配体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的沉默调节蛋白2的适配体在检测溶液中沉默调节蛋白2中的应用。
3.一种如权利要求1所述的沉默调节蛋白2的适配体在活细胞原位检测沉默调节蛋白2中的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202211709955.5A CN116286829A (zh) | 2022-12-29 | 2022-12-29 | 一种沉默调节蛋白2的适配体及其应用 |
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2022
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