CN116284422A - 抗超氧化物歧化酶抗体及其应用 - Google Patents

抗超氧化物歧化酶抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了靶向超氧化物歧化酶(SOD)的抗体或其抗原结合片段。本申请还提供了所述抗体或其抗原结合片段在检测或纯化SOD中的用途。

Description

抗超氧化物歧化酶抗体及其应用
技术领域
本文涉及靶向超氧化物歧化酶(SOD)的抗体。本文还涉及该抗体在检测或纯化SOD中的用途。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动植物体内的金属酶（含铜、锌、铁或锰），是人体内最主要的抗氧化物质。外源性补充SOD，可提高血液中SOD的含量，及时分解和消除过剩自由基，从而保护机体正常细胞组织，避免了疾病的发生，使人保持身体健康。
皮肤衰老和损伤是人体衰老的重要特征，而人体衰老的一个重要原因是由于活性氧类自由基堆积或清除产生障碍的后果，体内的多余自由基会引起细胞损伤以及色素沉着。由于人的皮肤直接与氧气接触，会造成皮肤的老化和损伤。外源 SOD的补充有利于延缓皮肤衰老、抗氧化、祛色斑的功用。故国内外许多化妆品厂家都在自身产品中加入了一定比例的 SOD。另外，基于SOD是作用于超氧阴离子自由基的专一歧化反应催化剂，故 SOD作为医药产品，在治疗因自由基作用而导致的炎症、自身免疫性、心脑血管疾病等都有着显著疗效。SOD可利用其抗氧化作用抑制关节炎、胸膜炎、急性气管炎等炎症类型。
目前SOD的生产来源于动物血液和肝脏，或者从植物中提取。尽管发现和使用SOD的已经有几十年，但仍缺乏特异性的检测和纯化手段。
发明内容
在一方面，本文提供了靶向超氧化物歧化酶(SOD)的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
1) HCDR1的氨基酸序列为SYITDMYCMG (SEQ ID NO：1)；
HCDR2的氨基酸序列为LFSRHGIERYADSVKG (SEQ ID NO：2)；
HCDR3的氨基酸序列为ARTPGNVTPRCAALLMYDY (SEQ ID NO：3)；
2) HCDR1的氨基酸序列为AYTISMCAMG (SEQ ID NO：4)；
HCDR2的氨基酸序列为MINRHGIEYYADSVKG (SEQ ID NO：5)；
HCDR3的氨基酸序列为GPTPGAELPRCATSLNYDY (SEQ ID NO：6)；以及
3) HCDR1的氨基酸序列为AYTISMCAMG (SEQ ID NO：4)；
HCDR2的氨基酸序列为MINRHGIEYYADSVKG (SEQ ID NO：5)；
HCDR3的氨基酸序列为EPTPGAESPRCATSLNYDY (SEQ ID NO：7)。
在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO ：8-10任一项所示序列。
在一些实施方案中，所述抗体为单域抗体。
在一些实施方案中，所述重链可变区融合有Fc片段。
在一些实施方案中，通过表面等离子共振技术测定，所述抗体或其抗原结合片段与SOD结合的KD值不高于10-7 M。
在一些实施方案中，所述SOD为Cu/Zn-SOD。
另一方面，本文提供了上述抗体或其抗原结合片段在检测或纯化SOD中的用途。
另一方面，本文提供了固相基质，其偶联有上述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述固相基质为磁珠或层析介质形式。
本文提供的抗体或其抗原结合片段对SOD具有高亲和力，可用于SOD的检测或纯化。
附图说明
图1显示了通过ELISA测定的抗体C238-Fc与 SOD结合亲和力结果。
图2显示了通过ELISA测定的抗体B33-Fc与 SOD结合亲和力结果。
图3显示了通过SPR测定的抗体B33-124-Fc在不同pH下与SOD结合亲和力结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
本文使用的术语“抗体”指包括包含一个或更多个特异性结合抗原的抗原结合结构域的免疫球蛋白或其他类型分子，为对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或多肽。抗体的具体实例可包括完整抗体、单链抗体、单域抗体、多特异性抗体等。抗体分子通常为由2 个相同重链和 2 个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V) 和位于羧基端的恒定区(C)。可变区用于识别和结合抗原，恒定区(如Fc片段)用于启动下游效应。在重链和轻链的可变区内，分别有三个局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度，为抗体与抗原结合的关键位置，因而也称为互补决定区(CDR)。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact容易地确定。在一个具体实施方案中，已经根据IMGT编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。三个重链互补决定区分别称为 HCDR1、HCDR2和HCDR3，三个轻链互补决定区分别称为 LCDR1、 LCDR2 和 LCDR3。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可将人抗体分为五种主要的不同类型： IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM。这些抗体类型根据铰链区的大小，链间二硫键的位置和分子量的不同可进一步分为亚类，例如，IgGl 、IgG2a、IgG2b和 IgG3等。根据抗体轻链恒定区氨基酸组成和排列的不同，可将轻链分为κ和λ两种类型。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。
抗体的“抗原结合片段”指抗体分子中参与抗原特异性结合的氨基酸片段，例如，Fab、Fab’和F(ab’)2等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如，经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段，经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2 ，通过以还原剂处理断开F(ab’)2 铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。
单链抗体(single chain fragment variable, scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“单域抗体(sdAb)”，或者也称为“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，单域抗体也可以认为是经典四链抗体分子的片段。单域抗体首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子(例如，经典抗体分子)具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
本文使用的“Fc片段”指Y形经典抗体分子的柄部区域，即可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)，包括重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3结构域)。可通过蛋白水解酶 (如木瓜蛋白酶)水解抗体分子得到抗体Fc区。Fc片段可来自IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在一些实例中，Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
对于抗体或其抗原结合片段来说，“靶向”、“针对”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如抗原)具有更高的结合亲和力。一种分子可以靶向、针对或特异性结合一种以上的分子，例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有相对于其他分子而言更高的结合亲和力。可以通过一些参数测量来衡量抗体对抗原的结合亲和力，例如抗体与抗原结合的EC50值或KD值。
EC50 (concentration for 50% of maximal effect)指引起50%最大效应的浓度。在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用于表示抗体分子与对应抗原的结合能力时，可指产生最大检测信号(如比色或荧光强度)一半时的抗体分子浓度。EC50值越低，则与抗原的结合亲和力越大。
KD值也可以用于衡量抗体与其抗原之间的结合亲和力。KD值是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即 koff/kon (或kd/ka)的比值。因此 KD 值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。
本文提供的抗SOD单域抗体与SOD具有高亲和力，可用于SOD的检测或纯化。尤其是本文提供了一个pH依赖性的抗SOD单域抗体，在中性或稍碱性pH情况下与SOD具有高亲和力，而在稍偏酸性情况下(如pH5)时几乎不与SOD结合，这提供了从含有SOD的样品(如动物或植物细胞浆液)中分离和纯化SOD的简单方法。即，在中性或碱性条件性让偶联有该抗体的固相基质(如磁珠或层析介质)与含有SOD的样品混合，清洗固相基质，随后在偏酸性条件下洗脱，可获得高纯度SOD。当将本文提供的单域抗体用于SOD的检测时，可将其与一些可检测标签融合或偶联。可检测标签的实例包括免疫检测中可使用的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)；荧光基团(如FAM、FITC)或荧光蛋白(如GFP)；放射性同位素(例如3H，14C)。当单域抗体与SOD结合时，可通过可检测标签的量来反映样品中SOD的量。因此，本文还提供了用于检测或纯化SOD的试剂盒。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1 单域抗体筛选
利用分离自玉米胚芽的Cu/Zn-SOD蛋白(以下简称SOD)免疫雄性双峰驼(首免+三次加强免疫)，在最后一次免疫后5天时，分离外周血单核细胞(PBMC)，提取总RNA进行反转录。以反转录产物cDNA为模板扩增单域抗体重链可变区(VHH)。将扩增产物接入M13噬菌体展示载体(蛋白III基因)，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建噬菌体展示单域抗体文库。随后利用SOD通过固相筛选的方法对所构建的文库进行筛选，获得了两株可特异性结合SOD的噬菌体克隆C238和B33。通过测序确定了这两个克隆对应的单域抗体的可变区序列。
克隆C238可变区序列(VHH，CDR序列加有下划线)：
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCIASSYITDMYCMGWFRQAPGKEREGVALFSRHGIERYADSVKGRFTISRDHAGNTLYLEMNSLKPEDTAMYYCAAARTPGNVTPRCAALLMYDYWQKGTQVTVSS (SEQ ID NO：8)
克隆B33可变区序列(CDR序列加有下划线)：
QVQLQESGGDSVQSGGSLRLSCIASAYTISMCAMGWFRQAPGKEREGVAMINRHGIEYYADSVKGRFTISRDHAGNTLYLEMNSLKLEDTAMYYCAAGPTPGAELPRCATSLNYDYWQKGTQVTVSS (SEQ ID NO：9)
实施例2 单域抗体制备
将克隆C238和克隆B33的可变区编码序列分别克隆入含有人IgG1 Fc片段编码序列的质粒中，并通过Sanger测序确认连接正确的质粒。转染CHO-S细胞，进行瞬时表达，通过Protein A纯化，分别获得与人IgG1 Fc片段融合的单域抗体(分别称为C238-Fc和B33-Fc)。
实施例3 ELISA亲和力测定
采用ELISA评估C238-Fc和B39-Fc对于SOD的结合能力。将ELISA板用含0.8 μg/mLSOD的PBS中在4℃下包被过夜(每种抗体包被12个孔)。第二天用PBS-T (0.05%吐温)洗涤ELISA板，并以含1% BSA的PBS-T在37℃封闭2小时。弃去封闭液，依次向孔中加入三倍梯度稀释的抗体150 μL (第一孔抗体浓度1 μg/mL)，在室温下孵育2小时。将板用PBS-T洗涤3次，加入偶联辣根过氧化物酶的山羊抗人Fc抗体，37℃孵育1小时。将ELISA板用PBST洗涤4次，加入TMB显色液，在室温下在黑暗中孵育20分钟。终止反应后使用酶标仪在450nm读板，结果分别显示在图1和图2中。根据OD值曲线获得C238-Fc结合SOD的EC50为11.53 ng/mL；B33-Fc结合SOD的EC50为16.17 ng/mL。
实施例4 SPR亲和力测定
使用表面等离子共振 (SPR) 生物传感器 Biacore T200 (GE Healthcare)测定抗体C238-Fc和B33-Fc与玉米SOD的结合亲和力。通过Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上，以玉米SOD作分析物。使用Biacore T200评估软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数数据。平衡解离常数 (KD) 由 kd 与 ka 的比率计算。SPR亲和力测定结果见下表1。
表1 抗体亲和力测定结果
Figure SMS_1
实施例5 pH敏感单域抗体
我们对两株抗体的CDR3区域进行大量点突变，以期获得对SOD具有更高亲和力的变体。大部分变体经测定未有亲和力进一步增加，但发现了B33-Fc抗体基础上的一个变体(B33-124-Fc)与SOD的结合对pH变化敏感。
B33-124-Fc可变区序列(相对于B33可变区的CDR3氨基酸改变显示为斜体)：
QVQLQESGGDSVQSGGSLRLSCIASAYTISMCAMGWFRQAPGKEREGVAMINRHGIEYYADSVKGRFTISRDHAGNTLYLEMNSLKLEDTAMYYCAAEPTPGAESPRCATSLNYDYWQKGTQVTVSS (SEQ ID NO：10)
采用实施例4的方法检测了不同pH条件下B33-124-Fc与玉米SOD的结合亲和力，结果如图3所示。图中以pH7时测定的亲和力为100% (KD值：7.33E-08)。从图3可知，B33-124-Fc与玉米SOD的结合在pH偏酸性时(pH5)迅速减弱，而在pH偏碱性时(pH9)基本上维持了原有亲和力。
实施例6 利用B33-124-Fc纯化玉米SOD
通过CHO-S细胞瞬时表达制备B33-124-Fc，纯化后偶联至NHS-活化磁珠(Pierce)。将玉米胚芽粉碎成浆液，过滤后获得滤液，与制备的偶联磁珠充分混合。磁分离磁珠，以3倍体积的pH9.5 PBS洗涤磁珠3次。以pH5.0的PBS悬浮磁珠，置于磁分离器上静止50分钟。取上清液，通过毛细管等电聚焦电泳(Agilent)测定蛋白纯度。结果显示，所纯化的SOD纯度在98%以上。

Claims (9)

1.靶向超氧化物歧化酶的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
1) HCDR1的氨基酸序列为SYITDMYCMG；
HCDR2的氨基酸序列为LFSRHGIERYADSVKG；
HCDR3的氨基酸序列为ARTPGNVTPRCAALLMYDY；
2) HCDR1的氨基酸序列为AYTISMCAMG；
HCDR2的氨基酸序列为MINRHGIEYYADSVKG；
HCDR3的氨基酸序列为GPTPGAELPRCATSLNYDY；以及
3) HCDR1的氨基酸序列为AYTISMCAMG；
HCDR2的氨基酸序列为MINRHGIEYYADSVKG；
HCDR3的氨基酸序列为EPTPGAESPRCATSLNYDY。
2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO：8-10任一项所示序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单域抗体。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区融合有Fc片段。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，通过表面等离子共振技术测定，所述抗体或其抗原结合片段与所述超氧化物歧化酶结合的KD值不高于10-7M。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述超氧化物歧化酶为Cu/Zn-SOD。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段在检测或纯化超氧化物歧化酶中的用途。
8.固相基质，其偶联有权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述的固相基质，为磁珠或层析介质形式。
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