CN116270593A - 桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明首次发现在脓毒症诱导的认知功能障碍损伤中，桔皮素能明显抑制Akt信号通路，减轻脓毒症病理过程下小胶质细胞的激活和炎症反应；同时发现桔皮素可以与Akt蛋白结合，进而抑制了Akt蛋白的磷酸化水平，有效抑制小胶质细胞活化与炎症反应，改善脓毒症小鼠海马区的损伤。此外，本发明进一步揭示了桔皮素能与Akt在空间上结合，是一种天然的Akt抑制剂，并且以中等强度的亲和力结合。在制备治疗脓毒症引起的认知功能障碍的药物中有很好的应用前景，为脓毒症并发症的预防和治疗开辟新的医药途径。

Description

桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用。
背景技术
脓毒症(Sepsis)在新的共识中被定义为机体对感染反应失调，导致器官功能障碍而危及生命，也就是当宿主对感染的反应使得自身器官和组织受损进而危及生命就称为脓毒症。当脓毒症发展到一定程度，常常合并各种器官功能障碍，尤其会导致中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的功能紊乱，甚至出现脓毒症脑病(Sepsis associatedencephalopathy,SAE)。这种脑功能障碍与中枢神经系统的直接感染无关，而是与脓毒症期间释放的介质有关，并且常见的表现为认知功能障碍。近几年在重症监护室亦越来越常见，其发病率与病死率逐渐增高。脓毒症引起的认知功能障碍与机体处理感染的复杂病理生理反应的能力有关，并且它与行为、记忆和认知功能的长期损伤也紧密相连。更重要的是，若脓毒症的病人发生了认知功能障碍则比单纯的脓毒症患者拥有更高的死亡率。至今脓毒症引起认知功能障碍的病理机制仍未完全明了，同时也缺乏有效的药物或方法减少脓毒症病人认知功能障碍的发生。
脓毒症引起认知功能障碍的表现可见于脓毒症发生的初期以及SAE患者，而出院的患者也会患有长期的认知功能障碍。脓毒症引起认知功能障碍与脓毒症引起的焦虑、注意力与计算能力下降类似，这些行为被视为机体对疾病的一种防御性行为，映射出杏仁体核内神经传导或海马体功能受损，从而为了让患者集中精力对抗体内的感染病灶。脓毒症引起认知功能障碍的病理机制有脑血管的直接损伤、中枢系统神经炎症、能量代谢紊乱以及血脑屏障功能障碍，而小胶质细胞与星形胶质细胞的异常活化会直接或间接导致以上病理过程，研究发现海马以及额叶皮层是最常受到影响的区域。在疾病发展的进程中，小胶质细胞的活化是常见的神经病理学特征。在脓毒症发生时，会导致有促炎因子的释放或血脑屏障被破坏，小胶质细胞能够检测内源性或外源性的危险信号从而激活，引起了中枢神经炎症。这些炎症反应在机体内虽然能进行组织的修复作用，但同时也能诱导免疫细胞释放炎症因子或炎症趋化因子攻击细胞。炎症趋化因子会导致细胞表达黏附因子，募集白细胞与血小板，进一步加速疾病的进展。所以小胶质细胞活化诱导的神经炎症不仅是脓毒症引起认知功能障碍的病理学特征，同时也是疾病发展中重要的环节，故其也成为了近期脓毒症的研究热点。
蛋白激酶B(Akt)是一种针对丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，其相对分子质量为57kDa，并且主要含有3个亚型，即Akt1(PKBα)、Akt2(PKBβ)、Akt3(PKBγ)，在蛋白结构中各个亚型之间联系紧密，他们分别在不同的细胞环境中起着不同的作用。Akt与细胞外信号积极响应，促进细胞代谢与存活，调节炎症反应，是一个对治疗脓毒症中十分重要的治疗靶点。在脓毒症期间，活化的小胶质细胞PI3K-Akt通路被激活，这会释放过量的促炎介质、炎症因子与诱导多种活性酶的表达，导致神经元功能障碍和神经递质紊乱。因此，针对小胶质细胞Akt改善小胶质细胞的神经炎症可能成为预防和防治脓毒症引起的认知功能障碍的有效方法。
传统中药是我国上下五千年继承下来的宝库，近年来从中药中提取合成的人工药物被证实对多种疾病有治疗作用，从药方与中草药提取的化合物逐渐被世界所认可。桔皮素作为一种柑橘类果皮有效成分，具有多甲氧基化黄酮，多存在于柑橘(C.reticulataBlanco.)的叶和茎、酸橙(C.aurantium L.)与芸香科川橘(Citrus nobilis Lour.)的果皮中，是在柑橘果皮中含量最丰富的化合物之一，有较好的治疗动物螨病的作用，且毒副作用小，残留量低，具有中草药制剂的优点。桔皮素还具有多种生物学效应，如免疫调节、抗动脉粥样硬化、调节血糖、抗氧化及抗肿瘤等功效。有报道描述了桔皮素可通过血脑屏障，是一种具有治疗中枢神经系统潜在价值的药物。虽然有研究报道了桔皮素在多种疾病中发挥保护作用，但未见桔皮素防治脓毒症导致的认知功能障碍的报道。
发明内容
本发明的目的是提供桔皮素在制备防治脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用，以解决现有技术中存在的问题。本发明通过动物实验发现，桔皮素能够改善脓毒症小鼠的一般状况，提高脓毒症小鼠72小时生存率，并且一定程度上改善了脓毒症导致的认知功能障碍。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用。
进一步地，所述改善脓毒症导致的认知功能障碍包括改善脓毒症早期的神经反射、降低海马组织及血清中的炎症因子、减少小胶质细胞活化、减少小胶质细胞产生的炎症因子和改善学习记忆功能。
进一步地，所述减少小胶质细胞活化为通过抑制Akt信号通路减少小胶质细胞活化。
进一步地，所述抑制Akt信号通路为桔皮素与Akt稳定结合，并且其结合力为中等强度。
进一步地，所述桔皮素与Akt稳定结合具体为桔皮素与所述Akt的LYS-160形成氢键连接。
进一步地，所述海马组织及血清中的炎症因子包括TNFα、IL-6和IL-1β。
进一步地，所述小胶质细胞产生的炎症因子包括TNFα与IL-6。
本发明公开了以下技术效果：
桔皮素对脓毒症诱导的认知功能障碍损伤有显著的改善作用，本发明首次公开指出了桔皮素在脓毒症诱导的认知功能障碍损伤中，桔皮素能明显抑制Akt信号通路，减轻脓毒症病理过程下小胶质细胞的激活和炎症反应，如TNFα和IL-6等致病蛋白的表达，小胶质细胞的活化程度等；同时发现桔皮素可以与Akt蛋白结合，进而抑制了Akt蛋白的磷酸化水平，有效抑制小胶质细胞活化与炎症反应，改善脓毒症小鼠海马区的损伤。此外，本发明进一步揭示了桔皮素能与Akt在空间上结合，是一种天然的Akt抑制剂，并且以中等强度的亲和力结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为各组小鼠7天内的生存曲线，n＝70，其中，Sham组n＝16，其余各组n＝18；
图2为小鼠7天内脓毒症评分(A)以及神经行为评分(B)，每组n＝8；
图3为Elisa检测小鼠海马体和血清中炎症因子TNFα、IL-6与IL-1β的表达情况，每组n＝5；其中，A为小鼠海马体中炎症因子TNFα、IL-6与IL-1β的表达情况，B为小鼠血清中炎症因子TNFα、IL-6与IL-1β的表达情况；
图4为Morris水迷宫对各组小鼠的学习记忆能力的检测结果，每组n＝8，其中A为小鼠在水迷宫训练4天，并进行逃避潜伏期测定，B为小鼠在水迷宫内，逃避潜伏期内的运动轨迹图；
图5为小鼠经Morris水迷宫训练4天后撤离水平台，进行空间探索能力测定，其中A为各组小鼠的平均速度，B为小鼠在平台所处象限的总时间，C为小鼠穿越平台次数，D为小鼠在水迷宫内，进行空间探索的运动轨迹图；其中&表示Sham组vs CLP组，P<0.05；*表示CLP+15mg/kg组vs CLP组，P<0.05；#表示CLP+30mg/kg组vs CLP组，P<0.05；
图6为各组小鼠Iba-1、p-akt1蛋白在脑组织中表达的结果图；
图7为给予小胶质细胞桔皮素处理，Western blot检测蛋白表达的结果图，其中A为各组小鼠p-Akt、t-Akt、p-NFκB、TNFα和IL-6的凝胶电泳结果，B为各组小鼠p-PTEN、p-PDK1、p-Akt2和p-GSK-3β的凝胶电泳结果，C-F依次为IL-6、TNFα、p-Akt、p-NFκB的凝胶电泳相对定量灰度分析，每组n＝3；*表示桔皮素单药组vs LPS组，#表示LPS+桔皮素组vs LPS组；
图8为桔皮素与Akt分子对接及分子动力学模拟结果图，其中，A是桔皮素-Akt复合物构成的三维丝带模型，B显示桔皮素相互作用的氨基酸残基以及氢键长度，C是在0纳秒和100纳秒时，桔皮素-Akt复合物络合物表面模拟模型，D展示了未结合的Akt(蓝色)和桔皮素-Akt复合物(红色)的重原子的均方根偏差；
图9为Akt蛋白与桔皮素的亲和力测定曲线(A)和拟合曲线(B)，在图A中，不同颜色曲线代表梯度浓度的桔皮素(25，12.5，6.25，3.15，1.56，0.781μM)与Akt蛋白的亲和力，浓度越高亲和力越大。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明涉及的桔皮素(4′,5,6,7,8-五甲氧基黄酮)的分子式为C20H20O7，分子量372.37，结构式如下所示：
Figure BDA0003987335620000051
实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠购自广东省实验动物中心，5-6周龄，20-22g。所有实验动物均按照《实验动物管理和使用指南》进行人道处理。实验方案获得广州医科大学实验动物伦理委员会批准。待8-10周龄，22-25g后用于建立疾病模型。实验开始前自由觅食、饮水，自然光照。小鼠分为假手术组(Sham)、模型组(CLP)、小剂量(CLP+15mg/kg)组和高剂量(CLP+30mg/kg)组，其中模型组、小剂量组和高剂量组首先构建脓毒症小鼠模型，构建过程如下：
采用小鼠盲肠结扎穿孔手术(Cecal ligation andpuncture,CLP)诱导脓毒症模型：按照小鼠体重以50mg/kg的剂量腹腔注射质量浓度0.75％的戊巴比妥钠进行麻醉，固定小鼠并脱毛，用碘伏消毒2次后铺上无菌洞巾。然后沿着小鼠腹部正中线剪开皮肤以及肌层，小心翻出盲肠，挤压肠内的粪便到达盲端，结扎三分之一盲肠后然后在盲端用5mL注射器穿刺后，挤出少量粪便。最后回纳盲肠并缝合皮肤以及肌层，在37℃保暖毯保暖复苏。假手术组与模型组相比，麻醉方式和手术开腹的步骤与模型组相同。在翻出盲肠后，直接将肠管回纳至腹部然后进行皮肤与肌层的缝合。
各组小鼠均在术后2小时灌胃给药，模型组以及假手术组用溶媒灌胃作为安慰对照，小剂量组和高剂量组分别按照小鼠体重以15mg/kg和30mg/kg的剂量灌胃桔皮素，相应然后进行相关实验。
实施例1改善脓毒症小鼠的认知功能障碍
1.桔皮素对脓毒症小鼠7天死亡率和神经反应的影响
观察并记录各组小鼠7天内的生存状况，绘制各组小鼠7天内的生存曲线，如图1所示，在观察7天的范围内，桔皮素能减少脓毒症小鼠的7天死亡率。
对各组小鼠进行7天内脓毒症评分以及神经行为评分。各组小鼠分别于术后1、3、5、7进行了脓毒症评分和神经行为评分，并通过检查各种神经反射进行评分。脓毒症评分通过观察自发活动、对触觉和听觉刺激的反应、姿势、呼吸频率和质量(呼吸困难或喘息)以及外观(即竖毛程度)进行评估，具体评分标准见表1。
表1.小鼠脓毒症评分表
Figure BDA0003987335620000061
Figure BDA0003987335620000071
神经反射的量化评分规则是：耳廓反射和角膜反射用于评价简单的非姿势躯体运动功能，尾部屈曲反射用于评估简单姿势躯体运动功能，翻正反射和逃逸反应则用于评估复杂姿势躯体运动功能。耳廓反射通过轻轻触摸耳朵的耳道引起剧烈的摇头来评估，角膜反射通过用棉签轻轻接触角膜来引起摇头反射来评估，尾部屈曲和逃逸反应反射通过短暂地挤压尾巴来评估，以分别引发撤退反应和远离伤害性刺激的运动，最后通过将动物仰卧并测量恢复到自发直立位置所需的时间来测试翻正反射。针对每项反射的评分细则为：无反射得“0”分，弱反射得“1”分(丧失反射10秒)，正常反射得“2”分，每只小鼠最高可得10分。
小鼠7天内脓毒症评分以及神经行为评分结果如图2所示，根据图2可知，在脓毒症小鼠灌胃桔皮素后，早期其一般状况和神经反射均有一定程度的改善。
2.桔皮素对脓毒症小鼠海马组织及血清中炎症因子的影响
在术后36小时取小鼠海马体组织(20mg)和小鼠眼球血血清(100μL)，利用Elisa实验进行TNFα、IL-6和IL-1β炎症因子的测定，海马组织显示三种炎症因子在CLP术后36小时均有明显提升，高剂量桔皮素能稳定下调组织中的炎症因子(图3的A)；血清中的炎症因子更能体现桔皮素下调炎症因子的作用，并且低剂量和高剂量组均可减少炎症因子的生成(图3的B)。
3.桔皮素对脓毒症小鼠学习记忆功能的影响
以Morris水迷宫实验探究各组小鼠的学习记忆能力，具体实验方法为：
CLP术后5天左右，因盲肠机化与腹膜包被，炎症反应消失，故以CLP术后7天为基线，后5天进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验旨在小鼠为逃避水环境而作出努力寻找潜伏在水中平台的过程从而反映小鼠的学习记忆能力；而小鼠根据对环境进行空间辨别和识别，定向且有目的地游向水中平台，则体现出小鼠的空间记忆能力。水迷宫设备包含一个白底色圆形水池(直径120cm，高60cm)、一个5cm栖息平台、一台运动轨迹跟踪录像机以及与录像机相连的计算机。水池在检测前盛水，保证恒定的水温22～24℃，水深以水平台在水面下1cm为宜。录像机安置于水池中央上方200cm处，用Smart动物行为学软件记录分析Morris水迷宫小鼠的运动轨迹，包括小鼠的游泳路径、位置、游泳时间及游泳距离，从而可推导出游泳速度。
Morris水迷宫共分为3个过程，其中包括获得性训练、定位航行实验和空间探索实验。(1)获得性训练：将水池分为4个象限，平台置于目标第四象限中央。随机选取位置(第四象限除外)将小鼠头朝池壁放入水中，此时开始记录，直到小鼠找到平台后停止，统计游泳时间和游泳距离(从而计算游泳速度)及可视化游泳路径。在训练过程中，如果小鼠超过2min仍未到达平台，则用漏勺引导小鼠到平台栖息停留15s，然后将小鼠移开、擦干。连续训练4天，每天训练3次，每次训练间隔时间为2h。
(2)定位航行实验：接着在第1-5天行定位航行实验。记录小鼠在水池中找到水下平台的时间(即逃避潜伏期)和游泳距离及轨迹。
(3)空间探索实验：在第5天的定位航行实验结束后，撤除水中平台，将小鼠由原先平台所在象限的对侧(第二象限)放入水中进行60s的空间探索实验。记录小鼠在目标象限(即原先放置平台的象限)所占的时间及游泳轨迹，计算小鼠在目标象限游泳时间所占百分比与穿越原来水平台的次数，以检测小鼠空间记忆水平。
在Morris水迷宫实验获得性训练中，模型组小鼠逃避潜伏期明显比假手术的小鼠要长，说明脓毒症对小鼠有一定的学习记忆能力损伤，在第三天与第四天的训练实验中，桔皮素组的逃避潜伏期比模型组短，这证明了桔皮素可以减少脓毒症导致的学习记忆功能损伤，见图4。在撤掉平台后的空间探索实验中，CLP组小鼠原平台所在象限游泳时间百分比明显下降，与Sham组相比存在显著差异；而桔皮素可逆转这一改变，高剂量可使原平台所在象限游泳时间百分比与穿越原平台次数显著提高，见图5。可见桔皮素能改善脓毒症导致小鼠学习记忆功能损害。
实施例2桔皮素对脓毒症小鼠p-Akt与Iba-1在海马组织表达的影响
小胶质细胞活化在脓毒症导致的认知功能障碍的发生和发展起着重要的作用。组织免疫荧光检测小胶质细胞的活化指标(Iba-1)以及p-Akt的表达，具体方法如下。
使用冰冻切片荧光同源双标染色实验验证：
冰冻切片固定：冰冻切片37℃烘箱烘烤10-20min，控干水分。置于固定液固定30min，于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
抗原修复：修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。修复完成后，自然冷却。将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
画圈,双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
血清封闭：甩干PBS，滴加3％的BSA，封闭30min。
加Iba-1一抗：去掉封闭液，滴加配好的一抗(1:500稀释)，平放于湿盒内4℃孵育过夜。
加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加对应的HRP标记的二抗，室温孵育50min。
加对应的tsa：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min.孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
微波处理：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min。
加p-Akt抗体：滴加配好的一抗(1:500)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
加对应的二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加对应的荧光二抗，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
自发荧光淬灭：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂B液，孵育5min，流水冲洗10min。
封片：抗荧光淬灭封片剂封片。
采集图像:DAPI激发波长330-380nm，发射波长420nm；488激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3激发波长510-560nm，发射波长590n。
结果如图6所示，蓝色表示DAPI，红色表示Iba-1，绿色表示p-Akt。与Sham组相比，可见CLP组小鼠的小胶质细胞迁移至海马区明显增多，并且活化的小胶质细胞p-Akt表达升高。低剂量组能减少p-Akt的表达，但是小胶质细胞的活化无明显下降；高剂量组能明显减少小胶质细胞的活化并且减少了p-Akt的表达。这提示了桔皮素是通过抑制p-Akt信号通路减少小胶质细胞活化。
实施例3桔皮素对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞炎症因子和Akt磷酸化的影响
小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，占所有神经胶质细胞的10％-15％，参与免疫防御与神经修复，是神经系统的重要组成部分。过度活化的小胶质细胞会引起细胞表达黏附因子，募集白细胞与血小板，活性氧产生增多，炎症因子和炎症介质的生成与分泌不仅会损伤神经元自身，还会导致神经元能量代谢紊乱以及血脑屏障功能障碍。
为了研究桔皮素对小鼠小胶质细胞(BV2)的影响，我们构建了脂多糖诱导的小鼠小胶质细胞活化模型，并研究了桔皮素处理后小胶质细胞相关因子的表达变化，具体操作：
BV2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，将BV2细胞接种在含10％FBS、1％双抗的DMED培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将BV2细胞分为正常对照组、桔皮素单药组、LPS处理组和桔皮素治疗组(即LPS+TGT组)，通过Western Blot验证差异表达的炎症因子。正常对照组仅加入对应体积的溶媒(二甲基亚砜)，桔皮素单药组加入40μM的桔皮素作为对照，LPS组则加入1μg/mL刺激小胶质细胞产生炎症反应，桔皮素治疗组在加入LPS的同时加入桔皮素40μM进行炎症的抑制。
用Western Bloting检测了各组小鼠p-Akt、t-Akt、p-NFκB、TNFα和IL-6的表达。
如图7所示，脂多糖能诱导小胶质细胞TNFα和IL-6的表达增多，并且能激活p-NFκB信号通路，Akt的磷酸化增高。桔皮素组(TGT 40μM)与脂多糖组相比，其炎症因子表达水平减少，同时Akt的磷酸化与NFκB的磷酸化减少，单药组与空白对照组无改变。桔皮素对Akt上游的蛋白以及其亚基(p-PTEN、p-PDK1、p-Akt2)无明显抑制作用，但是Akt下游蛋白如(p-GSK-3β)则随着p-Akt表达抑制而增高。这证明了桔皮素能减少小胶质细胞炎症因子的产生，抑制Akt信号通路并且对该通路上游无明显影响。
实施例4桔皮素与Akt的联系
表面等离子共振原理是当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面(比如玻璃表面的金或银镀层)时，可引起金属自由电子的共振，由于共振致使电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。具体操作：
1.试剂配制：
运行试剂：含1×PBS，0.05％，吐温-20(Tween-20)，5％二甲亚砜(DMSO)，pH调节至7.4。
稀释试剂：含1×PBS，0.05％吐温-20(Tween-20)，pH调节至7.4。
置换试剂：含10m MN-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸(HEPES)，150mM氯化钠(NaCl)，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.005％吐温-20(Tween-20)，pH调节至7.4。氨基偶联试剂盒(货号：BR100050，Cytiva)，包括：115mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，750mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10.5mL1M乙醇胺(pH8.5)。每管EDC和NHS分别加入10mL去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。
2.缓冲液置换：
使用盐柱及置换试剂将Akt1蛋白进行缓冲液置换，置换后的样品用SPECTROstarNano进行浓度测定。缓冲液置换后样品定量见表2。
表2.缓冲液置换后样品定量表
Figure BDA0003987335620000121
3.芯片制备
将Akt1蛋白用固定试剂(10mM醋酸钠，pH4.0)稀释到40μg/mL。首先，芯片的表面用400m MEDC和100mM NHS以10μL/min的流速进行420s的活化。其次，将40μg/mL的Akt1蛋白以10μL/min的流速注入到实验通道(Fc2)，固定量约为10000RU。最后，芯片用1M乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。参比通道(Fc1)不注入Akt1蛋白，其他操作与实验通道相同。
4.溶剂校正
配置4.5％和5.8％的DMSO并配置校正曲线。配置方法见表3-4。
表3. 4.5％和5.8％DMSO配置方法
Nominal DMSO concentration 4.5％DMSO 5.8％DMSO
1×PBS 9.5mL 9.5mL
100％DMSO 0.45mL 0.58mL
Final volume ～10mL ～10mL
表4.校正曲线配置方法
Buffer/Vial 1 2 3 4
Nominal DMSO concentration 5.8％ 5.3％ 4.9％ 4.5％
4.5％DMSO 0 1500 2×1500 2×1500
5.8％DMSO 2×1500 2×1500 1500 0
5.分析物多循环分析
首先，将桔皮素用稀释试剂稀释20倍，使其DMSO含量由100％变为5％。然后，将桔皮素用运行试剂进行2倍倍比稀释(表5)。将稀释后的桔皮素依次以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂中进行。
表5 Akt1蛋白与桔皮素亲和力测试的浓度梯度及结合解离时间
配体(ligand) 分析物(analyte) 分析物浓度(μM) 结合时间(s) 接力时间(s)
Akt1 桔皮素 0.781-25 60 90
6.其它
所有的操作步骤均在运行试剂中进行，SPR的分析试剂均需过滤脱气使用。使用Biacore 8K分析软件Biacore Insight Evaluation Software计算每个样品的KD值。参比通道(Fc1)用于背景的扣减。
采用分子对接软件Autodock Vina以及分子动力学软件YASARA进行分子对接及分子动力学模拟。观察配体和受体的结合亲和力只要通过分子对接，参与相互作用的值得关注氨基酸残基能体现出配体和受体之间的相互作用细节。Akt-桔皮素复合物的结合能为-6.68kcal/mol。
图8中A提示了Akt-桔皮素复合物的三维丝带模型，桔皮素结合在Akt的三维立体结构中。图8中B显示了与桔皮素相互作用的氨基酸残基，如图所示桔皮素与Akt的LYS-160形成了1个氢键，氢键长度为
Figure BDA0003987335620000131
然后，我们用前期模拟的Akt-桔皮素复合物当中的最佳构象作为MD模拟的起始构象。图8中C显示了Akt-桔皮素复合物的表面可视化模式在0ns以及100ns的构象。模拟结合后，桔皮素稳定地呈现在Akt的结合位点上，并且直到MD模拟的结束点。图8中D提示了该复合物关于重原子均方根偏差(RMSD)的演变。起始原子RMSD轨迹受体蛋白Akt在0ns-20ns内，从/>
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上升到/>
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然后在26-60nm内中围绕/>
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上下浮动，最后40nm内稳定在/>
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左右(图8中D，蓝线)。配体小分子桔皮素在0ns-20ns内，从/>
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然后在26-60nm内中围绕/>
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上下浮动，最后40nm内稳定在/>
Figure BDA0003987335620000139
左右(图8中D，红线)。图9中A和B为Akt蛋白与桔皮素的亲和力测定曲线和拟合曲线，检测出Akt蛋白与桔皮素亲和力为23.7μM，为中等强度的结合。
以上结果表明Akt与桔皮素的结合是稳定的，分子对接、分子动力学模拟以及表面等离子共振实验证实桔皮素是潜在的Akt抑制剂，能够直接与Akt结合。
综合上述一系列实验(实施例1～4)的实施，最终得出结论：桔皮素可以防治脓毒症引起认知功能障碍，其方式通过抑制小胶质细胞活化，减少海马区的神经炎症反应。桔皮素能抑制小胶质细胞的Akt信号通路，减少脓毒症状态下小胶质细胞的炎症反应，改善脓毒症引起的认知功能障碍。
小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，占所有神经胶质细胞的10％-15％，参与免疫防御与神经修复，是神经系统的重要组成部分。过度活化的小胶质细胞会引起细胞表达黏附因子，募集白细胞与血小板，活性氧产生增多，炎症因子和炎症介质的生成与分泌不仅会损伤神经元自身，还会导致神经元能量代谢紊乱以及血脑屏障功能障碍。桔皮素在以上动物实验中表现出良好的抑制小胶质炎症，减少神经炎症条件下神经元的损伤的效果，实验动物认知功能障碍的情况改善。因此，桔皮素在预防由神经炎症以及小胶质细胞过度活化引起的认知功能障碍有很好的应用前景，为脓毒症或脓毒症脑病的预防和治疗开辟新的医药途径。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.桔皮素在制备改善脓毒症导致的认知功能障碍的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善脓毒症导致的认知功能障碍包括改善脓毒症早期的神经反射、降低海马组织及血清中的炎症因子、减少小胶质细胞活化、减少小胶质细胞产生的炎症因子和改善学习记忆功能。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述减少小胶质细胞活化为通过抑制Akt信号通路减少小胶质细胞活化。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制Akt信号通路为桔皮素与Akt稳定结合，并且其结合力为中等强度。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述桔皮素与Akt稳定结合具体为桔皮素与所述Akt的LYS-160形成氢键连接。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述海马组织及血清中的炎症因子包括TNFα、IL-6和IL-1β。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小胶质细胞产生的炎症因子包括TNFα与IL-6。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1318371A (zh) * 2000-02-25 2001-10-24 Basf公司 黄酮的新用途
KR20140144785A (ko) * 2013-06-11 2014-12-22 한국식품연구원 유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물
KR102015221B1 (ko) * 2018-05-14 2019-08-27 경희대학교 산학협력단 탄게레틴을 유효성분으로 포함하는 외상 후 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1318371A (zh) * 2000-02-25 2001-10-24 Basf公司 黄酮的新用途
KR20140144785A (ko) * 2013-06-11 2014-12-22 한국식품연구원 유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물
KR102015221B1 (ko) * 2018-05-14 2019-08-27 경희대학교 산학협력단 탄게레틴을 유효성분으로 포함하는 외상 후 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIN CHEN: "Tangeretin prevents cognitive deficit in delirium through activating RORα/γ-E4BP4 axis in mice", BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 205, no. 115286, pages 1 - 11 *
SHIROORKAR PREDEEPKUMAR NARAYANAPPA: "Cardioprotective E ect of Tangeretin by Inhibiting PTEN/AKT/mTOR Axis in Experimental Sepsis-Induced Myocardial Dysfunction", MOLECULES, vol. 25, no. 235623, pages 1 - 13 *

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