CN116263446A - 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 - Google Patents
一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116263446A CN116263446A CN202111532486.XA CN202111532486A CN116263446A CN 116263446 A CN116263446 A CN 116263446A CN 202111532486 A CN202111532486 A CN 202111532486A CN 116263446 A CN116263446 A CN 116263446A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phase
- dimensional
- unsaturated fatty
- purification
- fatty acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 50
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000001323 two-dimensional chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 35
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 235000021354 omega 7 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 68
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 56
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 claims description 28
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 claims description 13
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 claims description 13
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 8
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 claims description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000923 (C1-C30) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 claims description 3
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- MOTRZVVGCFFABN-UHFFFAOYSA-N hexane;2-propan-2-yloxypropane Chemical compound CCCCCC.CC(C)OC(C)C MOTRZVVGCFFABN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000199 molecular distillation Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000034530 PLAA-associated neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/14—Preparation by elimination of some components
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于正相‑反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法，小孔径硅胶在正相模式下具有增强不饱和脂肪酸的保留和分离选择性的特性，并且与反相模式形成良好的正交性。利用这一特性，采用小孔径硅胶，对含有ω‑3，ω‑6和ω‑7等不饱和脂肪酸的原料(如藻油，鱼油，植物油等)进行正相一维纯化，收集一维馏分处理后，采用反相色谱进行二维纯化，获得高纯目标不饱和脂肪酸。该方法能够发挥正相和反相色谱的正交性的优势，能够从纯度较低的藻油等原料中制备得到高纯度不饱和脂肪酸纯化产品。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离领域，具体而言，本发明涉及一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法。
背景技术
不饱和脂肪酸根据第一个双键的位置可分为ω-3系、ω-6系、ω-7系等。其中ω-3不饱和脂肪酸有α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等，ω-6有亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)，ω-7有棕榈油酸(PLA)等。不饱和脂肪酸对人体有重要的生理功能：如α-亚麻酸(ALA)为人体必需脂肪酸，除参与构成人体细胞膜和组织的成分外，在抗癌、抗炎、改善脂质代谢和降血脂以及预防糖尿病等方面起着非常重要的作用；二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有调节血脂、抗炎的功能，DHA还具有促进脑细胞生长、发育，改善大脑机能，提高记忆力和学习能力以及防治老年痴呆等提高生命质量的功能。
不饱和脂肪酸广泛存在于植物、鱼类及藻类生物中，纯化方法主要有有机溶剂低温结晶法、尿素包合法、超临界流体萃取、银离子络合法、分子蒸馏法等。其中低温结晶法虽然操作简单但是分离效果差，溶剂消耗大；分子蒸馏对设备要求高且不能分离分子量与目标不饱和脂肪酸相近的杂质；银离子络合法分离效果很好但是存在离子脱落，影响产品质量；虽然纯化方法很多，各有弊端，且不能得到高纯的不饱和脂肪酸产品。尽管有专利(CN108250066A)提出了一种高效液相色谱法纯化ω-3不饱和脂肪酸，但是该方法原料的不饱和脂肪酸纯度需要大于60％，对原料纯度要求高。
发明内容
本发明在于提供一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法，本方法利用小孔径硅胶在正相中对不饱和脂肪酸保留强分离选择性好的特点，同时结合与反相色谱选择性互补的优势，能有效去除杂质，从不饱和脂肪酸纯度较低的原料中(如藻油等)获得高纯产品。
为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：正相一维采用小孔径硅胶填料填充的色谱柱进行分离纯化，采用有机溶剂作为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到一维纯化产品；小孔径硅胶填料的孔径为1-5nm；将一维产品溶解后进行反相二维纯化，采用有机相和水为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到目标不饱和脂肪酸产品；所述的一维正相色谱柱采用小孔径硅胶填料粒径为1-200μm。
所述的一维正相流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或几种组合。
所述的溶解样品的试剂为初始流动相。
所述的二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1～C30烷基或苯基中的一种或几种；填料粒径为1～200μm。所述的二维反相流动相为甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，水的一种或几种组合，其中有机溶剂体积比例大于70％。
所述的上样量为装填填料质量的0.2％-30％。
所述的洗脱速度0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min。
所述的转酯化过程为不饱和脂肪酸原料加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯。
本发明所述一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
将不饱和脂肪酸原料加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯；
取适量上述转酯化后的原料，初始流动相溶解后上样到小孔径硅胶柱上经洗脱，按时间收集馏分，将每个馏分分析再合并处理合格馏分得到一维纯化产品。一维纯化产品初始流动相溶解后上样到二维反相纯化，按时间收集馏分，每个馏分分析再合并处理合格馏分得到高纯目标不饱和脂肪酸产品。小孔径硅胶柱内径为2-800mm，填料孔径为1-5nm，粒径为1-200μm；一维正相流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或几种组合；二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或几种；反相柱径为2-800mm，填料粒径为1～200μm；二维反相流动相为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水的一种或几种组合，其中有机溶剂体积比例大于70％；上样量为装填填料质量的0.2％-30％；洗脱速度为0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min；收集目标分流出到结束的所有馏分。
该方法能够发挥正相和反相色谱的正交性的优势，能够从纯度较低的藻油等原料中制备得到高纯度不饱和脂肪酸纯化产品。
本发明的优点
(1)选用了小孔径硅胶，其在正相模式对不饱和脂肪酸保留强，与杂质的分离选择性好。
(2)充分发挥正相和反相选择性互补，能够从低纯度的复杂样品中制备得到高纯产品。
(3)该方法适用性广，可用于不同不饱和脂肪酸来源的纯化获得高纯产品。
附图说明
图1 PLA藻油粗品色谱图。
图2 PLA一维制备图谱。
图3 PLA一维纯化产品液相色谱图。
图4 PLA一维制备图谱。
图5 PLA二维纯化产品相色谱图。
图6 PLA藻油样品在小孔径硅胶和C18上的保留色谱图。
图7 PLA藻油在小孔径硅胶和常规硅胶上保留色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
分离纯化前，于10mg不饱和脂肪酸原料(分别为：PLA藻油、EPA鱼油)中加入50mL含有体积百分数5％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，80℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯；白土脱色后作为样品进行正相一维色谱柱分离纯化。
实施例1：PLA藻油粗品纯化
取经转酯化及脱色后的PLA藻油样品(纯度9.4％，如图1)1532.2mg(体积1.6mL)，加入1.4mL体积浓度2.5％异丙醚的正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品510.7mg的样品溶液，一维制备色谱条件如下：
色谱柱：小孔径硅胶色谱柱(孔径：2nm)
规格：10×150mm(直径×长度，下同)，2μm(填料粒径，下同)
流动相：A：体积浓度2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：2mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：340μL
上样量(样品质量与填料质量比)：2％
按上述条件进行高效液相色谱一维制备，图2一维制备色谱图。收集42-90min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，氮气吹干各个馏分并用流动相复溶进行色谱分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并50-68min含有PLA的馏分纯干处理得一维产品，进行纯度分析，如图3所示。取一维所得样品80mg(约100uL)，加215uL体积浓度90％甲醇水溶液溶解完全后过滤，得255.5mg/mL的样品溶液。二维制备色谱条件如下：
色谱柱：C18(硅胶表面键合烷基链长为C18)
规格：4.6×250mm(直径×长度，下同)，10μm(填料粒径，下同)
流动相：A:体积浓度90％甲醇水
洗脱：A：100％
流速：0.3mL/min；
检测波长：UV 210nm；
进样体积：200μL；
上样量(样品质量与填料质量比)：1.01％
按上述条件进行高效液相色谱二维制备，图4二维制备色谱图。收集80-120min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，色谱法进行馏分分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并86-114min含有PLA的馏分干(除流动相)处理得二维产品，进行纯度分析，如图5所示。得到液相纯度大于98％，两维纯化整体收率80％。
实施例2：PLA藻油粗品纯化
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：
色谱柱：C8(硅胶表面键合烷基链长为C8)
规格：4.6×250mm，10μm
流动相：A：80％甲醇水
洗脱：A：100％
流速：0.3mL/min；
检测波长：UV 210nm；
进样体积：200μL；
上样量：0.8％
按上述条件进行高效液相色谱二维制备，收集69-111min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，馏分进行色谱分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并86-114min馏分吹干(除流动相)处理得二维产品，合并76-91min含有PLA的馏分纯干处理得二维产品，进行纯度分析，得到液相纯度大于98％，二维纯化整体收率80％。
实施例3：EPA鱼油样品纯化
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：样品为EPA鱼油，取530.1mg(体积0.4)，加入0.6mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品530.1mg的样品溶液，上样量2％。纯化后得到纯度大于98％的EPA高纯产品，二维纯化整体收率87％。
实施例4：PLA藻油在小孔径硅胶柱与反相C18柱上的保留
取PLA藻油样品50mg，加5mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，色谱条件：
色谱柱：小孔径硅胶色谱柱(孔径：2nm)
规格：4.6×100mm，2μm
流动相：A：2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图6a，主要不饱和脂肪酸出峰顺序为EPA，PLA和ARA。
另取PLA藻油样品50mg，加5mL 90％甲醇水溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，一维制备色谱条件如下：
色谱柱：C18(硅胶表面键合烷基链长为C18)
规格：4.6×250mm，5μm
流动相：A：90％甲醇水；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图6b，主要不饱和脂肪酸出峰顺序为PLA，ARA和EPA。比较图6a和b，主要不饱和脂肪酸的出峰顺序和选择性完全不一样，呈现出非常好的正交性。
实施例5：小孔径硅胶和常规硅胶对不饱和脂肪酸的保留
取PLA藻油样品50mg，加5mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，色谱条件：
色谱柱分别为：小孔径硅胶柱(孔径2nm)
常规硅胶柱(孔径10nm)
规格：4.6×100mm，2μm
流动相：A：2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图7，主要不饱和脂肪酸出峰顺序一致，相同条件下小孔径硅胶对各不饱和脂肪酸的保留和选择性均大于常规硅胶，孔径10nm的硅胶相同方法制备PLA产品液相纯度仅79％，而小孔径硅胶纯化的PLA产品纯度大于98％,小孔径硅胶具有明显的制备优势。
Claims (10)
1.一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法，其特征在于：
1)正相一维采用小孔径硅胶填料填充的色谱柱进行分离纯化，采用有机溶剂作为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到一维纯化产品；小孔径硅胶填料的孔径为1-5nm；
2)将一维产品溶解后进行反相二维纯化，采用有机相和水为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到目标不饱和脂肪酸产品；
二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料中的一种或二种以上，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或二种以上。
2.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：一维正相色谱柱采用小孔径硅胶填料，粒径为1-200μm。
3.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：有机溶剂流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或二种以上组合。
4.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：对含有ω-3、ω-6和ω-7等中的一种或二种以上不饱和脂肪酸的原料进行正相一维纯化，优选分离纯化的样品原料为藻油、鱼油、植物油中的一种或二种以上；
所需不饱和脂肪酸为ω-3、ω-6或ω-7等中的一种或二种以上不饱和脂肪酸，其中ω-3为α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的一种或二种以上，ω-6为亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)中的一种或二种，ω-7为棕榈油酸(PLA)。
5.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：
采用进行正相一维纯化的初始流动相溶解原料后进行正相一维纯化上样。
采用进行反相二维纯化的初始流动相溶解一维产品后进行反相二维纯化上样。
6.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于，二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或几种；填料粒径为1-200μm。
7.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于，二维反相流动相为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水的一种或二种以上组合，其中有机相体积比例大于70％。
8.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：正相和/或反相纯化过程的上样量为色谱柱装填填料质量的0.2％-30％。
9.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：正相和/或反相纯化过程的洗脱速度0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min。
10.按照权利要求1或4所述纯化方法，其特征在于，分离纯化前，于不饱和脂肪酸原料中加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应2-8小时，得不饱和脂肪酸乙酯；然后再进行正相一维色谱柱分离纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111532486.XA CN116263446A (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111532486.XA CN116263446A (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116263446A true CN116263446A (zh) | 2023-06-16 |
Family
ID=86723523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111532486.XA Pending CN116263446A (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116263446A (zh) |
-
2021
- 2021-12-15 CN CN202111532486.XA patent/CN116263446A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0697034B1 (en) | Processes for chromatographic fractionation of fatty acids and their derivatives | |
| US6313330B1 (en) | Processes of selectively separating and purifying eicosapentaenoic and docoshexaenoic acids or their esters | |
| EP3029021A1 (en) | Method for separating fat-soluble material by simulated moving bed chromatography, and device for same | |
| CN104529772B (zh) | 一种模拟移动床色谱制备高纯度epa酯和dha酯单体的方法 | |
| Guil-Guerrero et al. | Purification process for cod liver oil polyunsaturated fatty acids | |
| KR102289886B1 (ko) | 고도 불포화된 지방산의 제조를 위한 크로마토그래피 방법 | |
| CN107261557B (zh) | 多步分离方法 | |
| BR112014000147B1 (pt) | processo de separação cromatográfica, produto de pufa | |
| Guil-Guerrero et al. | γ-Linolenic acid purification from seed oil sources by argentated silica gel chromatography column | |
| BR112014000162B1 (pt) | processo de separação cromatográfica | |
| KR102289238B1 (ko) | 지방산의 크로마토그래피 정제 방법 | |
| EP2613859A1 (en) | Heated chromatographic separation process | |
| CN108181395B (zh) | 一种采用高效液相色谱在线检测鱼油中甘油三酯成分的方法 | |
| KR102289237B1 (ko) | 크로마토그래피 방법에 의한 지방산 정제 | |
| CN116263446A (zh) | 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 | |
| JPS61192797A (ja) | 高度不飽和酸の濃縮方法 | |
| Guo et al. | Purification of α-linolenic acid from flaxseed oil by silver-silica gel chromatography column | |
| JPH01180849A (ja) | ドコサペンタエン酸またはそのエステルの濃縮分離方法 | |
| CN116478035A (zh) | 一种高纯度不饱和脂肪酸的制备方法 | |
| Van der Meeren et al. | PREPARAT I VE HI GH-PERF ORMAN CE LIQUID CHROMATOGRAPHY OF LIPIDS | |
| JP2015030685A (ja) | 逆相カラムを用いる擬似移動層クロマトグラフィーによる脂溶性物質の分離法およびそのための装置 | |
| WO2020260376A1 (en) | An extract of persea | |
| Yin et al. | Comprehensive Evaluation of Three Different Chromatographic Techniques for the Preparation of High Purity DHA-EE | |
| JP2015031538A (ja) | 順相カラムを用いる擬似移動層クロマトグラフィーによる脂溶性物質の分離法およびそのための装置 | |
| Guo et al. | Notice of Retraction: Preparation of High-Purity Essential Linoleic Acid from Safflower Seed Oil by Argentated Silica Gel Chromatography Column |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |