CN116254189A - 一种利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸的方法 - Google Patents

一种利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明提供一种利用拜氏梭菌BRM001半固态发酵油菜秸秆产丁酸与菌体蛋白的方法。丁酸产量高且消除了秸秆水解液脱毒的需要，且充分利用了发酵废渣的价值，不产生二次污染，使得整个工艺更加绿色、经济。本发明利用拜氏梭菌，采用油菜秸秆半固态发酵生产丁酸与菌体蛋白，不仅提高了秸秆资源的利用率，同时本发明使用拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001生产丁酸和菌体蛋白的生产方式降低了微生物发酵法产丁酸和饲料蛋白成本，有着良好的经济效益和社会应用前景。

Description

一种利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
油菜是我国的主要油料作物之一，种植面积居世界首位，这意味着我国有着丰富的油菜秸秆资源。目前，油菜秸秆的处置方式很大比例被自然降解，因此探究优质高效的秸秆资源综合利用方法成为一个热点话题。
丁酸(CH3CH2CH2COOH)是一种短链挥发性脂肪酸，在化学、食品、制药、能源和动物饲料工业中有重要应用。目前，丁酸的生产主要有化学合成和微生物发酵两种方法，但是微生物发酵法产丁酸的成本较高，因此丁酸的生产主要是通过化学合成法获得。然而，微生物发酵法相较于化学合成法在环境保护、资源再利用等方面更具优势，更符合可持续发展战略，并且人们对有机食品的偏爱也使得生物源丁酸更适用于食品、医药和饲料行业。但是目前微生物发酵法产丁酸还存在丁酸产量较低，底物成本高等问题，致使其无法满足工业化要求。因此，如何提高丁酸产量并降低发酵生产成本已经成为微生物发酵法产丁酸能否工业化的先决条件。随着发酵底物成本的增加，利用可再生生物质发酵生产可持续和成本效益高的丁酸引起了学术界和工业界越来越多的兴趣。秸秆纤维素生物质被认为是一种环境友好的可持续和成本效益高的发酵丁酸原料，但由于秸秆水解物中部分成分对发酵生产丁酸具有抑制作用，发酵前需要对秸秆水解液进行脱毒处理，从而增加整个工艺的成本。目前，运用基因改造工程菌、微波辅助酸预处理秸秆、借助纤维素床生化反应器等设备发酵秸秆生产丁酸等研究克服了上述缺点，但也产生了引进设备成本高等缺点。因此，考虑到发酵过程成本，筛选能够利用秸秆水解液的高产丁酸菌成为必要。
微生物利用秸秆水解液中的糖类作为底物，液态发酵生产丁酸，而水解后的秸秆渣将会对环境造成二次污染。目前用秸秆发酵生产菌体蛋白的研究已比较广泛，可考虑将其产菌体蛋白运用于畜牧行业，综合考虑微生物发酵生产丁酸的成本及油菜秸秆高值化的基础上，微生物发酵油菜秸秆生产丁酸与饲用菌体蛋白的生产工艺等都需要进一步研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001半固态发酵油菜秸秆产丁酸与菌体蛋白的方法。丁酸产量高且消除了秸秆水解液脱毒的需要，且充分利用了发酵废渣的价值，不产生二次污染，使得整个工艺更加绿色、经济。
本发明的第一个目的是提供一株能够发酵油菜秸秆糖化液生产丁酸和菌体蛋白的一种拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001，所述拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62710，保藏日期为2022年08月18日。
所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001是从四川省某名优酒厂窖泥样品中分离得到，该菌株经测序分析，测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树。经过对BRM001菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定菌株为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，且命名为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001。
所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001菌株形态：将所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001接种在RCM琼脂平板中，35℃培养18h，观察菌株菌落形态，可见菌株BRM001的菌落中等，边缘不齐，中间白色凸起，在光学显微镜下，放大100倍观察菌株BRM001，菌体呈长杆状，菌体长杆状，中生芽孢，显示为革兰氏阳性菌。
本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001或其发酵液，或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001在微生物菌剂中的添加量：拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的OD600值至少为1.2。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态制剂或液态制剂。
本发明的第三个目的是提供一种产品，所述产品中含有上述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001在微生物菌剂中的添加量：拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的OD600值至少为1.2。
本发明的第四个目的是提供上述拜氏梭菌BRM001或上述微生物菌剂或上述产品在制备丁酸中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种同步发酵生产丁酸和蛋白饲料的方法，所述方法是将拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001或上述微生物菌剂或上述产品在液态或半固态条件下发酵油菜秸秆生产丁酸和菌体蛋白，所述方法为：将上述(Clostridiumbeijerinckii)拜氏梭菌BRM001或上述微生物菌剂或上述产品添加至以秸秆糖化物为唯一碳源的发酵体系中，发酵制备得到发酵液，从发酵液中提取得到丁酸、菌体蛋白。所述秸秆糖化物为，向经预处理后的油菜秸秆中添加纤维素酶、柠檬酸缓冲液，静置48～72h后得到的。
所述菌体蛋白为：是指利用各种基质大规模培养细菌、真菌等微生物而获得的由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸以及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团，是一种由微生物(包括酵母、细菌、藻类和真菌)细胞内获得的蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，所述秸秆糖化物的制备方法为：向经预处理后的油菜秸秆中添加诺维信纤维素酶Cellic CTec3 HS(酶活为1000BHU-2-HS/g)0.05％～0.2％(酶活50～200BHU-2-HS)，添加pH 4.5～5.0的柠檬酸缓冲液，20～30℃恒温静置产酶48～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系包括：还原糖含量5～30g/L的秸秆糖化物1L、氯化钠0.5～1g/L、酵母粉0.5～1g/L、磷酸二氢钾0.2～1g/L、磷酸氢二钾0.2～1g/L、乙酸铵5～15g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.2～1.0g/L、营养液50～100ml/L、金属离子母液5～10ml/L。
所述营养液包括：维生素B6 0.05g/L、维生素B1 0.05g/L、维生素B2 0.05g/L、烟酸0.05g/L、生物素0.05g/L、叶酸0.05g/L、丝氨酸5g/L、色氨酸5g/L、L-谷氨酸5g/L、D-谷氨酸2.5g/L、无水乙醇20ml/L。
所述金属离子母液包括：氯化锌0.35g/L、氯化铁0.92g/L、氯化锰0.17g/L、氯化铜0.012g/L、氯化钾88.5g/L、氯化钠8.94g/L、氯化镁60.23g/L、氯化钙3.48g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述秸秆糖化物的前处理方法为，将产酶后的秸秆糖化物中的残渣过滤后，取澄清的上清液添加至发酵体系中(液态发酵)；或直接将含有残渣的产酶后的秸秆糖化物添加至发酵体系中(半固态发酵)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为，在32～37℃下发酵6～7d；
在本发明的一种实施方式中，发酵后的体系中即含有丁酸和菌体蛋白，将发酵产物过滤，液体产物为丁酸，固态物质烘干、粉碎，即得到菌体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，在秸秆糖化物的制备中，柠檬酸缓冲液的添加量为0.008～0.05mol/L，油菜秸秆与柠檬酸缓冲液的比为1～3:100(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，油菜秸秆预处理与酶解过程中所用水均为自来水。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的初始pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的添加量为5％～10％，按照5％～10％的量添加菌浓为OD600值至少为1.2。
在本发明的一种实施方式中，所述油菜秸秆预处理即将油菜秸秆烘干粉碎，利用体积分数为1.0％～1.5％的NaOH溶液在20～50℃下处理水稻秸秆粉末24～72h，结束后用水清洗并烘干。
有益效果
(1)本发明从窖泥中筛选到一株拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001，本发明将此菌株应用于利用油菜秸秆半固态发酵生产丁酸与菌体蛋白。
(2)本发明将所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001添加至半固态培养基中，发酵生产丁酸与菌体蛋白的方法，与传统液态发酵木质纤维素生产丁酸相比，丁酸产量高且消除了秸秆水解液脱毒的需要，且充分利用了发酵废渣的价值，不产生二次污染，使得整个工艺更加绿色、经济。发酵后固态物质中真蛋白含量也较未发酵前有显著提升，比原油菜秸秆提升了4.89倍，且发酵后的饲料菌体蛋白酸溶性蛋白含量较高，酸溶蛋白是由小分子肽和游离氨基酸等较低蛋白水解物组成，能被动物肠道直接吸收利用，它大致决定了饲料在动物体内的消化率，大幅度改善了秸秆饲料的营养品质。
(3)采用油菜秸秆半固态发酵生产丁酸与菌体蛋白，不仅提高了秸秆资源的利用率，同时本发明使用拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001生产丁酸和菌体蛋白的生产方式降低了微生物发酵法产丁酸和饲料蛋白成本，有着良好的经济效益和社会应用前景。
生物材料保藏
一株拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001，分类学命名为：Clostridiumbeijerinckii，已于2022年08月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62710，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：利用油菜秸秆糖化液产丁酸菌株初筛图。
图2：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的菌落形态图。
图3：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的镜检图。
图4：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的系统进化树图。
图5：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的生长曲线图。
图6：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的酒精度耐受性图。
图7：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的pH耐受性图。
图8：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的最适温度图。
图9：本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的丁酸耐受性图。
图10:本发明中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的乙酸耐受性图。
图11：本发明中制备油菜秸秆糖化液过程中酶解时间对产糖量的影响图。
图12：本发明中制备油菜秸秆糖化液过程中诺维信酶添加量对比产糖量的影响图。
图13：本发明中制备油菜秸秆糖化液过程中柠檬酸缓冲液浓度对产糖量的影响图。
图14：本发明中制备油菜秸秆糖化液过程中最终预处理、酶解条件图。
图15：本发明中发酵形式对丁酸产量的影响图。
图16：本发明中秸秆添加量对丁酸的产量影响图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
关于术语的解释：
本发明所涉及的菌体蛋白为：是指利用各种基质大规模培养细菌、真菌等微生物而获得的由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸以及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团，是一种由微生物(包括酵母、细菌、藻类和真菌)细胞内获得的蛋白质。
本发明所涉及的真蛋白为：真蛋白是指除去非蛋白质氮以外的蛋白氮所计算得到的蛋白。
本发明所涉及的酸溶性蛋白为：酸溶蛋白是分子量相对较低的蛋白水解物，包括小肽和游离氨基酸，可以溶于酸性溶液的蛋白，能被动物肠道直接吸收利用，它大致决定了饲料在动物体内的消化率。
下述实施例中所涉及的诺维信纤维素酶购自诺维信生物技术有限公司，产品型号为Cellic CTec3 HS。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
RCM斜面培养基(RCM固体培养基)(每1000mL)：葡萄糖5g，氯化钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，乙酸钠3g，牛肉膏10g，可溶性淀粉1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
RCM活化培养基(RCM液体培养基)(每1000mL)：葡萄糖5g，氯化钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，乙酸钠3g，牛肉膏10g，可溶性淀粉1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH 6.8，121℃灭菌20min。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
丁酸含量的检测：
将拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001菌株接种到发酵培养基中在35℃培养箱中静置7d，发酵结束后，用一次性的注射器吸取适量发酵液过0.2μm微孔滤膜；并取1mL装于进样瓶采用外标法通过GC/MS进行定性定量分析。测定BRM001在发酵产丁酸的情况。每个样品做三个重复。
气相色谱条件：DB-WAX UI谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，程序升温40℃保持1min，以20℃/min升高至150℃，再以10℃升高至250℃保持2min。分流比30:1，载气为氦气(He)，流速1mL/min，氢气(H2)40mL/min，氧气(O2)300mL/min，检测器为火焰离子检测器。
质谱条件：电子电离源，传输线温度250℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为30～350amu。
粗蛋白含量测定：
使用K9840自动凯氏定氮仪，采用半自动凯氏定氮法，按照国标GB/T 6432-2018测定样品中粗蛋白含量。具体方法如下：
样品制备：将烘干到恒重的发酵废渣用小型粉碎机粉碎，过0.42mm筛子，混匀，装入密闭干燥容器中备用。样品消煮：准确称取0.5g样品(含氮量在5-80mg，精确到0.0001g)，放入提前洗净、烘干的消煮管中，加入适量混合催化剂(称取0.3-0.4g五水硫酸铜和3-4g的硫酸钾或硫酸钠)，用移液枪取10-12mL的硫酸，开始于230℃加热30min，待试样焦化，再升温到350℃加热30min，泡沫消失后，最后于420℃加热消化60-100min直至消化液呈透亮的蓝绿色，取出消化管，冷却至室温。
氨的蒸馏：将上面冷却的消煮管插在凯氏定氮仪的蒸馏装置上，以2％硼酸溶液作为吸收液，40％ NaOH溶液进行蒸馏。直至流出液的pH值为中性。设置蒸馏参数为：稀释体积10mL，硼酸体积25mL，氢氧化钠体积60mL，淋洗体积10mL。蒸馏结束后，将冷凝管末端残留在管子的流出液弹出，取出装有流出液的锥形瓶，待测。
滴定：用无水碳酸钠试剂按国标GBT 601-2016标定配制的0.1mol/L盐酸溶液。用标定过的盐酸标准滴定液滴定流出液，溶液从蓝绿色变为灰红色，即为终点，读数，记录消耗标准盐酸溶液的体积。同时做空白测定，计算粗蛋白含量。
真蛋白含量测定：
真蛋白是指除去非蛋白质氮以外的蛋白氮所计算得到的蛋白。在测蛋白之前对样品进行前处理洗去非蛋白氮，然后按照测粗蛋白的方法测定蛋白质，所得到的就是真蛋白含量。
准确称取0.5-1g样品(精确到0.0001g)装入250mL锥形瓶，加入75mL沸水，继续电炉加热煮沸15-30min，边煮边间歇摇匀防止糊底，分别依次加入20mL的2.5％NaOH溶液和20mL的10％硫酸铜溶液，摇匀，再微沸一段时间，取下冷却2h以上或过夜，用定性滤纸过滤，热水冲洗沉淀5次以上，热水最好70-80℃有助于洗脱，可滴加5滴10g/L氯化钡溶液和1滴2mol/L盐酸溶液检查烧杯中的滤液,至不产生白色沉淀为止，将剩余沉淀和滤纸一起放入60-70℃烘箱烘干，用测粗蛋白方法测蛋白，即得真蛋白，以空白定性滤纸做对照。
酸溶蛋白的测定：
参照标准NY/T 3801-2020(饲料原料中酸溶蛋白的测定)提取酸溶性蛋白，加入15％的TCA(三氯乙酸)溶液振荡提取过滤，再对滤液用测粗蛋白方法测蛋白，即得酸溶蛋白。
还原糖含量的测定
即取酶解液5mL于离心管中，6 000r/min离心5min，取上清液0.5mL，加入1.5mL柠檬酸缓冲液(0.05mol/L,pH 4.8)，3mL DNS溶液，置于沸水浴10min，冷却，定容至25mL(采用蒸馏水定容)，540nm分光光度计测OD值。
实施例1：菌株的筛选
1、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的分离和筛选
采用五点采样法采集了中国四川省某名优酒厂的窖泥样品。每点各取50g左右窖泥，混匀后装于塑封袋内，迅速置于冰盒内运回。称取窖泥样品10g，加入盛有100mL无菌水及10粒玻璃珠(Φ＝3mm)的三角瓶中，25℃，200r/min，振荡20min。
将窖泥悬浮液于80℃水浴10min杀死营养体细胞，分别接种体积分数5％于除氧灭菌后的富集培养基中，富集培养基含有以下物质(每1000mL)：葡萄糖5g，氯化钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，乙酸钠3g，牛肉膏10g，可溶性淀粉1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH6.8，121℃灭菌20min。在35℃下培养4天。然后吮吸200μL窖泥培养液，涂在固体板上，放入厌氧瓶中，35℃培养至菌落生长。选择在平板上生长的单个菌落，并在固体平板上划线三次。
将单个菌落接种于100mL厌氧瓶中，35℃厌氧培养12小时，培养2代，获得种子液。将种子液接种到接种量为5％的发酵培养基中，发酵培养基含有以下物质(每1000mL)：秸秆水解液(含还原糖5g/L)1L，氯化钠5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，乙酸钠3g，牛肉膏10g，可溶性淀粉1g，L-半胱氨酸盐0.5g，pH 6.8，121℃灭菌20min，无水乙醇1％、生物素0.0005g过滤除菌后加入。35℃厌氧静培养7天。发酵结束测其丁酸产量(图1)，以丁酸产量作为复筛指标，最终筛选出一株利用油菜秸秆糖化液高产丁酸的菌株，将其命名为BRM001。
2、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的鉴定
(1)菌株形态、培养特征观察
将步骤1复筛获得的丁酸产率最高的菌株接种在RCM琼脂平板中，35℃培养18h，观察菌株菌落形态可见菌株BRM001的菌落，菌落中等，边缘不齐，中间白色凸起(图2)，在光学显微镜下(图3)，放大100倍观察菌株BRM001，菌体呈长杆状，产芽孢，显示为革兰氏阳性菌。
(2)生理生化特性测定
生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏系统细菌学手册》进行，生理生化实验结果如表1所示。
表1生理生化鉴定结果
Figure BDA0003927690270000081
注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。
(3)菌株分子生物学鉴定及其系统发育树的构建
1)DNA的提取
将纯化后不同形态的单菌落接种至液体发酵培养基中，35℃培养7d，吸取2mL培养液于无菌离心管中，13000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀(共2～3次)。菌体沉淀使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并按操作步骤提取基因组DNA。
2)PCR扩增及系统发育树的构建
将步骤1)得到的DNA溶液作为扩增模板，采用细菌通用引物27F-1492R进行PCR扩增；PCR扩增体系为：5×Buffer(含Mg2+)10μL，200μmol/LdNTPs 1μL，正反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶1μL，模板DNA 3μL，加无菌水补足至50μL；扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物在南京派森诺基因技术有限公司测序。测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树。基于16SrDNA的系统发育进化树如图4所示。经测序鉴定，菌株BRM001的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
经过对BRM001菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定BRM001为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，且命名为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001。
实施例2：拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001生长特性测定
1、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的生长曲线测定
(1)将实施例1制备得到的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001接种至RCM活化/液体培养基中，在35℃条件下静置发酵12h，制备得到种子液；
将上述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液按5％(v/v)的接种量接种于RCM液体培养基中，置厌氧工作站中35℃培养，每8h取样，于600nm处测其OD值，空白对照为未接种菌株的RCM液体培养基。
结果如图5所示，该菌0-8h生长较为缓慢，处于生长延滞期，而8-32h快速增长，处于对数生长期，此后菌株生长较为平缓，进入稳定期。
2、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的酒精耐受性检测
将步骤1中的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液以5％(v/v)的接种量接种至在RCM液体培养基中，分别添加乙醇0％vol、2％vol、4％vol、6％vol、8％vol、10％vol、12％vol、14％vol后，在35℃的培养箱中厌氧培养36h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，验证拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的酒精耐受性。
结果如图6所示，当乙醇浓度在10％以上时，菌株生长受到明显抑制，几乎无法生长。当酒精浓度低于10％时，随着酒精浓度降低，菌株OD值逐渐增加，且该菌的最大耐酒精浓度为10％，具备一定的耐酒精能力。白酒糟醅的酒精浓度一般不超过10％vol，因此拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001在白酒糟醅中均具有一定生存能力。
可见，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001具备一定的耐酒精能力，能够耐受白酒发酵环境。
3、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的pH耐受性
将步骤1中的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液接种至RCM液体培养基上，分别调节培养基的pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0后，在35℃培养箱中厌氧培养36h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，验证拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的pH耐受性。
结果如图7所示，当pH值为4～7时，菌株均能获得较好生长，随着pH值增加，菌株生长呈先增后降趋势，当pH值为7时，菌株生长最好，且最高最低耐受分别为9和3。
4、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001最适温度的确定
将步骤1中的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液以5％(v/v)的接种量接种至在RCM液体培养基中，分别置于25、30、35、40、45、50℃、培养箱中厌氧培养36h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，以确定拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001的最适温度。
结果如图8所示，在25～50℃的温度范围内，拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001均能够有效生长。其中最适生长温度为35℃。拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001温度适应范围广，能广泛适应不同季节白酒发酵。
5、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的丁酸耐受性
将步骤1中的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液接种至RCM液体培养基上，分别添加丁酸10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L后，在35℃培养箱中厌氧培养36h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，考察拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的丁酸耐受性。
结果如图9所示，随着丁酸含量的增加，菌体浓度逐渐下降，但拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001在丁酸含量为50g/L时仍能有效生长，具有很好的丁酸耐受能力。
6、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的乙酸耐受性
将步骤1中的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液接种至RCM液体培养基上，分别添加丁酸10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L后，在35℃培养箱中厌氧培养36h后，分别测定OD600nm，以波长600nm处的OD值作为指标，考察拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)BRM001的乙酸耐受性。
结果如图10所示，随着乙酸含量的增加，菌体浓度逐渐下降，但拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001在乙酸含量为50g/L时仍能有效生长，具有很好的乙酸耐受能力。
实施例3：油菜秸秆糖化物的制备
具体步骤如下：
1、酶解时间的确定
取已烘干、粉碎至过20目筛的油菜秸秆称取10g置于150mL锥形瓶中，分别加入100mL 1.1％ NaOH(w/v)，密封，置于50℃环境中浸泡48h，置于滤袋中洗至中性，烘干至恒重。
将诺维信酶液按照质量分数为0.1％的添加量，添加到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH 4.8)中，得到混合酶液；
然后称取经上述预处理过程后烘干后的秸秆粉末1g，以固液比1：100的量加入混合酶液中，封口后置于50℃环境中静置12h、24h、36h、48h、60h后，取上清液用DNS法测还原糖含量，以还原糖产生量为指标衡量油菜秸秆酶解时间对产糖量的影响，结果如图10所示。
由图11所示，在1.1％ NaOH(w/v)，温度50℃，秸秆和NaOH按照固液比为1:10的预处理条件下，经初始酶解条件酶解后测其还原糖含量后可知，预处理秸秆比产糖量在0-48h内，随时间增加而增加，48h以后，随着时间的增加，浸泡时间对于秸秆的比产糖量影响不大。结合试验目的，后期选择48h作为后续试验酶解时间。
2、酶液添加量的确定
取已烘干、粉碎至过20目筛的油菜秸秆称取10g置于150mL锥形瓶中，分别加入100mL 1.1％ NaOH(w/v)，密封，置于50℃环境中浸泡48h，置于滤袋中洗至中性，烘干至恒重。
将诺维信酶液分别按照质量分数为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、1.2％、1.5％的添加量，添加到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH 4.8)中，得到混合酶液；
称取经上述预处理过程后烘干后的秸秆粉末1g，以固液比1：100的量加入到混合酶液，封口后置于50℃环境中静置48h后，取上清液用DNS法测还原糖含量，以还原糖产生量为指标衡量油菜秸秆酶解过程中酶液添加量对产糖量的影响，结果如图11所示。
由图12所示，在1.1％ NaOH(w/v)，温度50℃，秸秆和NaOH按照固液比为1:10的预处理条件下，在初始酶解条件下改变诺维信酶添加量，酶解48h后测其还原糖含量后可知，添加0.2％的酶液时效果最好，但与酶液添加量0.1％、0.5％、1％、1.5％差别不大，考虑到酶液成本问题，后续酶解试验诺维信酶液添加量为0.1％(w/v)。
3、酶解过程中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度的确定
取已烘干、粉碎至过20目筛的油菜秸秆称取10g置于150mL锥形瓶中，分别加入100mL 1.1％ NaOH(w/v)，密封，置于50℃环境中浸泡48h，置于滤袋中洗至中性，烘干至恒重。
分别将诺维信酶液按照质量分数为0.1％的添加量，添加到浓度为0mol/L、0.002mol/L、0.004mol/L、0.006mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)中，得到混合酶液；
称取经上述预处理过程后烘干后的秸秆粉末1g，以固液比1：100的量加入到混合酶液中，封口后置于50℃环境中静置48h后，取上清液用DNS法测还原糖含量，以还原糖产生量为指标衡量油菜秸秆酶解过程中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度对产糖量的影响。
由图13所示，在1.1％ NaOH(w/v)，温度50℃，秸秆和NaOH按照固液比为1:10的预处理条件下，诺维信酶添加量为0.1％(w/v)，改变柠檬酸缓冲液浓度，50℃酶解48h后，根据测其还原糖浓度结果可知，0-0.01mol/L区间内随着柠檬酸缓冲液浓度的增加，酶解效果越好，秸秆比产糖量越高，且到0.01mol/L时，达到峰值，超过0.01mol/L之后，随着柠檬酸缓冲液浓度的增加，酶解效果保持不变。
因此，后续试验选择0.01mol/L柠檬酸缓冲液作为酶解条件，且本研究所配柠檬酸缓冲液均用自来水配置，相比于同类研究中多数用蒸馏水配置柠檬酸缓冲液也节约了成本。
4、最终预处理、酶解条件的确定
考虑到预处理过程中需要在50℃环境中静置48h，酶解过程中也需要在50℃环境中酶解48h，并且用碱液预处理后需要用大量自来水冲洗至中性，这个过程中会消耗大量的水资源以及电力资源，为节约成本，本研究试探了预处理过后不冲洗直接酶解、预处理过后只用少量水淘洗一遍后烘干酶解、室温(25℃)预处理与酶解等研究，具体过程如下：具体实施方式同实例3中步骤5，区别在于选择0.01mol/L柠檬酸缓冲液作为酶解条件，将预处理过程中的温度由50℃改为25℃，将酶解过程中的50℃改为25℃，将预处理过程中从1.1％NaoH浸泡液中取出后用清水冲洗至中性(pH为7～8)改为从1.1％NaoH浸泡液中取出后不冲洗直接酶解、预处理过后只用少量水淘洗一遍(pH为12)。
结果见图14。
从图14可看出，预处理过后不水洗不烘干直接酶解效果最差，而预处理过后水洗至中性后再酶解与预处理后用少量水淘洗一边后烘干再酶解效果差不多，室温预处理、酶解与中高温预处理、酶解效果相近。
因此，最终确定秸秆水解物制备条件为：1.1％NaOH、室温(约25℃)，秸秆和NaOH按照固液比为1：10，浸泡48h，取出用自来水淘洗一遍烘干后，加诺维信酶0.1％，柠檬酸0.0.1mol/L，室温(约25℃)静置48h。相比于同类研究中，常温预处理、常温酶解节约了设备成本。
为了节约成本，最终确定油菜秸秆糖化物制备条件为：
(1)烘干粉碎至过20目筛的油菜秸秆10g置于150mL锥形瓶中，加入100mL1.1％NaOH(w/v)，密封，置于25℃环境中浸泡48h，取出用自来水淘洗一遍烘干后(此时pH值约为12)，烘干至恒重。
(2)将诺维信酶液按照质量分数为0.1％的添加量，添加到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH 4.8)中，得到混合酶液；
分别称取上述烘干处理后的秸粉末1g，以固液比为1：100的比例，将秸秆添加至上述混合酶液中，封口后置于25℃环境中静置48h，制备得到油菜秸秆糖化物。
实施例4：利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸与菌体蛋白
1、配制培养基
(1)液体发酵培养基(每1000mL)：实施例3最优条件制备得到的秸秆糖化物(前处理：将实施例3制备得到的秸秆糖化物过滤，取澄清糖化液，内含还原糖5g/L)1L，氯化钠0.9g/L、酵母粉1g/L、磷酸二氢钾0.7g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、乙酸铵10g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min，营养液50ml/L、金属离子母液5ml/L过滤除菌后加入。
营养液包括：维生素B6 0.05g/L、维生素B1 0.05g/L、维生素B2 0.05g/L、烟酸0.05g/L、生物素0.05g/L、叶酸0.05g/L、丝氨酸5g/L、色氨酸5g/L、L-谷氨酸5g/L、D-谷氨酸2.5g/L、无水乙醇20ml/L。
金属离子母液包括：氯化锌0.35g/L、氯化铁0.92g/L、氯化锰0.17g/L、氯化铜0.012g/L、氯化钾88.5g/L、氯化钠8.94g/L、氯化镁60.23g/L、氯化钙3.48g/L。
(2)半固态发酵培养基(每1000mL)：实施例3最优条件制备得到的含有残渣的产酶后的秸秆糖化物(含还原糖5g/L)1L，氯化钠0.9g/L、酵母粉1g/L、磷酸二氢钾0.7g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、乙酸铵10g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min，营养液50ml/L、金属离子母液5ml/L过滤除菌后加入。
营养液包括：维生素B6 0.05g/L、维生素B1 0.05g/L、维生素B2 0.05g/L、烟酸0.05g/L、生物素0.05g/L、叶酸0.05g/L、丝氨酸5g/L、色氨酸5g/L、L-谷氨酸5g/L、D-谷氨酸2.5g/L、无水乙醇20ml/L。
金属离子母液包括：氯化锌0.35g/L、氯化铁0.92g/L、氯化锰0.17g/L、氯化铜0.012g/L、氯化钾88.5g/L、氯化钠8.94g/L、氯化镁60.23g/L、氯化钙3.48g/L。
2、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001的活化
将已经保存的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001接种到RCM培养基斜面上，在35℃下培养24h，将活化好的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001接种到RCM活化培养基中，在35℃下培养12h，得到拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液。
3、利用拜氏梭菌半固态发酵油菜秸秆产丁酸与菌体蛋白
将步骤2制备得到的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液以5％(v/v)的接种量，分别接种至100mL步骤1制备得到的液体发酵培养基、半固态发酵培养基内，在35℃温度下厌氧发酵7d，发酵结束后取样。分别测定发酵液丁酸含量、粗蛋白含量、真蛋白含量、酸溶蛋白含量，结果见图15和表2所示。
发酵结束后，将发酵液过滤，检测液体中的丁酸含量，固体废渣烘干后作为菌体蛋白产品测量其粗蛋白、真蛋白、酸溶蛋白含量。
同时，以实施例3中制备得到的预处理后的油菜秸秆(即最优条件制备得到的秸秆糖化物)和未预处理的油菜秸秆作为对照，分别检测丁酸含量、粗蛋白含量、真蛋白含量、酸溶蛋白含量，并以未接菌的半固态发酵培养基、除去秸秆糖化物的发酵培养基作为对照，在相同的条件下处理后，发酵结束后，将发酵液过滤，检测液体中的丁酸含量，固体废渣烘干后作为菌体蛋白产品测量其粗蛋白、真蛋白、酸溶蛋白含量，结果如表2所示。
表2发酵废渣中的蛋白含量
Figure BDA0003927690270000141
结果显示：
从图15可看出液态发酵丁酸产量为6.75±0.73g/L，半固态发酵丁酸产量为6.57±0.56g/L，液态发酵和半固态发酵产算量差异不大。选择半固态发酵丁酸不仅避免了水解残渣对环境的二次污染问题，且减少了过滤这一操作过程，使得整个工艺更加经济。发酵结束后，液体产物为丁酸，固体产物烘干后作为菌体蛋白。对发酵前后蛋白含量测定结果如表所示，发酵废渣的粗蛋白远远高于油菜秸秆本身的含量。然而，粗蛋白包含一部分非蛋白质氮，这类物质往往不能被动物吸收，因此真蛋白质含量更适合作为检验饲料营养价值高低的指标。
由表2可知，半固态发酵产酸发酵过后的废渣中真蛋白含量高达15.84±0.32％，远远高于油菜秸秆本身的含量。酸溶蛋白是由小分子肽和游离氨基酸等较低蛋白水解物组成，能被动物肠道直接吸收利用，它大致决定了饲料在动物体内的消化率。由上面数据可知，本研究发酵饲料酸溶蛋白显著提高，大幅度改善了秸秆饲料的营养品质。未接菌的发酵培养基中蛋白含量高可能是因为发酵培养基中添加量大量酵母膏、牛肉膏、蛋白胨，而发酵结束，蛋白含量略微降低可能是因为拜氏梭菌的增值、产酸过程会消耗大量培养基中原有的的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨等有机氮，在此过程中，拜氏梭菌也大量增殖沉淀形成菌体蛋白。单缺秸秆糖化物的发酵培养基经过发酵结束后，产了少量丁酸是因为培养基中虽然缺少秸秆还原糖，但仍有酵母高、乙酸钠等少量的碳源可供拜氏梭菌生长、发酵，发酵结束后发酵液中的蛋白含量略微减少是因为拜氏梭菌的增殖、产酸过程会消耗大量培养基中原有的的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨等有机氮，而由于碳源缺乏，菌体增殖量较少，菌体蛋白产量低，发酵液体中蛋白总量较发酵前降低。
4、油菜秸秆添加量对丁酸产量的影响
秸秆添加量越多，发酵培养基中碳源含量越多，对微生物的生长有促进作用，同时随着秸秆含量的增加，水解液中抑制物的含量也增加，对微生物发酵起到抑制作用。为考察油菜秸秆添加量对丁酸产量的影响，具体步骤如下：
将步骤2制备得到的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001种子液以5％(v/v)的接种量，分别接种至100mL秸秆含量分别为10、20、30、40、50、60、70g/L的半固态发酵培养基内，在35℃温度下厌氧发酵7d，发酵结束后取样。分别测定发酵液丁酸含量含量，结果见图16。
其中，半固态发酵培养基(每1000mL)：实施例3最优条件制备得到的秸秆糖化物(秸秆含量分别为10、20、30、40、50、60、70g/L)1L，氯化钠0.9g/L、酵母粉1g/L、磷酸二氢钾0.7g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、乙酸铵10g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8，121℃灭菌20min。营养液50ml/L、金属离子母液5ml/L过滤除菌后加入。
营养液包括：维生素B6 0.05g/L、维生素B1 0.05g/L、维生素B2 0.05g/L、烟酸0.05g/L、生物素0.05g/L、叶酸0.05g/L、丝氨酸5g/L、色氨酸5g/L、L-谷氨酸5g/L、D-谷氨酸2.5g/L、无水乙醇20ml/L。
金属离子母液包括：氯化锌0.35g/L、氯化铁0.92g/L、氯化锰0.17g/L、氯化铜0.012g/L、氯化钾88.5g/L、氯化钠8.94g/L、氯化镁60.23g/L、氯化钙3.48g/L。
秸秆含量分别为10、20、30、40、50、60、70g/L的制备方法如下：
根据实施例3酶解过程中的比产糖量最大约0.49～0.5g/g可知，1g秸秆糖化后最多可产还原糖0.49～0.5g，所以上述培养基糖化物中若含糖量为10g/L，此时秸秆含量就为20g/L；
秸秆含量分别为10、20、30、40、50、60、70g/L即在1L实施例3最优条件制备柠檬酸缓冲液中分别添加10、20、30、40、50、60、70g已经预处理过后的秸秆，在实施例3最优酶解条件制备后即可得到含糖量为5、10、15、20、25、30、35g/L的秸秆糖化物。
由图16可知，在秸秆添加量为60g/L时，丁酸产量最高，达16.14±0.98g/L，高出许多利用葡萄糖为碳源摇瓶发酵生产丁酸的研究结果，远高于现有文献利用拜氏梭菌发酵秸秆生产丁酸的产量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BRM001，其特征在于，所述拜氏梭菌BRM001保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62710，保藏日期为2022年08月18日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的拜氏梭菌BRM001或其发酵液，或含有所述拜氏梭菌BRM001冻干粉。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述拜氏梭菌BRM001在微生物菌剂中的添加量：OD600值至少为1.2。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态制剂或液态制剂。
5.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的拜氏梭菌BRM001。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述拜氏梭菌BRM001在产品中的添加量：OD600值至少为1.2。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为化学品。
8.权利要求1所述的拜氏梭菌BRM001或权利要求2～4任一所述的微生物菌剂或权利要求5～7任一所述的产品在制备丁酸中的应用。
9.一种利用油菜秸秆发酵制备丁酸、菌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的拜氏梭菌BRM001或权利要求2～4任一的微生物菌剂或权利要求5～7任一所述的产品，添加至含有秸秆糖化物的发酵体系中，发酵制备得到发酵液，从发酵液中提取得到丁酸、菌体蛋白；所述秸秆糖化物为，向经预处理后的油菜秸秆中添加纤维素酶、柠檬酸缓冲液，静置48～72h后得到的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有秸秆糖化物的发酵体系为，向经预处理后的油菜秸秆中添加纤维素酶、柠檬酸缓冲液，静置48～72h后，过滤，取澄清的上清液添加至发酵体系中进行液态发酵；
或所述含有秸秆糖化物的发酵体系为，向经预处理后的油菜秸秆中添加纤维素酶、柠檬酸缓冲液，静置48～72h后，添加至发酵体系中进行半固态发酵。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110129887A1 (en) * 2008-04-09 2011-06-02 Pamela Reilly Contag Immobilized product tolerant microorganisms
CN102227499A (zh) * 2008-11-28 2011-10-26 道达尔公司 纤维素分解多肽及其在用于制备溶剂和燃料的微生物中的用途
US20140147901A1 (en) * 2010-12-22 2014-05-29 Cobalt Immobilized product tolerant microorganisms
CN104164395A (zh) * 2014-08-07 2014-11-26 西安交通大学 一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用
CN104805125A (zh) * 2015-05-07 2015-07-29 马力通 一种沼气工程菌剂及其制备方法
CN107043793A (zh) * 2017-04-18 2017-08-15 哈尔滨工业大学 一种利用外源电子载体提高农作物秸秆水解液发酵丁醇产量的方法
US20190211302A1 (en) * 2016-08-05 2019-07-11 North Carolina State University Systems and methods of carbon fixation using solventogenic clostridium beijerinckii
CA3013593A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-08 Centre De Recherche Industrielle Du Quebec Process for the production of bio-butanol by fermentation of glycosidic waste matter
US20200048661A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-13 Institut National De La Recherche Scientifique - Centre Eau Terre Environnement Process for the production of bio-butanol by fermentation of glycosidic waste matter

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110129887A1 (en) * 2008-04-09 2011-06-02 Pamela Reilly Contag Immobilized product tolerant microorganisms
CN102227499A (zh) * 2008-11-28 2011-10-26 道达尔公司 纤维素分解多肽及其在用于制备溶剂和燃料的微生物中的用途
US20140147901A1 (en) * 2010-12-22 2014-05-29 Cobalt Immobilized product tolerant microorganisms
CN104164395A (zh) * 2014-08-07 2014-11-26 西安交通大学 一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用
CN104805125A (zh) * 2015-05-07 2015-07-29 马力通 一种沼气工程菌剂及其制备方法
US20190211302A1 (en) * 2016-08-05 2019-07-11 North Carolina State University Systems and methods of carbon fixation using solventogenic clostridium beijerinckii
CN107043793A (zh) * 2017-04-18 2017-08-15 哈尔滨工业大学 一种利用外源电子载体提高农作物秸秆水解液发酵丁醇产量的方法
CA3013593A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-08 Centre De Recherche Industrielle Du Quebec Process for the production of bio-butanol by fermentation of glycosidic waste matter
US20200048661A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-13 Institut National De La Recherche Scientifique - Centre Eau Terre Environnement Process for the production of bio-butanol by fermentation of glycosidic waste matter

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DWIDAR M 等: "The production of biofuels from carbonated beverages", 11TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON CLEAN ENERGY (ICCE), vol. 100, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 47 - 51, XP055433471, DOI: 10.1016/j.apenergy.2012.02.054 *
FONSECA BC 等: "Acetic acid as catalyst for microwave-assisted pretreatment of sugarcane straw aids highly specific butyric acid bioproduction", INDUSTRIAL CROPS AND PRODUCTS, vol. 157, 1 December 2020 (2020-12-01), pages 112936 *
HUI KOU等: "Optimization of Clostridium beijerinckii Semi-solid Fermentation of Rape Straw to Produce Butyric acid by Genome Analysis", BIORESOURCES AND BIOPROCESSING, 28 October 2023 (2023-10-28), pages 1 - 25 *
张海黎: "丁醇发酵菌种的筛选及鉴定", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, no. 5, 15 May 2012 (2012-05-15), pages 018 - 66 *
李豪: "高产纤维素酶菌株选育、发酵产酶优化与初步应用研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, no. 5, 15 May 2020 (2020-05-15), pages 018 - 45 *

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