CN116223808A - 识别干扰类型的生物芯片、试剂盒和生物芯片检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种生物芯片，生物芯片包括固相载体，固相载体上设置有测试微阵列和阴性质控微阵列，测试微阵列包括至少一个用于检测目标待测物的检测位点，检测位点设置有目标待测物抗体，阴性质控微阵列包括至少两种阴性质控位点，不同种阴性质控位点设置有不同亚型的抗体。本申请通过创造性地设置不同亚型的抗体作为阴性质控微阵列制备利用识别干扰类型的生物芯片，可以快速识别样本中的抗体干扰类型，从而减少样本的假阳性检测结果，提高检测结果的准确度，降低检测成本。

Description

识别干扰类型的生物芯片、试剂盒和生物芯片检测方法
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种识别干扰类型的生物芯片、试剂盒和生物芯片检测方法。
背景技术
生物芯片，又称蛋白芯片或基因芯片，它们起源于DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA或其他样品分子(例如蛋白，因子或小分子)进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。目前，生物芯片会在固相载体表面添加阴性质控列、阳性质控列及各检测指标抗体，用于芯片数据定位、判断是否存在HAMA干扰及各指标浓度检测。
然而，生物芯片表面阴性质控微阵列设置的抗体亚型较为单一，大多为IgG1型，而当血清样本中存在其它亚型的抗体时，检测结果就会存在干扰，导致部分指标检测的浓度值远高于或低于真实浓度值且阴性质控微阵列异常，从而引起检测误差。
因此，如何减少其他亚型导致的检测误差是提高生物芯片检测准确度的难点。
发明内容
为了解决上述问题，提高生物芯片检测结果的准确性，本申请的第一目的提供了一种生物芯片，生物芯片包括固相载体，固相载体上设置有测试微阵列和阴性质控微阵列，测试微阵列包括至少一个用于检测目标待测物的检测位点，检测位点设置有目标待测物抗体，阴性质控微阵列包括至少两个阴性质控位点，不同阴性质控位点设置有不同亚型的抗体。
在其中一个实施例中，不同亚型的抗体包括IgG1抗体、IgG2a抗体和IgG2b抗体中的至少两种。
在其中一个实施例中，固相载体满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
(1)固相载体选自黑玻片、聚苯乙烯塑料载体、NC膜载体和PDVF膜载体中的至少一种；
(2)固相载体上还设置有阳性质控微阵列。
本申请的第二目的在于提供一种试剂盒，包括上述识别干扰类型的生物芯片。
在其中一个实施例中，试剂盒满足以下特征中(1)～(2)中的至少一个：
(1)试剂盒还包括至少两种样本处理液，不同种样本处理液含有不同亚型的抗体；
(2)试剂盒还包括测试反应液和发光液中的至少一种；
可选的，测试反应液包括用于检测目标待测物的检测抗体。
本申请的第三目的在于提供上述识别干扰类型的生物芯片的制备方法，包括以下步骤：
将目标待测物抗体设置于固相载体的检测位点上形成测试微阵列；
将至少两种不同亚型的抗体设置于固相载体的阴性质控位点上形成质控微阵列；
用封闭液对固相载体液进行封闭，制得识别干扰类型的生物芯片。
在其中一个实施例中，识别干扰类型的生物芯片的制备方法的步骤满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：
(1)测试微阵列和阴性质控微阵列中的至少一种的设置方式为点样设置；
(2)用封闭液对固相载体进行封闭，制得生物芯片之前还包括：
将目标待测物抗体设置于固相载体的阳性质控位点上形成阳性质控微阵列；
(3)用封闭液对固相载体进行封闭具体包括：
将设置有测试微阵列和阴性质控微阵列的固相载体浸入封闭液中1～4h，取出封闭后的固相载体，去除残余封闭液，制得识别干扰类型的生物芯片；
(4)封闭液为含有封闭蛋白的缓冲液。
在其中一个实施例中，封闭液中的组分满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
(1)封闭蛋白选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的至少一种；
(2)缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液和MOPS缓冲液中的至少一种。
本申请的第四目的在于提供一种生物芯片检测方法，方法包括：
采用上述试剂盒检测样本液中的目标待测物；
根据识别干扰类型的生物芯片阴性质控微阵列的异常信号，选择含有相应亚型抗体的处理液对样本液进行处理，以重新检测样本液中的目标待测物。
在其中一个实施例中，样本液选自血浆、血清和唾液中的至少一种。
在其中一个实施例中，目标待测物选自肿瘤标志物、自身免疫性疾病标志物和心肺疾病标志物中的任意一种。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1制备的识别干扰类型的生物芯片结构示意图；
图2为本申请实施例3中样本1的常规生物芯片和识别干扰类型的生物芯检测结果，在图2中，a表示样本1的常规生物芯片检测结果，b表示识别干扰类型的生物芯片检测结果；
图3为本申请实施例3中样本1的识别干扰类型前后的常规生物芯片检测结果，在图3中，a表示样本1的识别干扰类型前的常规生物芯片检测结果，b表示样本1的识别干扰类型后的常规生物芯片检测结果；
图4为本申请实施例4中样本2的常规生物芯片和识别干扰类型的生物芯检测结果，在图4中，a表示样本2的常规生物芯片检测结果，b表示识别干扰类型的生物芯片检测结果；
图5为本申请实施例4中样本1的识别干扰类型前后的常规生物芯片检测结果，在图5中，a表示样本2的识别干扰类型前的常规生物芯片检测结果，b表示样本2的识别干扰类型后的常规生物芯片检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
如上文，目前生物芯片表面阴性质控微阵列设置的抗体亚型较为单一，大多为IgG1型，而当血清样本中存在其它亚型的抗体时，检测结果就会存在干扰，导致部分指标产生跳点现象且阴性质控微阵列异常，从而引起检测误差。
为了解决上述技术问题，本申请的第一方面提供了一种识别干扰类型的生物芯片，识别干扰类型的生物芯片包括固相载体，固相载体上设置有测试微阵列和阴性质控微阵列，测试微阵列包括至少一个用于检测目标待测物的检测位点，检测位点设置有目标待测物抗体，阴性质控微阵列包括至少两个阴性质控位点，不同阴性质控位点设置有不同亚型的抗体。
本申请中，术语“生物芯片”一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。
基于免疫荧光的生物芯片检测，需要在检测过程中添加样本处理液、测试反应液、发光液以检测样本液中的目标待测物。一般地，根据生物芯片需要检测的目标待测物的不同，样本液来源也不同。生物芯片需要检测的目标待测物可以是一种也可以是多种。具体地，生物芯片需要检测的目标待测物可以是肿瘤标志物也可以是其他蛋白或抗体。
具体地，样本液选自血浆、血清、唾液中的至少一种。对于目标待测物为人肿瘤标志物的，相应的，样本来源于人。
本申请创造性地设置不同亚型的抗体作为阴性质控微阵列制备识别干扰类型的生物芯片，可以快速识别样本中的抗体干扰类型，从而减少样本的假阳性检测结果，提高检测结果的准确度，降低检测成本。
一些实施方案中，不同亚型的抗体包括IgG1抗体、IgG2a抗体和IgG2b抗体中的至少两种。
一些实施方案中，固相载体包括黑玻片、聚苯乙烯塑料载体、NC膜载体和PDVF膜载体中的至少一种。
一些实施方案中，固相载体上还设置有阳性质控微阵列。阳性质控微阵列上设置有特异性结合样本中已知物或定量标准品的生物分子，用来分析样本检测结果的可靠性。
本申请的第二方面提供了一种试剂盒，包括的生物芯片和至少两种样本处理液，不同种样本处理液含有不同亚型的抗体，样本处理液用于消除不同类型的干扰类型，提高检测结果的准确度。
一些实施方案中，还包括测试反应液和发光液中的至少一种。
一些具体实施方案中，测试反应液包括检测抗体和至少两种亚型的抗体，且检测抗体和不同亚型的抗体均标记有标记物，以与发光底物产生可检测信号。对于双抗夹心法检测大分子抗原，检测抗体可以是特异性结合目标待测物其他结合位点的标记物标记的一抗，其他结合位点是指目标待测物表面除固相载体包被抗体结合位点之外的表位，对于间接法ELISA，检测抗体也可以是与目标待测物结合的标记物标记的二抗。
一些具体实施方案中，检测抗体为酶标二抗。更具体地，酶标二抗为HPR标记二抗。
一些具体实施方案中，测试反应液中检测抗体的浓度为0.1～2μg/mL，进一步可以为0.1～1μg/mL，进一步可以为0.5～2μg/mL，更进一步可以为0.5～1μg/mL。
一些具体实施方案中，测试反应液中每种亚型的抗体的浓度为0.05～0.2μg/mL，进一步可以为0.1～0.2μg/mL，进一步可以为0.15～0.2μg/mL。
一些实施方案中，发光液中的第二发光底物包括鲁米诺和H2O2。
本申请的第二方面提供了一种上述识别干扰类型的生物芯片的制备方法，包括以下步骤：
将目标待测物抗体设置于固相载体的检测位点上形成测试微阵列；
将至少两种不同亚型的抗体设置于固相载体的阴性质控位点上形成阴性质控微阵列；
用封闭液对固相载体液进行封闭，制得识别干扰类型的生物芯片。
具体地，封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液，用于对固相载体进行封闭；其中，封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种。
一些具体实施方案中，用封闭液对设置有测试微阵列和阴性质控微阵列的固相载体进行封闭包括：
将设置有测试微阵列和阴性质控微阵列中的至少一种的固相载体浸入封闭液中1～4h，取出封闭后固相载体，去除残余封闭液，制得识别干扰类型的生物芯片。具体地，可以通过离心的方式去除封闭液。
一些具体实施方案中，测试微阵列和阴性质控微阵列的设置方式为点样设置。
本申请的第四目的在于提供一种生物芯片检测方法，方法包括：
采用上述试剂盒检测样本液中的目标待测物；
根据生物芯片阴性质控位点的异常信号选择含有相应亚型抗体的处理液对样本液进行处理以重新检测样本液中的目标待测物。
一些实施方案中，样本液选自血浆、血清和唾液中的至少一种。
一些实施方案中，目标待测物选自肿瘤标志物、自身免疫性疾病标志物和心肺疾病标志物中的任意一种。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本申请实施例将识别干扰类型的生物芯片应用于肿瘤标志物检测中，并提供了一种用于肿标检测的生物芯片、用于肿标检测的试剂盒和用于肿标检测的生物芯片检测方法。可以理解的是，本申请的识别干扰类型的生物芯片、试剂盒和生物芯片检测方法并不局限于肿标检测体系，也适用于心肺、自免等其他体系的检测。
实施例1
本实施例提供了一种识别干扰类型的生物芯片，如图1所示，识别干扰类型的生物芯片包括固相载体，固相载体为黑玻片，固相载体上设置有测试微阵列、阳性质控微阵列以及阴性质控微阵列，其中，阳性质控微阵列设置于固相载体的A区，测试微阵列设置于固相载体的B区，阴性质控微阵列设置于固相载体的C区，其中，测试微阵列包括设置于检测位点的肿瘤标志物抗体，包括AFP抗体、CA-199抗体、CEA抗体、PGI抗体、PGII抗体、GRP抗体、CA-724抗体、HCG抗体、CA-125抗体、CA-153抗体、NSE抗体和CK19抗体中的至少一种，阳性质控微阵列设置有抗HRP抗体，阴性质控微阵列设置有不同亚型的非肿标芯片检测体系的抗体：IgG1抗体、IgG2a抗体和IgG2b抗体，各质控抗体的购买途径和货号如表1所示。
表1
IgG1 晋联生物MAB20220113
IgG2a 晋联生物MAB20220114
IgG2b 晋联生物MAB20220115
抗HRP抗体 晋联生物MAB129316
本实施例的识别干扰类型的生物芯片的制备方法包括：
将上述目标待测物抗体设置于固相载体的检测位点上形成测试微阵列；
将IgG1抗体、IgG2a抗体和IgG2b抗体点样设置于固相载体的阴性质控位点上形成阴性质控微阵列；
将抗HRP抗体设置于固相载体的阳性质控位点上形成阳性质控微阵列；
将设置有测试微阵列、阴性质控微阵列和阳性质控微阵列的固相载体浸入封闭液中1～4h，取出固相载体，离心去除残余封闭液，制得识别干扰类型的生物芯片。
其中，封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液，封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白，缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的任意一种。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒，包括实施例1的识别干扰类型的生物芯片、检测生物芯片、至少两种样本处理液、测试反应液和发光液。样本处理液包括干扰消除蛋白Mak33及干扰消除抗体，不同样本处理液含有不同亚型的干扰消除抗体。测试反应液包括酶标抗体。发光液购自晋联生物，货号为LRZ2018027。
其中，制备样本处理液的步骤包括：
在超纯水中加入1％～10％的Mak33及10～20μg/mL的部分亚型为IgG1型的指标抗体，如加入5～10μg/mL的PGI抗体和15～20μg/mL的CA153抗体，得到样本处理液；
制备测试反应液的步骤包括：
将酶标后的各指标特异性抗体和不同亚型抗体按下表2的浓度用稳定型稀释液(购买自晋联生物，货号：LRZ2022025)稀释，得到测试反应液。
表2
酶标抗体 反应液中浓度(μg/mL)
酶标AFP抗体 0.1～1
酶标PGII抗体 0.1～1
酶标CK19抗体 0.5～1
酶标PSA抗体 0.5～2
酶标CA724抗体 0.5～2
酶标PGI抗体 0.1～1
酶标CEA抗体 1～2
酶标GRP抗体 0.1～1
酶标CA199抗体 0.1～1
酶标CA125抗体 0.5～1
酶标NSE抗体 0.1～1
酶标CA153抗体 0.1～1
酶标HCG抗体 0.5～2
酶标IgG1型抗体 0.05～0.2
酶标IgG2a型抗体 0.05～0.2
酶标IgG2b型抗体 0.05～0.2
实施例3
本实施例提供了一种生物芯片检测方法，利用实施例2的试剂盒进行样本1的检测。本实施例的生物芯片检测方法具体包括：采用型号为SLXP-001B的生物芯片阅读仪通过移液枪取20ul样本处理液加入芯片杯，用移液枪从血清管内摄取180ul人血清样本液推入芯片杯与样本处理液发生反应得到样本混合液，将实施例2中的试剂盒中检测生物芯片放入芯片杯中与样本混合液反应后洗净生物芯片表面残余的样本混合液，再吸取酶标抗体反应液200ul与洗净样本混合液的生物芯片反应40分钟后洗净生物芯片表面残余的酶标抗体反应液，吸取发光液200ul和洗净酶标抗体反应液的生物芯片进行反应；
利用生物芯片阅读仪器采集生物芯片的样本处理液质控位点的检测信号，得到样本1的生物芯片检测结果，具体如图2中a所示。
根据图2中a可知，生物芯片的阴性质控微阵列异常发光。进一步，按照上述测试步骤用实施例2的试剂盒中识别干扰类型的生物芯片测试后，发现该样本中干扰亚型为IgG2b型，故在处理液中将IgG1型的肿标抗体更换为IgG2b亚型的抗体，并按照上述检测步骤采用检测芯片再次对样本1进行测试，测试结果如图3中b所示。图3中a和b中第13列阴性质控微阵列的信号值具体如表3所示。根据表3的检测结果可知，样本1中的亚型为2b型，处理液中1型的抗体无法与样本特异性结合达到消除干扰的目的，使得其与阴性质控列的抗体非特异性结合，使得检测结果异常发光，处理液中更换为2b型后，可与样本肿的干扰抗原特异性结合有效消除，减少了非特异性结合，故减少了异常发光。
因此，利用本申请识别干扰类型的生物芯片可以快速识别样本中的抗体干扰类型，从而减少样本的假阳性检测结果，提高检测结果的准确度，降低检测成本。
表3
信号类型 识别干扰前信号 识别干扰调整后信号
样本1 6926 137
实施例4
本实施例提供了一种生物芯片检测方法，利用实施例2的试剂盒进行样本2的检测。本实施例的生物芯片检测方法具体包括：采用型号为SLXP-001B的生物芯片阅读仪通过移液枪取20ul样本处理液加入芯片杯，用移液枪从血清管内摄取180ul人血清样本液推入芯片杯与样本处理液发生反应得到样本混合液，将实施例2中的试剂盒中检测生物芯片放入芯片杯中与样本混合液反应后洗净生物芯片表面残余的样本混合液，再吸取酶标抗体反应液与洗净样本混合液的生物芯片反应40分钟后洗净生物芯片表面残余的酶标抗体反应液，吸取发光液和洗净酶标抗体反应液的生物芯片进行反应；
利用生物芯片阅读仪器采集生物芯片的样本液质控位点的检测信号，得到样本2的生物芯片检测结果，具体如图4中a所示。
根据图4中a可知，对样本2检测时，肿标指标信号均较高，怀疑样本中存在假信号干扰。进一步，按照上述测试步骤用实施例2的试剂盒中识别干扰类型的生物芯片测试后，发现该干扰样本亚型为IgG2a型，故在处理液中将IgG1型的肿标抗体更换为IgG2a亚型的抗体，并对该干扰样本进行测试，测试结果如下测试结果如图5中b所示。图5中a和b的中检测结果具体如表4所示。根据图5中b和表4的检测结果可知，利用识别干扰类型的生物芯片可以快速识别样本中的抗体干扰类型，从而减少样本的假阳性检测结果，提高检测结果的准确度，降低检测成本。
表4
信号类型 PG1 PG2 CA199 AFP TPSA FPSA NSE CK19 CA125 CEA CA724 GRP 阴性
调整前 21974 14487 25342 37619 73964 55567 24408 30135 46679 32115 34018 53208 105
调整后 10570 9411 1030 871 60 67 4723 1172 510 398 4678 201 108
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种识别干扰类型的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包括固相载体，所述固相载体上设置有测试微阵列和阴性质控微阵列，所述测试微阵列包括至少一个用于检测目标待测物的检测位点，所述检测位点设置有目标待测物抗体，所述阴性质控微阵列包括至少两个阴性质控位点，不同阴性质控位点设置有不同亚型的抗体。
2.根据权利要求1所述的识别干扰类型的生物芯片，其特征在于，所述不同亚型的抗体包括IgG1抗体、IgG2a抗体和IgG2b抗体中的至少两种。
3.根据权利要求1所述的识别干扰类型的生物芯片，其特征在于，所述固相载体满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
(1)所述固相载体选自黑玻片、聚苯乙烯塑料载体、NC膜载体和PDVF膜载体中的至少一种；
(2)所述固相载体上还设置有阳性质控微阵列。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的识别干扰类型的生物芯片。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足以下特征中(1)～(2)中的至少一个：
(1)所述试剂盒还包括至少两种样本处理液，不同种样本处理液含有不同亚型的抗体；
(2)所述试剂盒还包括测试反应液和发光液中的至少一种；
可选的，所述测试反应液包括用于检测目标待测物的检测抗体和至少两种亚型的抗体。
6.根据权利要求1～3任一项所述的识别干扰类型的生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目标待测物抗体设置于所述固相载体的检测位点上形成测试微阵列；
将至少两种不同亚型的抗体设置于所述固相载体的阴性质控位点上形成质控微阵列；
用封闭液对所述固相载体液进行封闭，制得所述识别干扰类型的生物芯片。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述识别干扰类型的生物芯片的制备方法的步骤满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：
(1)所述测试微阵列和阴性质控微阵列中的至少一种的设置方式为点样设置；
(2)用封闭液对所述固相载体进行封闭，制得所述识别干扰类型的生物芯片之前还包括：
将目标待测物抗体设置于所述固相载体的阳性质控位点上形成阳性质控微阵列；
(3)所述用封闭液对所述固相载体进行封闭具体包括：
将设置有测试微阵列和阴性质控微阵列的固相载体浸入封闭液中1～4h，取出封闭后的固相载体，去除残余封闭液，制得所述识别干扰类型的生物芯片；
(4)所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述封闭液中的组分满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
(1)所述封闭蛋白选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的至少一种；
(2)所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液和MOPS缓冲液中的至少一种。
9.一种生物芯片检测方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求4～5任一项所述的试剂盒检测样本液中的目标待测物；
根据识别干扰类型的生物芯片阴性质控微阵列的异常信号，选择含有相应亚型抗体的处理液对样本液进行处理，以重新检测样本液中的目标待测物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样本液选自血浆、血清和唾液中的至少一种；及/或
所述目标待测物选自肿瘤标志物、自身免疫性疾病标志物和心肺疾病标志物中的任意一种。
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