CN116223379A - 一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法和系统，系统包括：沿光束传播方向布置的光源模块、光调制模块、样品载物台和光收集模块；所述的光调制模块将双波长光束调制为HiLo显微成像所需的正弦条纹分布结构的照明光与相位平坦的均匀照明光并投影照明光至样品载物台处；所述光收集模块实现不同轴平面上的样品图像采集以及数据传输；根据HiLo融合算法组合多个光学切片图像以形成三维显微成像。本发明实现了快照式的HiLo光学切片显微成像，提高了成像速度与稳定性；实现待测样品的三维显微成像；具备体积小、结构紧凑以及便于移动等优点，能够满足野外环境、偏远地区等复杂环境下即时检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微及微纳光学技术领域，具体为一种基于波长复用超表面的便携式快速三维显微成像方法和系统。
背景技术
宽场显微技术作为生物显微成像中的一种基本技术，常用于对生物样品的结构细节进行非接触、快速和低成本的高分辨成像。然而，传统的宽场显微镜由于系统景深引入的离焦背景噪声会降低图像质量与图像对比度。其次对厚样品来说，由于宽场照明光功率密度较低，难以激发并穿透样品深层从而实现三维成像，因此限制了宽场显微成像在厚样品中的应用。
HiLo显微成像是一种简单、快速且有效的宽场光学切片成像技术，通过拍摄一张均匀光照明图像与一张结构光照明图像即可重构出高分辨图像。尽管HiLo显微技术具备光学切片能力，但为了获取所需的均匀照明图像与结构光照明图像，要求探测相机进行两次图像拍摄采集，影响成像速度和成像质量的提高。此外，在传统的HiLo显微镜中结构照明光是通过空间光调制器或数字微镜器件调制产生，因此系统体积庞大、结构复杂且难以移动。在野外环境或偏远地区，检测人员需将采集到的待测样品切片保护处理并携带至实验室才能进行成像检测。因此，传统的HiLo显微架构无法满足上述复杂环境下的初步即时检测需求。
发明内容
为了解决上述传统HiLo显微成像中的问题，本发明的目的是要提出一种基于波长复用超表面的便携式快速三维显微成像方法和系统，以满足快速、即时的三维光学切片显微成像需求。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，包括：沿光束传播方向布置的光源模块、光调制模块、样品载物台和光收集模块；所述的光源模块将两种不同工作波长光源的出射光合束，并整形为准直共轴的双波长光束；所述的光调制模块将双波长光束调制为HiLo显微成像所需的正弦条纹分布结构的照明光与相位平坦的均匀照明光并投影照明光至样品载物台处；所述光收集模块实现不同轴平面上的样品图像采集以及数据传输；根据HiLo融合算法首先重构单个轴平面上的光学切片图像，组合多个光学切片图像以形成三维显微成像。
可选的，所述光调制模块包括沿光路方向依次设置的波长复用超表面器件、第一显微物镜、偏振不敏感分束器、电调液体变焦透镜和第二显微物镜；所述的波长复用超表面器件包括波长复用超表面及超表面安装座，使光源模块的双波长光束正入射至波长复用超表面；波长复用超表面同时产生HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光，调制后的两种照明光由第一显微物镜收集，经由偏振不敏感分束器、电调液体变焦透镜以及第二显微物镜后，投影照明光至样品载物台处。
可选的，所述的波长复用超表面包括透明衬底与布置在透明衬底上的多个基本单元结构，基本单元结构为介质纳米天线，介质纳米天线包括晶格以及设置在所述晶格上表面中心处的介质纳米柱；所述基本单元结构的尺寸均为亚波长量级；所述透明衬底的形状为正方形。
可选的，所述的光收集模块包括沿光路方向设置的第二显微物镜、电调液体变焦透镜、偏振不敏感分束器、套筒透镜以及彩色相机；波长复用超表面产生的两种照明光投影至待测样品处，经过样品的反射光首先由第二显微物镜与电调液体变焦透镜收集，收集光经过偏振不敏感分束器反射至套筒透镜中，套筒透镜最后将收集光成像至彩色相机的像元靶面上。
可选的，所述的套筒透镜为消像差透镜，与第二显微物镜匹配，构成无限远成像组；所述的彩色相机与电调液体变焦透镜变焦保持时间同步，拍摄采集各扫描平面上的HiLo显微图像；采集到的图像数据通过蓝牙上传至服务器端。
可选的，所述的光源模块包括两种不同工作波长的光源、光纤合束器和光纤准直透镜；光源的尾纤与光纤合束器相连，双波长输出光耦合进光纤合束器后形成共光轴的发散光束；光纤准直透镜将发散光束准直为共光轴的平行准直输出光束。
可选的，所述的光源模块输出共轴准直的双色光束，工作波长分别为λ1与λ2，分别对应波长复用超表面产生的HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光的两种工作波长。
可选的，所述的样品载物台用于固定和调节待测样品；所述待测样品由载玻片与盖玻片固定保护，样品载物台设有载玻片安装槽与调整架，调节调整架可使照明光均匀覆盖待测样品。
一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法，采用本发明任一所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统完成，其中，所述的光调制模块包括沿光路方向依次设置的波长复用超表面、第一显微物镜、偏振不敏感分束器、电调液体变焦透镜(8)和第二显微物镜；
具体流程如下：
步骤1：准备待测样品；
将待测的生物样品用载玻片制样后放置样品载物台中，使待测样品垂直于光轴并位于第二显微物镜的工作距离上；
步骤2：调整照明光；
驱动光源模块中的光源，产生波长复用超表面所需的共轴准直双色光束；驱动电调液体变焦透镜，使波长复用超表面调制产生的两种照明光覆盖待测样品的外表面；
步骤3：照明光扫描与图像采集；
设置电调液体变焦透镜的变焦步长ΔL，使电调液体变焦透镜按照设定步长ΔL变焦，使照明光沿光轴方向扫描覆盖样品，采集次数为N，总行程L为待测样品的厚度，L＝NΔL；在每次采集过程中，电调液体变焦透镜需按步长变焦且稳定，同步驱动彩色相机快门采集双色照明图像；
步骤4：三维显微图像重构与存储；
将步骤3采集的图像数据通过蓝牙传输至服务器端，服务器端首先借助彩色相机的拜尔滤光器，分离两种工作波长下的照明图像；分离后的两幅图像再借助HiLo算法融合为一副高分辨率的光学切片图像；最后组合N副光学切片图像重构出待测样品的三维显微图像并存储至服务器端。
可选的，所述的步骤4具体包含以下步骤：
步骤1：获取原始图像数据；
服务器端接收到的原始图像数据共N组，i为1～N的整数；其中第i组数据中波长为λ1的图像为均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)，波长为λ2的图像为结构光照明图像Istructured(x,y,i)；
步骤2：分离双色照明图像；
彩色相机中的拜尔滤光器能够将原始图像数据按照波长λ1和波长λ2分离为两组独立照明图像数据Iuniform(x,y,i)与Istructured(x,y,i)；
步骤3：提取图像高频分量；
对第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)提取图像的高频分量IHi(x,y,i),公式如下：
IHi(x,y,i)＝F-1{HPf{F[Iuniform(x,y,i)]}} (1)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，HPf为高通滤波操作；
步骤4：提取图像低频分量；
利用第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)和结构光照明图像Istructured(x,y,i)计算局部对比度图像IC(x,y,i)，并提取图像焦平面上的低频分量ILo(x,y,i),公式如下：
ILo(x,y,i)＝F-1{LPf{F[IC(x,y,i)×Iuniform(x,y,i)]}} (2)；
IC(x,y,i)＝F-1{F{[(Iuniform(x,y,i)-2·Istructured(x,y,i))]×BFP}} (3)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，LPf为高通滤波操作，IC(x,y,i)为局部对比度图像，BFP为高斯带通滤波操作；
步骤5：融合HiLo光学切片图像；
将步骤3和步骤4提取的第i组数据中的焦平面高频分量和低频分量融合为所需HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i),公式如下：
IHiLo(x,y,i)＝IHi(x,y,i)+ηILo(x,y,i) (4)；
其中η为高频分量IHi(x,y,i)与低频分量ILo(x,y,i)之间的权重；
步骤6：第i+1组HiLo光学切片显微图像的获取；
对于第i+1组数据，重复步骤3～5，融合出第i+1组轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i+1)；由此，得到N组不同轴平面上的HiLo显微图像IHiLo(x,y,i)；
步骤7：重构三维HiLo显微图像；
将N组不同轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)拼接组合成待测样品的三维HiLo显微图像IHiLo(x,y,z)，公式如下：
本发明的有益效果如下：
(1)本发明所提出的显微成像系统，相比于传统的空间光调制器及数字微镜装置，波长复用超表面可同时产生HiLo显微成像所需的两种照明光，实现无照明光切换的快照式图像采集，提高了单次HiLo光学切片图像的成像速度。其次，超表面体积小、轻薄化的特点使显微成像系统整体结构紧凑、易于移动且适用于即时检测。
(2)本发明所提出的显微成像系统，通过结合波长复用超表面与电调液体变焦透镜，可实现待测样品轴平面上的光学切片扫描，从而重构出待测样品的三维显微图像。同时，彩色相机的拜尔滤光器在红绿蓝RGB三色具有互相独立光谱带，可以有效地分离两种工作波长，无需分光路或分相机采集图像，进一步减小系统体积、简化操作步骤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统整体结构示意图；
图2为本发明实施例提供的光源模块结构示意图；
图3为本发明实施例提供的光调制模块结构示意图；
图4为本发明实施例提供的光收集模块结构示意图；
图5为本发明实施例提供的三维图像重构流程图；
图6为本发明实施例提供的系统架构操作流程图；
图7为本发明实施例提供的一种超表面的整体示意图；
图8为本发明实施例提供的一种超表面的基本单元结构示意图；
图9为本发明实施例提供的一种超表面结构单元相位扫描结果图；
图10为本发明实施例提供的一种结构照明光与均匀照明光设计相位分布图；
图11为本发明实施例提供的一种超表面产生正弦结构光光场分布图；
图12为本发明实施例提供的一种超表面产生均匀平面波光场分布图；
图13为本发明实施例提供的图11中白色虚线处的光强分布；
图14为本发明实施例提供的图12中白色虚线处的光强分布；
图中各标号表示为：
A-光源模块、B-光调制模块、C-光收集模块；
1-光源、2-光纤合束器、3-光纤准直透镜、4-波长复用超表面、5-超表面安装座、6-第一显微物镜、7-偏振不敏感分束器、8-电调液体变焦透镜、9-第二显微物镜、10-套筒透镜、11-彩色相机、12-待测样品、13-样品载物台。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明的实施方式和原理设计以及技术效果进行清楚、完整地阐述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明公开了基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法和系统，该显微成像系统主要包括光源模块、光调制模块、光收集模块和样品载物台。光源模块将光源出射光整形为准直、共轴的双波长光束。光调制模块用于调制双波长光束并将调制后的照明光投影至待测样品处。光收集模块可采集不同轴平面上的样品图像。样品载物台用于固定、调整待测的生物样品。本发明在传统HiLo光学切片显微成像的基础之上，通过结合波长复用超表面与彩色相机中的拜尔滤光器巧妙地避免了传统HiLo成像过程中的照明光切换以及分光路采集，实现了快照式的HiLo光学切片显微成像，提高了成像速度与稳定性。同时，电调液体变焦透镜负责不同轴平面的显微图像采集，实现待测样品的三维显微成像。相比传统的HiLo显微镜，该系统具备体积小、结构紧凑以及便于移动等优点，能够满足野外环境、偏远地区等复杂环境下即时检测的需求。
结合图1-4，本发明提出的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，包括沿光束传播方向布置的光源模块、光调制模块、样品载物台和光收集模块；光源模块将两种不同工作波长光源的出射光合束，并由光纤准直透镜整形为准直、共轴的双波长光束，作为照明光源。光调制模块将双波长入射光束调制为HiLo显微成像所需的正弦条纹分布的结构照明光与相位平坦的均匀照明光并投影照明光至待测样品处。光收集模块实现不同轴平面上的样品图像采集以及数据传输。根据HiLo融合算法首先重构单个轴平面上的光学切片图像，最终组合多个光学切片图像以形成三维显微成像。样品载物台用于固定调整待测的生物样品。在一些实施方式中，光源模块包括两种不同工作波长的光纤输出光源、光纤合束器以及光纤准直透镜。光源的尾纤与光纤合束器相连，双波长输出光耦合进合束器后形成共光轴的发散光束。光纤准直透镜将发散光束准直为共光轴的平行准直输出光束。本发明中用到的光源一般可以选择LED光源、激光光源等，方便用光纤传输的形式给出的光源，为了光源的尾纤与光纤合束器相连。
在一些实施方式中，光源模块输出共轴、准直的双色光束，工作波长分别为λ1与λ2，分别对应波长复用超表面产生HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光的两种工作波长。特别的，在两种工作波长下，光纤合束器具有较低的插入损耗，光纤准直透镜具备消色差的特性，以保证双波长光束准直、共轴输出且光束质量较好。
在一些实施方式中，光调制模块包括沿光路方向依次设置的波长复用超表面器件、第一显微物镜、分束器、电调液体变焦透镜和第二显微物镜；波长复用超表面器件包括波长复用超表面及超表面安装座，使光源模块的双波长光束正入射至波长复用超表面；波长复用超表面同时产生HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光，调制后的两种照明光由第一显微物镜收集，经由分束器、电调液体变焦透镜以及第二显微物镜后，投影照明光至样品载物台处超表面器件固定于小型五轴位移台上，通过调节位移台空间位置和俯仰角度使光源模块的双色输出光正入射至超表面。
在一些实施方式中，结合图7和8，波长复用超表面4包括透明衬底与布置在透明衬底上的多个基本单元结构，基本单元结构为介质纳米天线，介质纳米天线包括晶格以及设置在所述晶格上表面中心处的介质纳米柱；基本单元结构的尺寸均为亚波长量级；透明衬底的形状为正方形。用于快照式HiLo光学切片显微成像的波长复用超表面的结构的设计方法具体包括如下步骤：
步骤1：基于传输相位调控原理，分析基本单元结构与入射光之间的响应机制，确定两种工作波长下的传输相位、传输相位差分别与介质纳米柱的结构参数之间的关系曲线，建立基本单元结构相位库。包括如下子步骤：
步骤11，通过电磁仿真软件，得到介质纳米柱在两种工作波长下的传输相位与底面直径D之间的关系曲线。
具体操作如下：当入射光为532nm，介质纳米柱的高度H固定为700nm，对介质纳米柱的底面直径D在0.2P～0.8P的范围内进行扫描，P指晶格的边长，扫描间隔为1nm，以此逐点建立第一传输相位
与介质纳米柱的底面直径D的关系曲线；同样地，当入射光为633nm，介质纳米柱的高度H固定为700nm，对介质纳米柱的底面直径D在0.2P～0.8P的范围内进行扫描，扫描间隔为1nm，以此逐点建立第二传输相位
与介质纳米柱的底面直径D的关系曲线。电磁仿真软件中，传输相位可以根据以下传输相位调控原理得到：
其中，
为传输相位；neff为有效折射率，由介质纳米柱的底面直径D决定。通过改变介质纳米柱的底面直径D的大小使传输相位
覆盖0～2π，以满足相位调控需求；介质纳米柱的高度H为700nm；λi为入射光波长，λ1和λ2分别为532nm和633nm(λ1和λ2分别根据入射光要求选择)。
步骤12，计算两种工作波长下的传输相位差
并绘制其与介质纳米柱的底面直径D的关系曲线，计算公式为：
图9为本实施例提供的超表面结构单元相位扫描结果图，如图9所示，展示了
与介质纳米柱的底面直径D之间的关系曲线，以此曲线为数据基础建立基本单元结构相位库。
步骤2：确定均匀照明光、结构照明光的设计相位以及均匀照明光与结构照明光之间的目标相位差。具体如下：
图10为本实施例提供的结构照明光与均匀照明光设计相位分布图。对于结构照明光所需的正弦条纹，基于相位型正弦光栅的相位分布确定此工作波长下的超表面设计相位。波长复用超表面实现正弦条纹结构照明光的设计相位分布为：
其中，基本单元结构的横坐标x范围为-10～10μm；正弦调制参数m＝π/2；周期间隔L＝500nm；参考相位
如公式(3)所述，可得在不同的横坐标x处，对于λ1，
对于λ2，
对于均匀光所需的平面波，波长复用超表面实现均匀照明光的设计相位分布为：
其中，对于λ1，
对于λ2，
计算两种工作波长下的目标相位差：
可得对于λ1，
对于λ2，
步骤3：根据步骤2计算所得目标相位差
在步骤1所建立的基本单元结构相位库中筛选在两种工作波长下等于目标相位差
的纳米柱。所筛选介质纳米柱的高度H为700nm、底面直径D分别为109nm和118nm，晶格的边长P为350nm，将筛选的两种不同底面直径D的介质纳米柱按照公式(3)所述的设计相位分布方程进行排布，即可建立波长复用超表面结构，其中透明衬底边长大小为20μm。
由于基本单元结构尺寸均为亚波长级，因此本发明的超表面具有平面化、轻量化、易于光子集成的特点，因此本发明的超表面适用于光学系统的小型化。通过电磁仿真软件计算超表面在不同工作波长下的光场分布图，图11为本发明实施例提供的一种超表面产生正弦结构光光场分布图，如图11所示，在入射光波长为633nm的条件下，超表面产生周期间隔为500nm，条纹大小为700nm的正弦条纹结构光。图13为本发明实施例提供的一种超表面产生均匀平面波光场分布图，如图13所示，当入射光波长为532nm时，超表面产生强度均匀的平面波。图13为本发明实施例提供的图11白色虚线处的光强分布。图14为本发明实施例提供的图12白色虚线处的光强分布。以上附图展示的光场分布、光强分布结果表明本发明的技术方案所提出的波长复用超表面能够对两种不同波长的入射光实现波长复用功能，当波长为λ1的光入射至超表面时，产生相位平坦的均匀照明光；当的光入射至超表面时，产生正弦条纹分布的结构照明光；当使用波长为λ1和波长为λ2共光路的双波长混色光源作为入射光时，超表面可同时产生HiLo显微成像所需的两种照明光，可满足HiLo光学切片显微成像的两种照明光需求。因此，该超表面能够实现单次拍摄采集即可重构高分辨图像的功能，相比于常规HiLo显微成像技术，本发明的方法能够有效提高成像速度与成像稳定性、降低成像与重构过程的复杂度。
在一些实施方式中，光调制模块中的第一、第二显微物镜、偏振不敏感分束器以及电调液体变焦透镜在两种工作波长下均具备消色差的特性。其中，第一显微物镜、第二显微物镜的工作参数完全一致。通过调节电调液体变焦透镜的加载电压，使照明光场沿光轴方向按照设定步长扫描覆盖整个待测样品。在变焦的过程中，液体透镜放大倍数需与显微物镜匹配，保证照明光覆盖待测样品的同时消除照明光的畸变。
在一些实施方式中，光收集模块包括光调制模块中的第二显微物镜、电调液体变焦透镜、偏振不敏感分束器、套筒透镜以及彩色相机。超表面产生的两种照明光投影至待测样品处，经过样品的反射光首先由第二显微物镜与电调液体变焦透镜收集，收集光经过分束器反射至套筒透镜中，套筒透镜最后将收集光成像至彩色相机的像元靶面上。
在一些实施方式中，光收集模块中的套筒透镜为消像差透镜，与第二显微物镜匹配，构成无限远成像组。彩色相机与液体透镜变焦保持时间同步，拍摄采集各扫描平面上的HiLo显微图像。采集到的图像数据通过蓝牙上传至服务器端。
结合图5，本发明的基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法，采用本发明任一的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统完成，具体流程如下：
步骤1：准备待测样品；
将待测的生物样品置于载玻片上，滴入保护溶液，使用盖玻片固定并保护样品的完整性；将制作好的待测样品安装至样品载物台中的安装槽，调节载物台的调整架使待测样品垂直于光轴并位于第二显微物镜的工作距离上；
步骤2：调整照明光；
(1)驱动光源模块中的LED光源，产生波长复用超表面所需的共轴准直双色光束；
(2)驱动电调液体变焦透镜，使超表面调制产生的两种照明光覆盖待测样品的外表面；
步骤3：照明光扫描与图像采集；
设置电调液体变焦透镜的变焦步长ΔL，块使液体透镜按照设定步长ΔL变焦，使照明光沿光轴方向扫描覆盖样品，采集次数为N，总行程L为待测样品的厚度，L＝NΔL；在每次采集过程中，液体透镜需按步长变焦且稳定，同步驱动彩色相机快门采集双色照明图像；
步骤4：三维显微图像重构与存储；
将步骤3采集的图像数据通过蓝牙传输至服务器端，服务器端首先借助彩色相机的拜尔滤光器，分离两种工作波长下的照明图像；分离后的两幅图像再借助HiLo算法融合为一副高分辨率的光学切片图像；最后组合N副光学切片图像重构出待测样品的三维显微图像并存储至服务器端。
结合图6，步骤4具体包含以下步骤：
步骤1：获取原始图像数据；
服务器端接收到的原始图像数据共N组，i为1～N的整数；其中第i组数据中波长为λ1的图像为均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)，波长为λ2的图像为结构光照明图像Istructured(x,y,i)；
步骤2：分离双色照明图像；
彩色相机中的拜尔滤光器能够将原始图像数据按照波长λ1和波长λ2分离为两组独立照明图像数据Iuniform(x,y,i)与Istructured(x,y,i)；
步骤3：提取图像高频分量；
对第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)提取图像的高频分量IHi(x,y,i),公式如下：
IHi(x,y,i)＝F-1{HPf{F[Iuniform(x,y,i)]}} (1)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，HPf为高通滤波操作；
步骤4：提取图像低频分量；
利用第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)和结构光照明图像Istructured(x,y,i)计算局部对比度图像IC(x,y,i)，并提取图像焦平面上的低频分量ILo(x,y,i),公式如下：
ILo(x,y,i)＝F-1{LPf{F[IC(x,y,i)×Iuniform(x,y,i)]}} (2)；
IC(x,y,i)＝F-1{F{[(Iuniform(x,y,i)-2·Istructured(x,y,i))]×BFP}} (3)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，LPf为高通滤波操作，IC(x,y,i)为局部对比度图像，BFP为高斯带通滤波操作；
步骤5：融合HiLo光学切片图像；
将步骤3和步骤4提取的第i组数据中的焦平面高频分量和低频分量融合为所需HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)，公式如下：
IHiLo(x,y,i)＝IHi(x,y,i)+ηILo(x,y,i) (4)；
其中η为高频分量IHi(x,y,i)与低频分量ILo(x,y,i)之间的权重；
步骤6：第i+1组HiLo光学切片显微图像的获取；
对于第i+1组数据，重复步骤3～5，融合出第i+1组轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i+1)；由此，得到N组不同轴平面上的HiLo显微图像IHiLo(x,y,i)；
步骤7：重构三维HiLo显微图像；
将N组不同轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)拼接组合成待测样品的三维HiLo显微图像IHiLo(x,y,z)，公式如下：
实施例一：
图1为本发明实施例提供的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统整体结构示意图如图1所示，该显微成像系统主要包括光源模块A、光调制模块B、光收集模块C和样品载物台13。其中，光源模块A主要作用为：光纤合束器2将两种不同工作波长的光纤输出LED光源1出射光合束，并由光纤准直透镜3整形为准直、共轴的双波长光束，作为照明光源。光调制模块B用于将双波长入射光束调制为HiLo显微成像所需的正弦条纹结构照明光与平面波均匀照明光并投影照明光至待测样品处。光收集模块C实现不同轴平面上的样品图像采集以及数据传输功能，以完成三维显微成像。样品载物台13用于固定和调节待测样品。待测样品由载玻片与盖玻片固定保护。载物台设有载玻片安装槽与调整架，可调节调整架的位置及俯仰角度使照明光均匀覆盖待测样品。
图2为本发明实施例提供的光源模块结构示意图，如图2所示，光源模块主要包括两种不同工作波长的光纤输出LED的光源1、光纤合束器2以及光纤准直透镜3。光纤输出LED光源1的尾纤首先与光纤合束器2相连，双色输出光耦合进光纤合束器2后形成共光轴的发散光束。光纤准直透镜3的作用是将发散光束准直为共光轴的平行光束，以满足超表面的正入射条件。输出光为共轴、准直的双色光束，波长分别为532nm与633nm，分别对应波长复用超表面4产生HiLo显微成像所需两种照明光的工作波长，两种照明光为正弦条纹分布的结构光与相位平坦的均匀平面波。值得注意的是，在两种工作波长下，光纤合束器2要求具有较低的插入损耗，光纤准直透镜3则具备消色差的特性，以保证共轴准直输出双波长光束的光束质量。
图3为本发明实施例提供的光调制模块结构示意图，如图3所示；光调制模块B包含:波长复用超表面4、第一显微物镜6、偏振不敏感分束器7、电调液体变焦透镜8以及第二显微物镜9。其中，波长复用超表面4由透明衬底与周期性介质基本单元结构组成。基本单元结构为圆柱形纳米天线，周期晶格为正方形，纳米柱位于晶格中心，尺寸均为亚波长量级。通过合理设计基本单元结构参数与相位分布，波长复用超表面4可实现的功能为：当共光路的双波长光束正入射至超表面时，该器件可同时产生HiLo显微成像所需的相位平坦的均匀平面波照明光和正弦条纹分布的结构照明光。超表面器件固定于小型五轴位移台上，调节位移台的位置以及俯仰角度使光源模块的双色输出光正入射至超表面。超表面调制产生的两种照明光场由第一显微物镜6收集，照明光分别通过偏振不敏感分束器7、电调液体变焦透镜8以及第二显微物镜9后，透射投影至待测样品处。值得注意的是，光调制模块B中的第一显微物镜6、偏振不敏感分束器7、电调液体变焦透镜8以及第二显微物镜9在两种工作波长下均具备消色差的特性，以确保同时产生两种照明光位于同一轴平面。其中，两个显微物镜的各项参数均一致。电调液体变焦透镜的加载电压，调节加载电压使液体透镜按照设定步长逐步变焦。同时，液体透镜在调焦的过程中放大倍数与显微物镜匹配，保证照明光全覆盖待测样品。
图4为本发明实施例提供的光收集模块结构示意图，如图4所示；光收集模块C包括偏振不敏感分束器7、电调液体变焦透镜8、第二显微物镜9、套筒透镜10以及彩色相机11。待测样品反射回来的光首先由第二显微物镜9与电调液体变焦透镜8收集，收集光经过分束器7反射至套筒透镜10中，最后套筒透镜10再将收集光成像至彩色相机11的像元靶面上。光收集模块C中的套筒透镜10与第二显微物镜9构成无限远成像组，套筒透镜10的主要作用是消除系统像差。调节电调液体变焦透镜8的加载电压使照明光场沿光轴方向按照设定步长扫描覆盖整个待测样品。彩色相机11同步拍摄采集各扫描平面上的HiLo显微图像，并将数据上传至服务器端。
图5为本发明实施例提供的系统架构操作流程图。如图5所示，具体流程如下：
步骤1：准备待测样品。
将待测的生物样品置于载玻片上，滴入保护溶液，使用盖玻片固定并保护样品的完整性。将制作好的待测样品安装至样品载物台中的安装槽，调节载物台的调整架使待测样品垂直于光轴并位于第二显微物镜的工作距离上。
步骤2：调整照明光。
(1)驱动光源模块中的LED光源，产生波长复用超表面所需的共轴准直双色光束。
(2)驱动电调液体变焦透镜，使超表面调制产生的两种照明光覆盖待测样品的外表面。
步骤3：照明光扫描与图像采集。
设置电调液体变焦透镜的变焦步长ΔL，使液体透镜按照设定步长ΔL变焦，使照明光沿光轴方向扫描覆盖样品，采集次数为N，总行程L为待测样品的厚度，L＝NΔL。在每次采集过程中，液体透镜需按步长变焦且稳定，同步驱动彩色相机快门采集双色照明图像。
步骤4：三维显微图像重构与存储。
将步骤3采集的图像数据通过蓝牙传输至服务器端，服务器端首先借助彩色相机的拜尔滤光器，分离两种工作波长下的照明图像。分离后的两幅图像再借助HiLo算法融合为一副高分辨率的光学切片图像。最后组合N副光学切片图像重构出待测样品的三维显微图像并存储至服务器端。
图6为本发明实施例提供的三维显微图像重构流程图。如图6所示，具体流程如下：
步骤1：获取原始图像数据
服务器端接收到的原始图像数据I(x,y)共为2N组，其中波长λ1＝532nm的图像为均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)，共N组；波长λ2＝633nm的图像为结构光照明图像Istructured(x,y,i)，共N组；N为彩色相机的图像采集次数，i为1～N的整数；
步骤2：分离双色照明图像
彩色相机中的拜尔滤光器可以覆盖红绿蓝RGB三色三种光谱带，其中各光谱带之间互相独立，因此拜尔滤光器能够将原始图像数据按照波长λ1＝532nm和波长λ2＝633nm分离为两组独立照明图像数据Iuniform(x,y,i)与Istructured(x,y,i)；
步骤3：提取图像高频分量
对第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)进行高通滤波操作，提取图像焦平面上的高频分量IHi(x,y,i),公式如下：
IHi(x,y,i)＝F-1{HPf{F[Iuniform(x,y,i)]}} (1)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，HPf为高通滤波操作。
步骤4：提取图像低频分量
利用第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)和结构光照明图像Istructured(x,y,i)计算局部对比度图像IC(x,y,i)，并对局部对比度图像IC(x,y,i)进行低通滤波操作，提取图像焦平面上的低频分量ILo(x,y,i)，公式如下：
ILo(x,y,i)＝F-1{LPf{F[IC(x,y,i)×Iuniform(x,y,i)]}} (2)；
IC(x,y,i)＝F-1{F{[(Iuniform(x,y,i)-2·Istructured(x,y,i))]×BFP}} (3)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，LPf为高通滤波操作，IC(x,y,i)为局部对比度图像，BFP为高斯带通滤波操作。
步骤5：融合HiLo光学切片图像
将步骤3和步骤4提取的第i组数据中的焦平面高频分量和低频分量融合为所需HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)，公式如下：
IHiLo(x,y,i)＝IHi(x,y,i)+ηILo(x,y,i) (4)；
其中η为高频分量IHi(x,y,i)与低频分量ILo(x,y,i)之间的权重。
步骤6：第i+1组HiLo光学切片显微图像的获取
对于第i+1组数据，重复步骤3～5，融合出第i+1组轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i+1)。由此，得到N组不同轴平面上的HiLo显微图像IHiLo(x,y,i)。
步骤7：重构三维HiLo显微图像
将N组不同轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)拼接组合成待测样品的三维HiLo显微图像IHiLo(x,y,z)，公式如下：
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，包括：
沿光束传播方向布置的光源模块(A)、光调制模块(B)、样品载物台(13)和光收集模块(C)；
所述的光源模块(A)将两种不同工作波长光源的出射光合束，并整形为准直共轴的双波长光束；
所述的光调制模块(B)将双波长光束调制为HiLo显微成像所需的正弦条纹分布的结构照明光与相位平坦的均匀照明光并投影照明光至样品载物台(13)处；
所述光收集模块(C)实现不同轴平面上的样品图像采集以及数据传输；根据HiLo融合算法首先重构单个轴平面上的光学切片图像，组合多个光学切片图像以形成三维显微成像。
2.根据权利要求1所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述光调制模块(B)包括沿光路方向依次设置的波长复用超表面器件、第一显微物镜(6)、偏振不敏感分束器(7)、电调液体变焦透镜(8)和第二显微物镜(9)；
所述的波长复用超表面器件包括波长复用超表面(4)及超表面安装座(5)，使光源模块的双波长光束正入射至波长复用超表面(4)；
波长复用超表面(4)同时产生HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光，调制后的两种照明光由第一显微物镜(6)收集，经由偏振不敏感分束器(7)、电调液体变焦透镜(8)以及第二显微物镜(9)后，投影照明光至样品载物台(13)处。
3.根据权利要求2所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的波长复用超表面(4)包括透明衬底与布置在透明衬底上的多个基本单元结构，基本单元结构为介质纳米天线，介质纳米天线包括晶格以及设置在所述晶格上表面中心处的介质纳米柱；所述基本单元结构的尺寸均为亚波长量级；所述透明衬底的形状为正方形。
4.根据权利要求1、2或3所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的光收集模块(C)包括沿光路方向设置的第二显微物镜(9)、电调液体变焦透镜(8)、偏振不敏感分束器(7)、套筒透镜(10)以及彩色相机(11)；波长复用超表面(4)产生的两种照明光投影至待测样品处，经过样品的反射光首先由第二显微物镜(9)与电调液体变焦透镜(8)收集，收集光经过偏振不敏感分束器(7)反射至套筒透镜(10)中，套筒透镜(10)最后将收集光成像至彩色相机(11)的像元靶面上。
5.根据权利要求4所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的套筒透镜(10)为消像差透镜，与第二显微物镜(9)匹配，构成无限远成像组；
所述的彩色相机(11)与电调液体变焦透镜(8)变焦保持时间同步，拍摄采集各扫描平面上的HiLo显微图像；采集到的图像数据通过蓝牙上传至服务器端。
6.根据权利要求1、2或3所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的光源模块(A)包括两种不同工作波长的光源(1)、光纤合束器(2)和光纤准直透镜(3)；
光源(1)的尾纤与光纤合束器(2)相连，双波长输出光耦合进光纤合束器(2)后形成共光轴的发散光束；
光纤准直透镜(3)将发散光束准直为共光轴的平行准直输出光束。
7.根据权利要求1、2或3所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的光源模块(A)输出共轴准直的双色光束，工作波长分别为λ1与λ2，分别对应波长复用超表面(4)产生的HiLo显微成像所需的结构照明光与均匀照明光的两种工作波长。
8.根据权利要求1、2或3所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统，其特征在于，所述的样品载物台(13)用于固定和调节待测样品；
所述待测样品由载玻片与盖玻片固定保护，样品载物台(13)设有载玻片安装槽与调整架，调节调整架可使照明光均匀覆盖待测样品。
9.一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法，其特征在于，采用权利要求1-8任一所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像系统完成，其中，所述光调制模块(B)包括沿光路方向依次设置的波长复用超表面(4)、第一显微物镜(6)、偏振不敏感分束器(7)、电调液体变焦透镜(8)和第二显微物镜(9)；
具体流程如下：
步骤1：准备待测样品；
将待测的生物样品用载玻片制样后放置样品载物台(13)中，使待测样品垂直于光轴并位于第二显微物镜(9)的工作距离上；
步骤2：调整照明光；
驱动光源模块(A)中的光源(1)，产生波长复用超表面(4)所需的共轴准直双色光束；驱动电调液体变焦透镜(8)，使波长复用超表面(4)调制产生的两种照明光覆盖待测样品的外表面；
步骤3：照明光扫描与图像采集；
设置电调液体变焦透镜(8)的变焦步长ΔL，使电调液体变焦透镜(8)按照设定步长ΔL变焦，使照明光沿光轴方向扫描覆盖样品，采集次数为N，总行程L为待测样品的厚度，L＝NΔL；在每次采集过程中，电调液体变焦透镜(8)需按步长变焦且稳定，同步驱动彩色相机快门采集双色照明图像；
步骤4：三维显微图像重构与存储；
将步骤3采集的图像数据通过蓝牙传输至服务器端，服务器端首先借助彩色相机的拜尔滤光器，分离两种工作波长下的照明图像；分离后的两幅图像再借助HiLo算法融合为一副高分辨率的光学切片图像；最后组合N副光学切片图像重构出待测样品的三维显微图像并存储至服务器端。
10.根据权利要求9所述的基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法，其特征在于，所述的步骤4具体包含以下步骤：
步骤1：获取原始图像数据；
服务器端接收到的原始图像数据共N组，i为1～N的整数；其中第i组数据中波长为λ1的图像为均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)，波长为λ2的图像为结构光照明图像Istructured(x,y,i)；
步骤2：分离双色照明图像；
彩色相机中的拜尔滤光器能够将原始图像数据按照波长λ1和波长λ2分离为两组独立照明图像数据Iuniform(x,y,i)与Istructured(x,y,i)；
步骤3：提取图像高频分量；
对第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)提取图像的高频分量IHi(x,y,i),公式如下：
IHi(x,y,i)＝F-1{HPf{F[Iuniform(x,y,i)]}} (1)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，HPf为高通滤波操作；
步骤4：提取图像低频分量；
利用第i组数据的均匀光照明图像Iuniform(x,y,i)和结构光照明图像Istructured(x,y,i)计算局部对比度图像IC(x,y,i)，并提取图像焦平面上的低频分量ILo(x,y,i),公式如下：
ILo(x,y,i)＝F-1{LPf{F[IC(x,y,i)×Iuniform(x,y,i)]}} (2)；
IC(x,y,i)＝F-1{F{[(Iuniform(x,y,i)-2·Istructured(x,y,i))]×BFP}} (3)；
其中，F和F-1为傅里叶变换和逆变换操作，LPf为高通滤波操作，IC(x,y,i)为局部对比度图像，BFP为高斯带通滤波操作；
步骤5：融合HiLo光学切片图像；
将步骤3和步骤4提取的第i组数据中的焦平面高频分量和低频分量融合为所需HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i),公式如下：
IHiLo(x,y,i)＝IHi(x,y,i)+ηILo(x,y,i) (4)；
其中η为高频分量IHi(x,y,i)与低频分量ILo(x,y,i)之间的权重；
步骤6：第i+1组HiLo光学切片显微图像的获取；
对于第i+1组数据，重复步骤3～5，融合出第i+1组轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i+1)；由此，得到N组不同轴平面上的HiLo显微图像IHiLo(x,y,i)；
步骤7：重构三维HiLo显微图像；
将N组不同轴平面上的HiLo光学切片显微图像IHiLo(x,y,i)拼接组合成待测样品的三维HiLo显微图像IHiLo(x,y,z)，公式如下：
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|---|---|---|---|
| CN202310176762.6A CN116223379A (zh) | 2023-02-28 | 2023-02-28 | 一种基于波长复用超表面的快速三维显微成像方法和系统 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118688172A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-09-24 | 西南科技大学 | 基于dmd和led的三维光切片显微成像系统及成像方法 |
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2023
- 2023-02-28 CN CN202310176762.6A patent/CN116223379A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN118688172A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-09-24 | 西南科技大学 | 基于dmd和led的三维光切片显微成像系统及成像方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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