CN116218860A - 特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异性识别SLex的ssDNA适配体及其应用，从12639个测序结果中得到了3条与唾液酸化路易斯酸x（SLex）具有高亲和力和特异性的ssDNA适配体，并以ssDNA适配体作为SLex生物识别元件，生物量子点（Bio‑dots）作为信号标签，构建了一种基于适配体Bio‑dots和氨基苯硼酸修饰的磁珠三明治结构生物传感器检测SLex。本发明为SLex的检测提供了亲和力高、特异性高、易修饰和标记的识别元件和检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域，尤其涉及一种特异性识别唾液酸化路易斯酸x(SLex)的单链DNA适配体及其应用。
背景技术
SLex(Neu5Acα-2,3-Galβ-1,4-(Fucα-1,4-)GlcNAc)中文名为唾液酸化的路易斯酸x，是位于糖链非还原性末端的四糖，包含一个Galβ1-4GlcNAc骨架，Neu5Ac以α-2,3-糖苷键修饰在Gal上。SLex被鉴定为肿瘤相关抗原，并用作癌症诊断和预后的标志物或治疗目标。SLex因与不良预后相关而受到最广泛的关注。有研究表明SLex在靠血行扩散的癌转移中起重要作用，因此，鉴于SLex检测的重要性，开发检测SLex的技术具有重要意义。目前针对SLex的检测方法除了常用的高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱、核磁共振谱与质谱法外，还有基于硼酸盐的检测方法、基于凝集素的检测法和基于抗原抗体的检测方法。然而，以上这些检测方法仍有一定的局限性，存在实时跟踪检测、需要对样品进行预处理、抗体制备成本高、凝集素的靶向性差等问题。为了克服以上这些方法的缺陷，Jeong等人筛选了一种RNA适配体用于检测SLex。与DNA适配体相比，RNA适配体在生物介质和生命系统中容易被核酸酶快速降解。由于RNA呋喃糖环上缺少一个2'-羟基，需要进一步的化学合成和去保护基团反应，且RNA适配体制备需经过转录过程，从而导致RNA适配体生产成本更高，时间更长。基于以上原因，研究人员越来越喜欢选择DNA适配体进行生物传感器构建研究。因此，有必要筛选一款DNA适配体用于SLex检测，以弥补当前市场需求的空白。
目前，用于构建糖生物传感器的生物识别元件主要有凝集素、抗体、合成分子印迹聚合物和硼酸盐等。然而，由于糖的复杂性，上述生物识别元件在生物传感器的构建和应用中受到限制。例如，凝集素只能识别特定类型的糖，不能对糖进行进一步的差异分析。抗体制备成本高，限制了其在糖检测中的应用。合成的分子印迹聚合物与硼酸盐的亲和性和特异性较差。因此，有必要开发一种新的生物识别元件来构建糖生物传感器。适配体被称为人工抗体，是功能化的单链DNA(ssDNA)或RNA，可以特异性结合到特定的靶点，可通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)进行筛选获得。适配体具有制备简单、特异性强、亲和力高、免疫原性低、靶标范围广等优点，在食品、医药、分析化学等领域被广泛报道。此外，电化学法、比色法、荧光法、电化学发光法、光电化学法等检测技术已作为信号转换器与适配体结合使用共同构建生物传感器用于物质检测。
利用SELEX技术筛选不同靶标的适配体是目前普遍常用的方法。目前常用的小分子靶标适配体筛选技术有基于毛细管电泳的筛选方法(CE-SELEX)、基于固定单链DNA文库捕获的筛选方法(Capture-SELEX)和基于MB的筛选方法(MB-SELEX)。其中MB-SELEX是应用最广泛的高效筛选方法之一。MB-SELEX的早期策略是通过将靶标固定在MB上直接筛选适配体。靶标固定在MB上可能导致靶标与适配体结合存在空间位阻，并可能导致靶标官能团的损耗。由于靶标固定化筛选可能存在的一些缺陷，随后科研人员开发了基于DNA文库固定化的MB-SELEX。然而，目前报告的基于DNA文库固定化的MB-SELEX仍有改进的余地。例如，二级库的制备和候选适配体的分离比较复杂，容易导致假阳性和假阴性结果的产生。之前我们课题组改进了DNA文库固定MB-SELEX技术，简化了筛选程序。在筛选过程中，将PCR获得的双链DNA(dsDNA)固定在MB上，形成dsDNA文库固定化MB，并将荧光染料标记的对靶标具有高亲和力的ssDNA序列从MB上洗脱，便于追踪；该方法实现了小分子靶标适配体的快速高效筛选。
荧光法是最常用的生物传感器信号转换技术之一，近年来，由于量子点(QDs)所具有的高量子产率、良好的光学和化学稳定性、强的尺寸依赖性、大的摩尔消光系数、窄的发射光谱、对称性等特点，基于QDs的荧光生物传感器被大量报道。然而，无机量子点制备过程中使用的高毒性、有害溶剂/配体，以及其水溶性较差等特点，对其进一步的实际应用有一定限制。为了克服这些限制，人们报道了一类新的QDs，即直接由DNA或其他生物材料合成的Bio-dots。其中DNA Bio-dots既含有QDs的光学特性，同时还具有DNA的属性。如DNA所具有的茎、发夹、环、假结、凸起或G-四联体的组合等独特的3D结构将同时显现在DNA Bio-dots上。因此将DNA适配体制作成Bio-dots，同样使得Bio-dots具有适配体的功能。本发明基于Bio-dots的优良特性与适配体的优越性，开发了一种基于适配体的DNA Bio-dots。以期结合Bio-dots与适配体各自的优点，构建出一种基于适配体的Bio-dots用于SLex检测。
适配体Bio-dots的制备过程简单便捷，无其他有毒、有害溶剂/配体的参与，水溶性较好。研究证明，富含胞嘧啶的DNA Bio-dots通过具有芳香族结构的嘧啶碱基对的积累形成sp2碳中心，它不仅具有与碳量子点(Carbon dots，CQDs)相似的发光行为，而且还具有类似DNA的结构。这些特性使得它更容易扩展到荧光生物传感器的构造。此外，基于DNA的Bio-dots具有类似DNA的结构特性，有科研工作者以DNA适配体制作了Bio-dots用于生物传感器的构建，其结果表明适配体Bio-dots的应用是成功的。因此，本发明结合前人相关研究的进展，采用筛选获得的新适配体进行Bio-dots合成，将合成的适配体Bio-dots用于SLex的检测。
此外，硼酸可以通过可逆酯化作用与含二羟基的化合物形成可逆共价相互作用。因此，硼酸可以与唾液酸(SA)的三羟基侧链结合；这一令人印象深刻的结果使硼酸成为一种新型的SA检测的识别元件。目前有科研工作者基于硼酸盐对SA的识别作用构建了多种基于硼酸盐检测SA的生物传感器，且其中有人将3'-氨基苯硼酸(3'-APBA)制作成氨基苯硼酸功能化的CQDs，利用CQDs的发光特性及硼酸盐对SA的靶向特性构建了一个氨基苯硼酸功能化的CQDs生物传感器用于SA的检测；该生物传感器具有很宽的线性范围且能够达到54μmol·L-1的检出限(LOD)。鉴于硼酸盐对SA的靶向性，本发明欲在以硼酸盐作为SLex的第二识别元件，通过双识别元件达到提高适配体对SLex的特异性，以弥补适配体在SLex中特异性靶向的不足，从而提高构建的生物传感器的灵敏度与特异性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种特异性识别SLex的单链DNA适配体，并进一步基于适配体构建了一种荧光生物传感器，该荧光生物传感器可用于SLex的检测，有较优的灵敏度及准确度。
本发明公开了一种特异性识别SLex的ssDNA适配体，核苷酸序列为SEQ ID NO.1-3所示序列之一，具体的，SEQ ID NO.1-3的序列为：
SLex-Apt1(SEQ ID NO.1)：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAAAAATAAATTAATAAGCAATTTTATTTTTATCCTAGCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
SLex-Apt2(SEQ ID NO.2)：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAGTTAAATAAATTACCCCAATTTATTTATTTCCATTTCGACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
SLex-Apt16(SEQ ID NO.3)：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGATGGCAAAATATTAATTCCTGAACTGCGATTTAATATTTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
进一步地，ssDNA适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子，可为提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等，这些功能基团或分子能够提高ssDNA适配体的稳定性。
本发明的ssDNA适配体通过以下方法筛选得到：
S1、通过PCR扩增初始ssDNA文库，正向引物用FAM标记，反向引物用Biotin修饰，形成含FAM和Biotin标记的dsDNA产物；
ssDNA文库中的序列在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40个核苷酸的随机片段，
正向引物的核苷酸序列为：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′，
反向引物的核苷酸序列为：
5′-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，
正向引物和反向引物的其中一条修饰荧光基团，另一条修饰Biotin；
S2、将PCR扩增后获得的dsDNA通过链霉亲和素和Biotin相互作用固定在链霉亲和素修饰的MB表面，形成dsDNA文库固定后的MB；
S3、当dsDNA文库固定的MB与靶标孵育时，用FAM标记的对靶标具有高亲和力的ssDNA序列从MB上的dsDNA文库中脱落。通过测定磁性分离后上清液中FAM的荧光强度，可以判断其筛选效果，将上清液中的ssDNA收集起来，作为PCR扩增的模板，生成二级dsDNA文库，用于下一轮筛选；
S4、将S3步骤获得的次级dsDNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后进行测序；
S5、从S4步骤获得的测序结果中筛选出对SLex具有高亲和力和高特异性的序列，得到特异性识别SLex的ssDNA适配体。
进一步地，在S3步骤中，以SLex为正筛靶标，以Lex为反筛靶标。
进一步地，步骤S1构建的dsDNA文库为一段修饰有荧光基团，一端修饰有Biotin的dsDNA文库。
本发明的ssDNA适配体可用于SLex检测的组合物、试剂盒、传感器或芯片中，本发明即构建了一种用于检测SLex的生物传感器，包括上述ssDNA适配体中的一种或多种。
采用上述生物传感器检测SLex时具体包括以下步骤
S1、将3-APBA通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)羧基活化剂修饰在羧基化MB上；
S2、利用硼酸盐与SLex特异性结合的能力将靶标SLex结合到3-APBA修饰的MB上；
S3、将结合有SLex的3-APBA修饰的MB与适配体SLex-Apt2 Bio-dots孵育；
S4、由于适配体SLex-Apt2-Bio-dots能够特异性靶向SLex，通过磁性分离，将未结合的适配体SLex-Apt2-Bio-dots分离出来；
S5、测磁性分离后上清的荧光强度即可获得SLex的检测信号。
本发明首先应利用dsDNA文库固定MB-SELEX技术，以SLex为靶标，以Lex为反筛靶标，筛选SLex特异性的适配体。筛选后，对候选适配体进行分析和表征，确定亲和力最高的适配体。进一步地，将获得的SLex适配体用于适配体Bio-dots的合成，并运用氨基苯硼酸修饰的mb构建了一种三明治结构的荧光生物传感器用于SLex的检测。最后，建立荧光信号强度与SLex数量间的线性关系，利用该标准曲线计算样品中的SLex含量。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明首先通过改进后的dsDNA文库固定MB-SELEX方法用于筛选SLex特异性适配体，不仅简化了筛选程序，而且实现了小分子靶标适配体的高效筛选。基于MB-SELEX的SLex的DNA适配体筛选过程为14轮，其中第5轮为反筛。反筛后的荧光强度值明显弱于反筛前第4轮正筛的荧光强度值，证明反筛过程将能与反筛靶标SLex结合的候选适配体序列给清除了，从而增加了候选适配体序列与靶标SLex的特异性。高通量测序后共获得12639条SLex的候选适配体序列，根据同源性分类，将序列可分为9个家族。通过序列的稳定性和重复数量挑选出3条具有代表性的序列采用氧化石墨烯(GO)法进行亲和力和特异性表征。其结果表明所有候选适配体的亲和力较好，且其中80nt长度的SLex-Apt2(Kd＝23.01nmol·L-1)的亲和力最好。以SLex-Apt2序列进行特异性实验，结果表明SLex-Apt2适配体序列具有相对较高的靶向SLex。
(2)本发明构建了一种基于适配体Bio-dots和氨基苯硼酸修饰的MB三明治结构SLex生物传感器。该生物传感器原理简单明了，同样以双生物识别元件构建而成，克服了目前常用的SLex检测方法的局限性，如不然进行实时跟踪检测、需要对样品进行预处理、抗体制备成本高、凝集素的靶向性差等因素。且以新筛选出的DNA适配体为生物识别元件，克服了RNA适配体作为生物识别元件容易被核酸酶快速降解及生产成本更高，时间更长的缺点，填补了市场空白。尽管该生物传感器的LOD相对较高，但仍具有很大的应用价值。同时，该生物传感器证明了基于基于MB-SELEX的SLex特异性单链DNA适配体的筛选中所筛的SLexDNA适配体SLex-Apt2能够应用于SLex生物传感器的构建，该方法相比于传统的SLex检测方法，特异性强，灵敏度高，且开发出的适配体应用范围广。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为SLex的ssDNA适配体MB-SELEX及SLex荧光生物传感器检测原理图；
图2为SLex荧光检测标准曲线；
图3为ssDNA适配体亲和力验证结果；
图4为ssDNA适配体特异性验证结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法；所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例中所用的ssDNA文库、适配体、信号探针、及发夹探针的序列如表1所示。
表1序列表
N为A，T，C和G随机碱基排列序列，FAM为羧基荧光素，biotin为生物素。以上核苷酸序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将合成的初始文库、引物、适配体用灭菌水溶解，配制成100μmol/L的溶液，于-20℃冰箱保存备用。
实施例1：
(1)随机ssDNA文库及其引物的构建：
a.构建长度80个碱基的随机ssDNA文库
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′其中N代表碱基A，T，C，G中任一个。
b.合成正向引物：
正向引物Ⅱ-1：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；
正向引物Ⅱ-2：5′-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；
c.合成反向引物：
反向引物Ⅱ-1：5′-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
反向引物Ⅱ-2：5′-biotin-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′。
(2)核酸适配体的体外筛选：
S1、用含荧光基团的正向引物与修饰有Biotin的反向引物将80nt长度的单链DNA文库进行PCR扩增，构建用于SLex特异性适配体筛选的dsDNA文库，其中25μL的PCR扩增体系如表2所示。
表2PCR扩增体系
| 原料 | 浓度 | 体积 |
| 正向引物 | 10μmol·L-1 | 1μL |
| 反向引物 | 10μmol·L-1 | 1μL |
| 模板DNA | / | 1μL |
| 2×PrimeSTARMax Premix | / | 12.5μL |
| ddH2O | / | 补充至25μL体系 |
扩增条件:90℃，预变性5min；95℃，变性30s；55℃，退火1min；72℃，延伸1min，25个循环；72℃，延伸5min。
S2、向S1步骤中构建好的dsDNA文库加入链霉亲和素修饰的MB混匀，构建固定于MB表面的dsDNA文库，用缓冲液清洗MB四次，将多余的未固定文库洗去，具体方法如下：
用10mmol·L-1PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤dsDNA文库固定化MB四次，再将dsDNA文库固定化MB悬浮于200μL的Tris-HCl缓冲溶液。20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液用于SLex筛选。然后将5μL的SLex靶标与dsDNA固定化MB孵育，获得次级ssDNA文库。
S3、向S2步骤中构建好的固定MB珠表面的dsDNA文库中加入5μLSLex溶液，第1轮至第4轮靶标浓度为10mmol·L-1,第6轮至第14轮靶标浓度为1mmol·L-1(反筛时用相同浓度的靶标Lex代替),进行混匀，在25℃下轻摇1h，通过磁性分离获得含有ssDNA的上清液，测其荧光强度，同时取微量上清液作为PCR模板链用于下一轮PCR扩增，获取次级dsDNA文库；
S4、将S3步骤中获得的次级dsDNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化，判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后送样进行高通量测序；
S5、将S4步骤中获得的高通量测序结果进行序列统计与比对分析，从中挑选出SLex-Apt1、SLex-Apt2、SLex-Apt16这3条候选适配体序列进行合成；
S6、将S5步骤合成的3条序列采用氧化石墨烯(GO)吸附法进行亲和力与特异性测试，具体方法及结果如下；
利用解离常数(Kd)表征适配体对靶标的亲和力，并用GO吸附法进行测定。500μL不同浓度(200、400、600、800和1000nmol·L-1)的5'-FAM标记的适配体序列(见表1)与100μL的Tris-HCl缓冲溶液混匀，在90℃下变性10min，然后在0℃冷却10min。然后加入20μL GO(1.5mg·mL-1)室温孵育2h，再加入20μL靶标(1mmol·L-1)，混匀后室温孵育1h。孵育后，以13000r·min-1离心5min，收集上清液中的靶标结合序列，用Biotek多功能酶标仪在激发波长485nm和发射波长528±5nm下测定其荧光强度。通过方程y＝Bmax[free ssDNA]/(Kd+[free ssDNA])估计Kd值，利用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性拟合。y表示磁性分离后上清的荧光强度，Bmax表示候选适配体与靶标最大结合位点的值，[free ssDNA]表示候选适配体的浓度。从而获得各适配体的亲和力Kd值，如图3所示。
采用GO法评估候选适配体的特异性。测定SLex的适配体序列时，将200μL的1μmol·L-1适配体与20μL GO(1.5mg·mL-1)在25℃下孵育2h。然后，分别加入5μL的1mmol·L- 1SLex或10mmol·L-1其他化合物(Lex、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、Neu5Ac和乳糖)，在25℃下孵育1h，测定上清液的荧光强度(激发波长485nm和发射波长528±5nm)。将获得荧光强度值绘制出相应的曲线，如图4所示。
其中，SLex-Apt1的序列具体为：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAAAAATAAATTAATAAGCAATTTTATTTTTATCCTAGCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
SLex-Apt2的序列具体为：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAGTTAAATAAATTACCCCAATTTATTTATTTCCATTTCGACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
SLex-Apt16的序列具体为：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGATGGCAAAATATTAATTCCTGAACTGCGATTTAATATTTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′。
实施例2：
S1、适配体Bio-dots的制备：
采用水热法制备适配体Bio-dots。将适配体序列SLex-Apt2的固体粉末用冷冻离心机以10000r·min-1离心1min，之后加入超纯水溶解混匀，得到终浓度为10μmol·L-1的适配体SLex-Apt2水溶液。将混匀后的适配体SLex-Apt2水溶液转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜(25mL)中，适配体SLex-Apt2水溶液体积不超过反应釜体积1/3。将反应釜拧紧后放置恒温干燥箱在100℃下加热12h。最后，从反应釜中取出的适配体SLex-Apt2水溶液即是浓度为10μmol·L-1的适配体SLex-Apt2-Bio-dots。将SLex-Apt2-Bio-dots转移至棕色离心管中，用锡纸包裹放4℃冰箱冷藏以备接下来的实验使用；
S2、氨基苯硼酸修饰的MB构建：
取5mg/mL羧基化MB溶液50μL，用10mmol·L-1PBS缓冲溶液(pH 7.4)清洗3遍后再20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液清洗一遍。清洗过程：加200μL的PBS冲溶液(pH 7.4)至羧基化MB中，震荡混匀后用磁力架磁性分离，分离时间为1min，弃上清。将200μL配置好的3-氨基苯硼酸溶液(50mmol·L-1)加入清洗后的MB中，3min后加入10mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)震荡混匀，室温反应3h(放于摇床25℃，220rpm，3h)。之后取出震荡混匀，经磁力架磁性分离后弃上清，用20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍MB，清洗后的MB即为氨基苯硼酸偶联后的羧基化MB；
S3、氨基苯硼酸修饰后的羧基化MB与靶标孵育；
将氨基苯硼酸偶联后的羧基化MB与50μL，20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液配置的SLex溶液(1mmol·L-1)轻微震荡混匀，加入150μL，20mmol·L-1Tris-HCl室温反应1h(放于摇床25℃，220rpm，1h)。之后取出震荡混匀，经磁力架磁性分离后弃上清，靶标孵育后的羧基化MB以备下一步实验使用；
S4、SLex的检测:
将靶标孵育后的羧基化MB与100μL适配体SLex-Apt2-Bio-dots(10μmol·L-1)混匀，之后加入100μL，20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液遮光轻微震荡混匀，室温反应1h(放于摇床25℃，220rpm，1h)。取上清，用荧光分光光度计测荧光波长，同时用酶标仪测其荧光强度，激发波长为310nm，发射波长为400nm,根据测定荧光值与加SLex浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。
如图2所示，荧光强度随着SLex浓度的增加而增加，其线性回归方程是(F0-F)/F0＝0.233*lg c+0.777(R2＝0.993)，F和F0分别为SLex存在和不存在时适配体SLex-Apt2-Bio-dots的荧光强度(400±5nm)。根据3倍的空白样品标准偏差与线性回归方程斜率之比(S/N＝3)，计算出该方法的LOD为32μmol·L-1。
实施例3：
为了进一步验证该方法在测定实际样品中SLex含量时的准确性，选用了SLex加标正常人血清样品，并按照标准样品进行检测。
首先将血清样品用20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液稀释50倍，之后添加不同的含量SLex,将血清样品与100μL适配体SLex-Apt2-Bio-dots(10μmol·L-1)混匀，之后加入100μL，20mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液遮光轻微震荡混匀，室温反应1h(放于摇床25℃，220rpm，1h)。取上清，用荧光分光光度计测荧光波长，同时用酶标仪测其荧光强度，激发波长为310nm，发射波长为400nm，代入标准曲线可计算出SLex的浓度。
具体样品和检测结果结果如表3所示。样品中SLex的回收率在96.62％～103.75％之间，相对标准偏差(RSD)在3.9％～8.6％之间，其结果证明该方法适用于复杂样品中SLex的检测。
表3SLex检测准确度结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (7)
1.一种特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体，其特征在于，所述ssDNA适配体的核苷酸序列为Apt1，Apt2或Apt16；
Apt1：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAAAAATAAATTAATAAGCAATTTTATTTTTATCCTAGCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
Apt2：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAGTTAAATAAATTACCCCAATTTATTTATTTCCATTTCGACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；
Apt16：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGATGGCAAAATATTAATTCCTGAACTGCGATTTAATATTTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体，其特征在于，ssDNA适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。
3.一种如权利要求1所述的ssDNA适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过PCR扩增初始ssDNA文库，正向引物用羧基荧光素FAM标记，反向引物用生物素Biotin修饰，形成含羧基荧光素FAM和生物素Biotin标记的dsDNA产物；
ssDNA文库中的序列在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40个核苷酸的随机片段，
正向引物的核苷酸序列为：
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′，
反向引物的核苷酸序列为：
5′-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，
正向引物和反向引物的其中一条修饰荧光基团，另一条修饰生物素Biotin；
S2、将PCR扩增后获得的dsDNA通过链霉亲和素和生物素Biotin相互作用固定在链霉亲和素修饰的磁珠MB表面，形成dsDNA文库固定后的MB；
S3、当dsDNA文库固定的MB与靶标孵育时，用羧基荧光素FAM标记的对靶标具有高亲和力的ssDNA序列从MB上的dsDNA文库中脱落；通过测定磁性分离后上清液中FAM的荧光强度，可以判断其筛选效果，将上清液中的ssDNA收集起来，作为PCR扩增的模板，生成二级dsDNA文库，用于下一轮筛选；
S4、将S3步骤获得的次级dsDNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后进行测序；
S5、从S4步骤获得的测序结果中筛选出对SLex具有高亲和力和高特异性的序列，得到特异性识别SLex的ssDNA适配体。
4.一种权利要求1-2任意一项所述的ssDNA适配体在检测唾液酸化路易斯x(SLex)中的应用。
5.一种可用于唾液酸化路易斯酸x检测的组合物、试剂盒、传感器或芯片，其特征在于：包括权利要求1所述的ssDNA适配体中的一种或多种。
6.一种用于检测唾液酸化路易斯酸x的荧光生物传感器，其特征在于:包括权利要求1所述的ssDNA适配体中的一种或多种，还包括与获得的适配体进行的适配体Bio-dots的合成，量子点为Bio-dots。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:采用所述荧光生物传感器检测SLex时包括以下步骤：
S1、选取权利要求1所述的单链DNA适配体中的一种或多种，用于适配体Bio-dots的合成，进一步构建生物传感器；
S2、将3-氨基苯硼酸(3-APBA)通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)羧基活化剂修饰在羧基化MB上；其次利用硼酸盐与SLex特异性结合的能力将靶标SLex结合到3-APBA修饰的MB上；
S3、然后将结合有靶标SLex的3-APBA修饰的MB与适配体SLex-Apt2 Bio-dot孵育通过磁性分离，将未结合的适配体SLex-Apt2 Bio-dot分离出来；
S4、检测磁性分离后上清的荧光强度变化，构建荧光强度与SLex浓度的标准曲线，计算得到待测样品中SLex的含量。
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| CN105842210A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-08-10 | 南昌大学 | 基于生物量子点和Au NPs荧光共振能量转移的凝血酶检测方法 |
| US20200072821A1 (en) * | 2017-02-28 | 2020-03-05 | National University Of Ireland, Galway | In vitro screening and selection of specific dna aptamers against the non-human sialic acid, n-glycolyl neuraminic acid (neu5gc) |
-
2023
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