CN116218756A - 一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，该方法是将华蕉突变体“派露丝”胚性悬浮系在复合酶液中进行酶解获得原生质体，复合酶液的组成包括204～210mM KCl、67～73mM CaCl25～6％果胶酶、1～2％纤维素酶、11～13％甘露醇，原生质体融合采用聚乙二醇法进行融合，融合液组成为204～210mM KCl、67～73mM CaCl2、0.5～0.6mM MES、11～13％甘露醇、30～40％聚乙二醇。本发明首次解决“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合问题，获得融合细胞，并且操作简单，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及香蕉育种技术领域，具体涉及一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法。
背景技术
香蕉有多种基因型，分为二倍体、三倍体和四倍体等，其中，三倍体为商业种植的主要类型。三倍体高度不育、不结种子，只能无性繁殖，因此通过传统杂交育种方法难以获得新品种，而利用细胞杂交技术是获得香蕉新品种的育种途径之一。建立适合于目标基因型的稳定高效的香蕉原生质体培养及其融合再生系体系是进行香蕉体细胞杂交育种的前提。但是，香蕉原生质体培养及其融合再生与香蕉基因型或品种关系很大，也就是说不同香蕉品种其原生质体制备和融合再生也不同。不同品种的香蕉原生质体酶解的酶组成或成分比率相差也很大，缓冲液浓度也不同，酶解时间也差异较大。“派露丝”为华蕉突变体，基因型为AAA，是近几年选育出的香蕉新品种，目前，尚无关于该品种的原生质体制备和融合方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对华蕉突变体“派露丝”品种，提供一种简便快捷低成本的原生质体制备和融合方法。
本发明方案包括：
一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，包括以下步骤：
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养胚性悬浮细胞与酶解液混合，震荡酶解；
酶解液组成包括：204～210mM KCl、67～73mM CaCl2、5～6w/v％果胶酶、1～2w/v％纤维素酶、11～13w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：原生质体过滤、离心后，重悬，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体；
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用碘乙酰胺处理，将碘乙酰胺处理后的混合液洗涤，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释；
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释，然后铺成薄层，紫外灯照射；
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体混合得到原生质体悬液；将原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入融合液，静置；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复操作；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物。
融合液组成包括：204～210mM KCl、67～73mM CaCl2、0.5～0.6mM MES、11～13w/v％甘露醇、30～40w/v％聚乙二醇(PEG4000)。
优选的，所述胚性悬浮细胞为继代培养4-5d的胚性悬浮细胞。选择继代4-5d的胚性悬浮细胞作为材料制备原生质体，可以获得更优质的原生质体。
优选的，酶解时间是15～17h。
优选的，步骤(2)中，采用处理液进行重悬；处理液的组成包括204mM KCl、67mMCaCl2、0.5mM MES、11w/v％甘露醇。
优选的，原生质体液体培养基的组成包括：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/L MES和50g/L蔗糖。
优选的，紫外灯照射的时间是90s，照射强度为50μW/mm2。
优选的，步骤(5)中，受体原生质体和供体原生质体的体积比为1：1。
优选的，步骤(5)为：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200～300μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3～5倍体积的融合液，静置30～45min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10～15min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复操作；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物。
优选的，融合液组成包括：204mM KCl、67mM CaCl2、0.5mM MES、11w/v％甘露醇、40w/v％聚乙二醇。
优选的，酶解液组成包括：204mM KCl、67mM CaCl2、5w/v％果胶酶、2w/v％纤维素酶、11w/v％甘露醇。选择继代4-5d的胚性悬浮细胞作为材料制备原生质体，可以获得更优质的原生质体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一套的“派露丝”原生质体制备及融合技术，填补了AAA基因型香蕉突变体原生质体杂交技术方面的空白。
(2)本发明以“派露丝”(AAA)胚性悬浮细胞为研究材料，通过酶解液、处理液、原生质体液体培养基的结合获得高活力的原生质体，在此基础上进一步优化融合液配方，提高了原生质体总融合率和一对一相融合率。
(3)本方法原生质体总融合率达到70％，一对一融合率最高可达到37％；
(3)本发明方法操作简单，所用试剂价格低廉，利于科研工作者的实验研究。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
本文所述MES为2-(N-吗啡林)乙磺酸。
实施例1：一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法
香蕉材料为：华蕉突变体“派露丝”(AAA)(植物新品种权号:CAN20120829.1)。
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养4-5d的胚性悬浮细胞与酶解液按照细胞密实体积与酶解液体积比1：4进行混合，在25℃、黑暗条件下以转速70rpm震荡酶解15h；
酶解液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+5w/v％果胶酶+2w/v％纤维素酶+11w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：先用100μm的细胞筛过滤，再用40μm的细胞筛过滤，然后800rpm、离心10min，用处理液重悬(处理液：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mMMES+11w/v％甘露醇)，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理20min，将碘乙酰胺处理后的混合液用处理液(处理液：204mMKCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇)洗涤3次，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释为105个/mL。
原生质体液体培养基的组成为：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/L MES和50g/L蔗糖。
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度105个/mL，然后铺成1-2层细胞的薄层，紫外灯照射90s。照射强度为50μW/mm2。
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3倍体积的融合液，静置30min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复3次；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物；融合后，经过融合细胞的看护培养、体胚诱导等步骤长出再生植株。
融合液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇+40w/v％聚乙二醇，pH 5.8。
实施例2:一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法
香蕉材料为：华蕉突变体“派露丝”(AAA)(植物新品种权号:CAN20120829.1)。
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养4-5d的胚性悬浮细胞与酶解液按照细胞密实体积与酶解液体积比1：4进行混合，在25℃、黑暗条件下以转速70rpm震荡酶解15h；
酶解液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+6w/v％果胶酶+1w/v％纤维素酶+11w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：先用100μm的细胞筛过滤，再用40μm的细胞筛过滤，然后800rpm、离心10min，用处理液重悬(处理液：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mMMES+11w/v％甘露醇)，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理20min，将碘乙酰胺处理后的混合液用处理液(处理液：204mMKCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇)洗涤3次，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释为105个/mL。
原生质体液体培养基的组成为：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/L MES和50g/L蔗糖。
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度105个/mL，然后铺成1-2层细胞的薄层，紫外灯照射90s。照射强度为50μW/mm2。
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3倍体积的融合液，静置30min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复3次；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物；融合后，经过融合细胞的看护培养、体胚诱导等步骤长出再生植株。
融合液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11％甘露醇+40％聚乙二醇，pH5.8。
实施例3一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法
香蕉材料为：华蕉突变体“派露丝”(AAA)(植物新品种权号:CAN20120829.1)。
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养4-5d的胚性悬浮细胞与酶解液按照细胞密实体积与酶解液体积比1：4进行混合，在25℃、黑暗条件下以转速70rpm震荡酶解15h；
酶解液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+5w/v％果胶酶+2w/v％纤维素酶+11w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：先用100μm的细胞筛过滤，再用40μm的细胞筛过滤，然后，800rpm、离心10min，用处理液重悬(处理液：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mMMES+11w/v％甘露醇)，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理20min，将碘乙酰胺处理后的混合液用处理液(处理液：204mMKCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇)洗涤3次，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释为105个/mL。
原生质体液体培养基的组成为：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/L MES和50g/L蔗糖。
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度105个/mL，然后铺成1-2层细胞的薄层，紫外灯照射90s。照射强度为50μW/mm2。
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3倍体积的融合液，静置30min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复3次；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物；融合后，经过融合细胞的看护培养、体胚诱导等步骤长出再生植株。
融合液组成为：210mM KCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+13w/v％甘露醇+40w/v％聚乙二醇，pH 5.8。
实施例4：一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法
香蕉材料为：华蕉突变体“派露丝”(AAA)(植物新品种权号:CAN20120829.1)。
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养4-5d的胚性悬浮细胞与酶解液按照细胞密实体积与酶解液体积比1：4进行混合，在25℃、黑暗条件下以转速70rpm震荡酶解15h；
酶解液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+5w/v％果胶酶+2w/v％纤维素酶+11w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：先用100μm的细胞筛过滤，再用40μm的细胞筛过滤，然后，800rpm、离心10min，用处理液重悬(处理液：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mMMES+11w/v％甘露醇)，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理20min，将碘乙酰胺处理后的混合液用处理液(处理液：204mMKCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇)洗涤3次，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释为105个/mL。
原生质体液体培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/LMES和50g/L蔗糖。
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度105个/mL，然后铺成1-2层细胞的薄层，紫外灯照射90s。照射强度为50μW/mm2。
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3倍体积的融合液，静置30min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复3次；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物；融合后，经过融合细胞的看护培养、体胚诱导等步骤长出再生植株。
融合液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇+40w/v％聚乙二醇，pH 5.8。
对比例1：一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法
香蕉材料为：华蕉突变体“派露丝”(AAA)(植物新品种权号:CAN20120829.1)。
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养4-5d的胚性悬浮细胞与酶解液按照细胞密实体积与酶解液体积比1：4进行混合，在25℃、黑暗条件下以转速70rpm震荡酶解15h；
酶解液组成为：204mM KCl+67mM CaCl2+5w/v％果胶酶+2w/v％纤维素酶+11w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：先用100μm的细胞筛过滤，再用40μm的细胞筛过滤，然后，800rpm、离心10min，用处理液重悬(处理液：204mM KCl+67mM CaCl2+0.5mMMES+11w/v％甘露醇)，离心两次，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体。
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理20min，将碘乙酰胺处理后的混合液用处理液(处理液：204mMKCl+67mM CaCl2+0.5mM MES+11w/v％甘露醇)洗涤3次，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释为105个/mL。
原生质体液体培养基的组成为：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/L MES和50g/L蔗糖。
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度105个/mL，然后铺成1-2层细胞的薄层，紫外灯照射90s。照射强度为50μW/mm2。
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3倍体积的融合液，静置30min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复3次；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物；融合后，经过融合细胞的看护培养、体胚诱导等步骤长出再生植株。
融合液组成为：40w/v％聚乙二醇，pH 5.8。
为了说明本发明的效果，分别统计了前述实施例和对比例的总融合率和一对一融合率。每组3次重复。结果见下表。
总融合率＝(视野中融合的原生质体总数/视野中原生质体总数)×100％；
一对一融合率＝(视野中一对一紧密靠近融合的原生质体数/视野中原生质体的总数)×100％。
表1
| 总融合率％ | 一对一融合率％ | |
| 实施例1 | 70％～74％％ | 35％～37％ |
| 实施例2 | 60％～65％ | 30％～34％ |
| 实施例3 | 57％～61％ | 28％～31％ |
| 实施例4 | 62％～65％ | 33％～35％ |
| 对比例1 | 46％～50％ | 18％～22％ |
研究结果表明，比较实施例1和对比例1可知，本发明在高钙基础下，添加204～210mM KCl和11～13w/v％甘露醇，可为原生质体提供合适的融合环境，促进原生质体融合，融合效率更高。对比各实施例的统计结果可知，通过特定的酶液配比、液体培养基配比可以提高原生质体活力和质量，促进原生质体融合，提高融合率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)“派露丝”香蕉原生质体的分离：将继代培养胚性悬浮细胞与酶解液混合，震荡酶解；
酶解液组成包括：204～210mM KCl、67～73mM CaCl2、5～6w/v％果胶酶、1～2w/v％纤维素酶、11～13w/v％甘露醇；
(2)“派露丝”原生质体的纯化：原生质体过滤、离心后，重悬，离心，收集原生质体，得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体；
(3)“派露丝”受体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉受体原生质体采用碘乙酰胺处理，将碘乙酰胺处理后的混合液洗涤，最后用原生质体液体培养基将原生质体浓度稀释；
(4)“派露丝”供体原生质体的处理：将步骤(2)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释，然后铺成薄层，紫外灯照射；
(5)“派露丝”原生质体的PEG融合：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体混合得到原生质体悬液；将原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入融合液，静置；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复操作；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物。
融合液组成包括：204～210mM KCl、67～73mM CaCl2、0.5～0.6mM MES、11～13w/v％甘露醇、30～40w/v％聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，所述胚性悬浮细胞为继代培养4-5d的胚性悬浮细胞。
3.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，酶解时间是15～17h。
4.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，步骤(2)中，采用处理液进行重悬；处理液的组成包括204mM KCl、67mM CaCl2、0.5mM MES、11w/v％甘露醇。
5.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，原生质体液体培养基的组成包括：MS培养基、0.5mg/L 6-BA、2mg/L 2,4-D、60g/L葡萄糖、0.2g/LMES和50g/L蔗糖。
6.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，紫外灯照射的时间是90s，照射强度为50μW/mm2。
7.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，步骤(5)中，受体原生质体和供体原生质体的体积比为1：1。
8.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，步骤(5)为：将步骤(3)的受体原生质体和步骤(4)的供体原生质体按体积比1：1混合得到原生质体悬液；将200～300μL原生质体悬液均匀铺在培养皿中央成圆形，再加入3～5倍体积的融合液，静置30～45min；沿原生质体悬液边缘吸出液体，然后在原生质体悬液边缘滴加原生质体液体培养基，静置10～15min，然后沿原生质体悬液边缘吸出原生质体液体培养基，重复操作；再加入原生质体液体培养基，混匀，得到融合产物。
9.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，融合液组成包括：204mM KCl、67mM CaCl2、0.5mM MES、11w/v％甘露醇、40w/v％聚乙二醇。
10.根据权利要求1所述“派露丝”香蕉的原生质体制备和融合方法，其特征在于，酶解液组成包括：204mM KCl、67mM CaCl2、5w/v％果胶酶、2w/v％纤维素酶、11w/v％甘露醇。
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