CN116211875A - 替加环素在制备抑制肝癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种替加环素在制备抑制肝癌的药物中的应用。本发明首次揭示替加环素(Tigecycline)对于肝癌具有非常显著的抑制作用。对于一些药物敏感性低的肝癌细胞，将替加环素与MEK抑制剂联合应用，两者发挥协同增效功能，对于药物敏感性低的肝癌具有极为显著的抑制作用。

Description

替加环素在制备抑制肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及替加环素在制备抑制肝癌的药物中的应用。

背景技术

肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病，其所导致的死亡率一直占据人类疾病死亡率的前位，极大程度地威胁着患者身心健康。尽管近几年来肿瘤的诊治水平越来越高，但是远未达到人们对于健康生活的需求，还需要大量的研究工作来进一步地提高患者的生存率以及患病后的生活水平。

肝癌作为一种恶性程度高的肿瘤，其发病率高、生存率低。目前针对肝癌的主要临床治疗手段如手术、化疗等，对进展期肝癌患者的总体治疗效果不尽人意。

肝癌作为一种复杂性疾病，与多种危险因素密切相关。如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、饮酒和吸烟等危险因素都有助于肝癌的发生发展。由于肝癌恶性程度高，发展速度快，转移能力强，治疗后易复发。单纯的手术治疗、肝动脉结扎插管治疗、介入治疗、局部治疗、放射治疗等治疗手段均难以取得满意的效果。

因此，本领域亟待研究和开发提高肝癌的治疗疗效的药物，以期进一步提高患者的生存率以及患病后的生活水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种替加环素在制备抑制肝癌的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供化合物或化合物组合的应用，用于制备抑制肝癌的组合物；所述的化合物或化合物组合为：替加环素；或,替加环素与MEK抑制剂的组合。

在一个或多个实施方案中，所述的抑制肝癌包括：预防、缓解和/或治疗肝癌。

在一个或多个实施方案中，所述的肝癌包括早期、中期或晚期肝癌。

在一个或多个实施方案中，所述的肝癌包括肝细胞癌。

在一个或多个实施方案中，所述的替加环素与MEK抑制剂的组合用于抑制耐药性的肝癌。

在一个或多个实施方案中，所述耐药性的肝癌为：对单独使用替加环素或MEK抑制剂的敏感性低的肝癌。

在一个或多个实施方案中，所述的MEK抑制剂包括(但不限于)：曲美替尼(Trametinib)，考比替尼(Cobimetinib)，司美替尼(Selumetinib)，PD184352，U0126-EtOH，KO-947，AZD0364。

在一个或多个实施方案中，替加环素与MEK抑制剂的组合中，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为16～400:1.

在一个或多个实施方案中，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为30～200:1(如40:1，50:1，60:1，70:1，80:1，90:1，100:1，120:1，140:1，160:1，180:1)。

在一个或多个实施方案中，在细胞水平上(作用于肝癌细胞时)，所述MEK抑制剂的终浓度为25～1250nM，较佳地50～1000ug/mL，更佳地80～800nM；如100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、500nM、600nM、700nM。

在一个或多个实施方案中，在细胞水平上(作用于肝癌细胞时)，所述替加环素的终浓度为2～80μM，较佳地为4～60μM，更佳地为6～50μM；如7μM、8μM、10μM、12μM、16μM、18μM、20μM、25μM、30μM、40μM、55μM。

在一个或多个实施方案中，在动物水平上，替加环素与MEK抑制剂的组合中，替加环素与MEK抑制剂的重量比例为20～1000:1；较佳地50～500:1；更佳地，100～300:1；更佳地150～250:1。

在本发明的另一方面，提供一种用于特异性抑制肝癌的药物组合物或药盒，包括：替加环素，以及MEK抑制剂；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

在一个或多个实施方案中，所述用于特异性抑制肝癌的药物组合物或药盒中，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为16～400:1；更佳地，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为30～200:1(如40:1，50:1，60:1，70:1，80:1，90:1，100:1，120:1，140:1，160:1，180:1)。

在一个或多个实施方案中，所述的药物组合物的剂型是：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂；较佳地为注射剂。

在一个或多个实施方案中，所述的药盒中，所述的替加环素及MEK抑制剂被独立地分置于不同的容器/包装中(较佳地按照比例分置)，或者两者被混合于同容器/包装中。

在一个或多个实施方案中，所述的药盒中还含有：使用说明书，说明抑制癌症的方法。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肝癌的混合物，所述混合物由替加环素，以及MEK抑制剂组成；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

在本发明的另一方面，提供一种制备抑制肝癌的药物组合物或药盒的方法，包括：将替加环素与MEK抑制剂混合；或将替加环素与MEK抑制剂置于同一药盒中；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

在一个或多个实施方案中，将替加环素与MEK抑制剂混合后，还包括与药学上可接受的载体或赋形剂混合。

在一个或多个实施方案中，所述的替加环素，或替加环素与MEK抑制剂的组合，根据用药疗程分为单位剂型。

在本发明的另一方面，提供一种提高MEK抑制剂(作为抗肿瘤药物时)的抑制肝癌的效果的方法，所述方法包括：以替加环素与MEK抑制剂混合应用于抑制肝癌，或联合应用于抑制肝癌；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

在一个或多个实施方案中，可以是非治疗性的方法，或细胞水平上的方法，或体外的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，这些组合的方案也被包含在本发明中。

附图说明

图1A-B、基于全基因组(包含约19100个基因，76400个sgRNA)的CRISPR/Cas9高通量筛选技术鉴定影响SNU398和HepG2细胞增殖的基因。

图1C、分析共同影响SNU398和HepG2细胞增殖的基因，发现共有455个基因，其中70个基因与线粒体功能相关。

图1D、经富集分析，线粒体翻译及下游氧化磷酸化相关基因与肝癌细胞生存高度相关。

图2、细胞增殖实验表明大部分肝癌细胞(SNU398、Huh6、HepG2等)对替加环素敏感性高，小部分肝癌细胞(如MHCC97H、PLC/PRF/5、Li7)对替加环素相对敏感性低。

图3、利用替加环素敏感肝癌细胞株SNU398构建裸鼠皮下移植瘤模型。5x10⁶细胞皮下注射，13天后裸鼠皮下瘤体积达到100mm³左右，将其随机分为对照组(Control,n＝6)和替加环素处理组(Tigecycline,n＝6)，给药处理12天，记录裸鼠皮下移植瘤的体积变化(A)及裸鼠体重变化(B)。给药结束后，记录肿瘤形态及瘤重(C)。

图4A、化合物库筛选(n＝1957)针对替加环素不敏感细胞系(PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7)的联合用药方案。将MHCC97H细胞分为对照组(Control)和替加环素处理组(Tigecycline)，分别加用2μM化合物，作用3天后，细胞活性检测筛选出增敏替加环素药效的前30名化合物。将排名前30的化合物在PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7细胞中进行第二轮复筛。

图4B、分析排名前30的复筛结果表明，MEK抑制剂如曲美替尼(Trametinib)，考比替尼(Cobimetinib)及司美替尼(Selumetinib)能增加替加环素的敏感性。

图5、Incucyte细胞实时观察实验及细胞增殖实验表明联用曲美替尼(Trametinib)或考比替尼(Cobimetinib)与替加环素在MHCC97、PLC/PRF/5、Li7细胞中具有协同抑制效应；其中，左列为Incucyte细胞实时观察实验的结果，右列为细胞增殖实验的结果。

图6、利用替加环素不敏感肝癌细胞株MHCC97H构建裸鼠皮下移植瘤模型。5x10⁶细胞皮下注射，7天后裸鼠皮下瘤体积达到100mm³左右，将其随机分为对照组(Control,n＝6)、替加环素处理组(Tigecycline,n＝6)、曲美替尼处理组(Trametinib,n＝6)及联合用药组(n＝6)，给药处理22天，记录裸鼠皮下移植瘤的体积变化(A)及裸鼠体重变化(B)。给药结束后，记录肿瘤形态及瘤重(C)。

具体实施方式

通过全基因组高通量筛选技术、靶基因富集分析等前期工作，经过广泛而深入的研究筛选，本发明人从大量的候选化合物中选择到线粒体翻译抑制剂替加环素(Tigecycline)，其对于肝癌具有非常显著的抑制作用。对于一些药物敏感性低的肝癌细胞，本发明人将替加环素与MEK抑制剂联合应用，两者发挥协同增效功能，对于药物敏感性低的肝癌具有极为显著的抑制作用。

替加环素

本发明人基于CRISPR/Cas9系统的高通量筛选技术，通过全基因组高通量筛选技术(约19100个基因，76400个sgRNA)鉴定可用于肝癌治疗的潜在靶点。在两株常见肝癌细胞株SNU398和HepG2中，本发明人初步挖掘到455个基因，这些基因潜在地可作为肝癌治疗的靶点。进一步地，本发明人对这些靶基因进行富集分析，70个基因参与了线粒体翻译及下游氧化磷酸化过程。使用线粒体翻译抑制如替加环素(Tigecycline)可以显著抑制肝癌细胞的体内外活性。

如本文所用，所述的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。本发明中，除非另外说明，所述的抑制肝癌包括：预防、缓解和/或治疗肝癌。

所述的替加环素的结构式：

在本发明中，所述的替加环素可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。

本发明还包括上述替加环素的异构体、溶剂合物(如水合物)，或它们的药学上可接受的盐，只要它们与替加环素具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

本领域人员应理解，在得知了替加环素的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料来获得，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。

本发明人在研究中发现，替加环素具有显著的抑制肝癌的作用。替加环素是作为一种甘氨酰环素类抗生素，对于肝癌的抑制也具有优异的作用。在本发明的实施中，检测了12株肝癌细胞系对替加环素的敏感性。结果显示，除小部分肝癌细胞系(如MHCC97H、PLC/PRF/5和Li7)外，大部分肝癌细胞系对替加环素较敏感。

基于本发明人的新发现，本发明提供了替加环素或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备抑制肝癌的组合物。所述的抑制肝癌包括：预防、缓解和/或治疗肝癌。

MEK抑制剂

所述的“MEK抑制剂”包括MEK信号通路的活性或功能抑制剂，例如MEK信号通路的抑制剂、阻滞剂、拮抗剂、阻断剂等，它们具有能够下调MEK信号通路蛋白的表达水平、抑制MEK信号通路蛋白的活性或功能。它们包括化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子包括核酸水平(包括DNA、RNA)的或蛋白水平的。

所述的MEK抑制剂包括：降低MEK信号通路蛋白的活性、降低MEK信号通路蛋白的稳定性、下调MEK信号通路蛋白的表达、减少MEK信号通路蛋白有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调MEK信号通路有用的物质。

作为本发明的优选方式，所述的MEK抑制剂是特异性抑制MEK的小分子化合物，包括：曲美替尼(Trametinib)，考比替尼(Cobimetinib)及司美替尼(Selumetinib)。经过大量的筛选比较，本发明人发现，所述小分子化合物当与替加环素联合应用时，具有增效的作用。

在本发明中，所述小分子化合物形式的MEK抑制剂可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。本发明也包括所述MEK抑制剂的前体、异构体、溶剂合物(如水合物)、或其盐。

MEK抑制剂和替加环素的联合应用

本发明提供了一种联合用药的方法，包括利用替加环素联合MEK的抑制剂的用药方法。

本领域中，替加环素主要被作为抗生素应用，MEK抑制剂被用作MEK信号通路的下调剂，尚无研究人员将两者进行有效的组合。本发明人经过大量的研究筛选后发现，首次将MEK抑制剂和替加环素联合应用，对于抑制癌症具有极其优异的抑制效果。

因此，本发明提供了替加环素和MEK抑制剂的用途，用于制备治疗肝癌的混合物、药物组合物或药盒。

在给药时，可以先利用MEK抑制剂下调MEK信号通路，再以替加环素加以抑制，或者反之，也可两者同时添加。应理解，多种给药方式均被包含在本发明中。

组合物或混合物

本发明提供了一种小分子化合物的混合物，含有：MEK抑制剂和替加环素作为活性组分。较佳地，所述的混合物中，所述的MEK抑制剂与所述替加环素的按照摩尔比为：16～400:1；更佳地，替加环素与MEK抑制剂按照摩尔比30～200:1。

本发明提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的MEK抑制剂；(b)有效量的替加环素；以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性组分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。“药学上可接受的载体”可以是液体或固体。

本发明的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂。其中活性组分可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。

本发明的药物组合物或混合物可以是用于细胞水平给药的剂型，参考本发明实施例所提供的说明，可以了解处理细胞的方法以及有效的细胞处理的方案。

本发明的MEK抑制剂和替加环素的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，MEK抑制剂和替加环素作为活性成分可以占药物组合物总重量的0.001-20％，其余可以为药学上可接受的载体。

所用的MEK抑制剂和替加环素的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。必要的时候，MEK抑制剂和替加环素还可与其它活性成分或药物联合给药。

药盒

本发明还提供了一种用于抑制肝癌的药盒，所述的药盒中，含有：容器1，以及置于容器1中的MEK抑制剂；以及容器2以及置于容器2中的替加环素。

所述的替加环素和MEK抑制剂均为小分子化合物，因此所述的药盒中，也可含有所述的替加环素和MEK抑制剂的混合物或组合物，其中替加环素和MEK抑制剂的含量如前述。

此外，所述的药盒中还可以还有一些辅助用药的材料，例如注射用针管等。

此外，所述的药盒中还可含有使用说明书，说明利用本发明的联合用药方法来抑制肝癌的方法。

本发明的技术方案，联合应用替加环素和MEK抑制剂。本发明人的研究清楚地显示，两者联合应用时的技术效果是大大优于两者分别应用，这大大超出了本领域一般人员/医师的预料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、潜在靶基因的筛选

本发明人通过全基因组高通量筛选技术(约19100个基因，76400个sgRNA)鉴定可用于肝癌治疗的潜在靶点。针对两株典型的肝癌细胞株SNU398和HepG2，基于全基因组(包含约19100个基因，76400个sgRNA)的CRISPR/Cas9高通量筛选技术鉴定影响肝癌细胞增殖的基因。

高通量筛选的方法如下：将全基因组的CRISPR/Cas9文库转染肝癌细胞株SNU398和HepG2，经嘌呤霉素筛选后培养14天，提取基因组DNA。进行基因组深度测序后筛选影响SNU398及HepG2细胞增殖或存活的潜在靶基因，如图1A-B。

本发明人分析共同影响SNU398和HepG2两株细胞增殖的基因，进一步筛选获得455个基因。因此，在两株肝癌细胞株SNU398和HepG2中，初步挖掘到455个基因，这些基因潜在地可作为肝癌治疗的靶点。

进一步地，本发明人对这些靶基因(455个)进行富集分析，70个基因参与了线粒体翻译及下游氧化磷酸化等过程，如图1C。

分析结果表明，大部分靶基因与线粒体翻译及氧化磷酸化过程相关，如图1D。

实施例2、细胞水平上替加环素对于肝癌细胞系的抑制作用

根据实施例1的结果，本发明人进一步筛选在调控线粒体方面具有作用的化合物，以期找到潜在地作用于靶基因的化合物药物。

在针对大量的化合物进行研究筛选后，本发明人锁定了替加环素(Tigecycline)，其是一种甘氨酰环素类抗生素，可通过与线粒体SSU-rRNA复合物结合，阻止氨基酰tRNA与核糖体A位的相互作用，从而抑制真核细胞的线粒体翻译。

本发明人首先检测了12株肝癌细胞系对替加环素的敏感性。所述12株肝癌细胞系包括：SNU398、Huh6、HepG2、SNU761、SNU449、SNU423、SNU387、Huh7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7。

细胞培养：根据细胞的生长情况，按2×10⁴-4×10⁴/孔的细胞密度接种在6孔板中。待细胞贴壁后，替加环素以0、5、7.5、10、12.5μM的梯度浓度进行添加，培养10-14天。培养基每周换两次，并及时添加相应浓度药物。

结果显示，除小部分肝癌细胞系(MHCC97H、PLC/PRF/5、Li7)外，大部分肝癌细胞系对替加环素较敏感，如图2，在替加环素仅为5μM的浓度时，肝癌细胞即非常显著地受到抑制。

实施例3、动物水平上替加环素对于肝癌细胞系的抑制作用

利用替加环素敏感的肝癌细胞SNU398构建裸鼠皮下移植瘤模型，5x10⁶细胞皮下注射，13天后裸鼠皮下瘤体积达到100mm³左右，将其随机分为对照组(Control,n＝6)和替加环素处理组(n＝6)，对照组与实验组动物数量相同。替加环素处理组实验动物按照50mg/kg体重给予替加环素，每天1次；对照组实验动物给予溶剂(10％DMSO+20％蓖麻油+70％生理盐水)。

替加环素处理组/对照组分别给药处理12天，第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天记录裸鼠皮下移植瘤的体积变化及裸鼠体重变化。

如图3A所示，在给予替加环素后，其抑制肿瘤的药效开始发挥，对照组的肿瘤体积随着天数增加而显著上升，但是替加环素给药组肿瘤生长受到抑制。如图3C所示，在给予替加环素第12天时，对照组的平均肿瘤瘤重高于1.5g/只，而替加环素处理组的肿瘤瘤重仅约0.5g/只，替加环素处理组与对照组肿瘤体积差异显著，P＝0.0094。

如图3B所示，替加环素在发挥药效的同时，并没有导致动物体重的显著性下降，说明其毒副作用低。

替加环素处理组以及对照组的代表性的肿瘤形态图如图3C。

上述结果表明，替加环素在不影响小鼠体重的前提下可显著抑制肝癌细胞的体内生长，表明替加环素具有抑制/治疗肝癌的作用。

实施例4、替加环素联合其它化合物的肝癌抑制作用

针对替加环素敏感性低的细胞系(PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7)，通过化合物库进一步筛选潜在地可联合应用的抑制药物。

本发明人将MHCC97H细胞分为对照组(Control)和替加环素处理组(Tigecycline)，分别加用2μM的1957种化合物，作用3天后，细胞活性检测筛选出增敏替加环素药效的前30的化合物，如图4A。

将排名前30的化合物在PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7细胞中进行第二轮复筛，如图4B。

结果显示，MEK抑制剂如曲美替尼(Trametinib)，考比替尼(Cobimetinib)及司美替尼(Selumetinib)能增加替加环素的敏感性，如图4B(30种化合物中，有5个抑制剂都是MEK抑制剂，MEK抑制剂在三种细胞中对替加环素的增敏效果都居于前列)。

为进一步验证筛选结果，本发明人检测3株敏感性低的细胞系(PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7)对替加环素(Tigecycline)、MEK抑制剂如曲美替尼(Trametinib)或考比替尼(Cobimetinib)、或两者的联合的敏感性。

细胞培养：根据细胞的生长情况，按2×10⁴-4×10⁴/孔的细胞密度接种在6孔板中。待细胞贴壁后，按梯度浓度添加替加环素及曲美替尼或考比替尼，培养10-14天。培养基每周换两次，并及时添加相应浓度药物。

如图5A-F，肝癌细胞PLC/PRF/5、MHCC97H、Li7的细胞增殖实验及Incucyte细胞实时观察实验结果表明，替加环素联合MEK抑制剂曲美替尼或考比替尼可显著抑制几株替加环素低敏感性肝癌细胞的生长。尤其值得注意的是，替加环素与曲美替尼的联合应用，与两者分别单用相比，效果具有极为显著的提高。

实施例5、动物水平上替加环素联合曲美替尼对于替加环素不敏感肝癌细胞系的抑制作用

利用替加环素不敏感的肝癌细胞MHCC97H构建裸鼠皮下移植瘤模型，5x10⁶细胞皮下注射，7天后裸鼠皮下瘤体积达到100mm³左右，将其随机分为对照组(Control,n＝6)、替加环素处理组(Tigecycline,n＝6)、曲美替尼处理组(Trametinib,n＝6)及联合用药组(Combination,n＝6)。替加环素处理组实验动物按照50mg/kg体重给予替加环素；曲美替尼处理组实验动物按照0.25mg/kg体重给予曲美替尼；联合用药组实验动物给予50mg/kg体重的替加环素和0.25mg/kg体重的曲美替尼；对照组实验动物给予溶剂(10％DMSO+20％蓖麻油+70％生理盐水)，每天1次。

处理组/对照组分别给药处理22天，记录裸鼠皮下移植瘤的体积变化及裸鼠体重变化。

如图6A所示，在给药22天后，替加环素和曲美替尼单药给药组相较于对照组肿瘤体积降低不明显，但是替加环素联合曲美替尼给药组则基本上维持肿瘤在非常小的体积。

如图6B所示，在给药22天后，其在发挥药效的同时，并没有导致动物体重的显著性下降，说明其毒副作用低。

如图6C所示，在给药22天后测量瘤重，对照组的平均肿瘤瘤重高于1.0g/只，替加环素处理组的肿瘤瘤重约0.75g/只，联合用药组的肿瘤瘤重约0.25g/只，极为显著地低于对照组和替加环素单药给药组。

处理组以及对照组的代表性的肿瘤形态图如图6C。

上述结果表明，在替加环素不敏感的肝癌细胞系中，替加环素联合曲美替尼在不影响小鼠体重的前提下可显著抑制肝癌细胞的体内生长，表明替加环素与曲美替尼在体内具有显著的协同抑制/治疗肝癌的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.化合物或化合物组合的应用，用于制备抑制肝癌的组合物；所述的化合物或化合物组合为：

替加环素；或

替加环素与MEK抑制剂的组合。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的替加环素与MEK抑制剂的组合用于抑制耐药性的肝癌；较佳地，所述耐药性的肝癌为：对单独使用替加环素或MEK抑制剂的敏感性低的肝癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的MEK抑制剂包括：曲美替尼，考比替尼，司美替尼，PD184352，U0126-EtOH，KO-947，AZD0364。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，替加环素与MEK抑制剂的组合中，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为16～400:1；更佳地，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为30～200:1；或

替加环素与MEK抑制剂的组合中，替加环素与MEK抑制剂的重量比例为20～1000:1；较佳地50～500:1；更佳地，100～300:1；更佳地150～250:1。

5.一种用于特异性抑制肝癌的药物组合物或药盒，包括：替加环素，以及MEK抑制剂；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

6.如权利要求5所述的用于特异性抑制肝癌的药物组合物或药盒，其特征在于，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为16～400:1；更佳地，替加环素与MEK抑制剂的摩尔比例为30～200:1。

7.一种用于抑制肝癌的混合物，所述混合物由替加环素，以及MEK抑制剂组成；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

8.一种制备抑制肝癌的药物组合物或药盒的方法，包括：将替加环素与MEK抑制剂混合；或将替加环素与MEK抑制剂置于同一药盒中；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将替加环素与MEK抑制剂混合后，还包括与药学上可接受的载体或赋形剂混合。

10.一种提高MEK抑制剂的抑制肝癌的效果的方法，其特征在于，所述方法包括：以替加环素与MEK抑制剂混合应用于抑制肝癌，或联合应用于抑制肝癌；较佳地，所述的肝癌为耐药性的肝癌。

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