CN116211848A - 抗坏血酸钠在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用 - Google Patents

抗坏血酸钠在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗坏血酸在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用，属于医药用途技术领域，本发明提供一种天然物质盐‑抗坏血酸钠，所述抗坏血酸钠可以恢复耐氟苯尼考猪链球菌的敏感性及干扰其形成生物被膜的能力。通过实验验证抗坏血酸钠与氟苯尼考共孵育细菌时，显著降低抗生素的使用浓度，单独使用抗坏血酸钠时能有效的干预猪链球菌生物被膜的形成。

Description

抗坏血酸钠在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用
技术领域
本发明属于医药用途技术领域，涉及抗坏血酸的新医药用途，具体涉及抗坏血酸在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的用途。
背景技术
猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是一种严重危害人畜机体的病原菌，一般经呼吸道和消化道传播，动物感染后会引起肺炎、脑膜炎、败血症和关节炎，且易造成群体性爆发，给养殖业带来经济冲击。一直以来，使用抗菌药物是治疗和预防猪链球菌的主要手段，但随着大量抗菌药物的不规范使用、细菌防御能力变强、易产生基因突变和多药耐受的速度加快等原因，多种抗生素正在以较高速度失去效力。
经过多年的研究，发现溶血素（SLY）、荚膜多糖（CPS）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、生物被膜（EF）等物质是猪链球菌致病的主要毒力因子，但在其致病过程中起着不同的作用。细菌生物被膜是细菌为适应自然环境，通过分泌胞外聚合物，使细菌包裹在分泌物中而形成的大量细菌聚集膜状物，是细菌的一种自我保护性生长方式。生物被膜能够保护细菌免受环境胁迫，且对噬菌体、多种化学杀菌剂、宿主免疫系统以及抗生素具有抗性或耐药性，因此容易造成环境污染以及人类与动物感染等问题，临床治疗难度大。目前，虽有研究发现较多抗生素可以在一定程度上干扰猪链球菌生物被膜的形成，但其清除方式单一，长期使用易引起细菌多药耐药。
有研究表明，一些天然产物的抑菌效果明显且能够抑制细菌生物被膜的形成，如一种天然的2-(5H)-呋喃酮——抗坏血酸（维生素C）。抗坏血酸是一种水果和蔬菜中包含的水溶性维生素，在人体内负责伤口的愈合，形成疤痕组织，修复和维护软骨、骨骼和牙齿生长，形成用于皮肤、筋腱、韧带和血管的蛋白质等功能。有研究表明，抗坏血酸具有潜在的抗菌活性，能降低产气荚膜梭菌的群体感应能力和致病性。抗坏血酸钠是一种有机钠盐，由钠离子取代抗坏血酸的3-羟基质子而产生，稳定性强于抗坏血酸，其分子结构如图1所示。
抗坏血酸钠在抗菌治疗和癌症治疗中起到显著作用，为药物的联合应用奠定基础，但迄今尚无有关抗坏血酸钠与抗生素联合恢复耐药猪链球菌敏感性的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种天然物质盐-抗坏血酸钠，所述抗坏血酸钠可以恢复耐氟苯尼考猪链球菌的敏感性及干扰其形成生物被膜的能力。通过实验验证抗坏血酸钠与氟苯尼考共孵育细菌时，显著降低抗生素的使用浓度，单独使用抗坏血酸钠时能有效的干预猪链球菌生物被膜的形成。
本发明采用的具体方案为：
第一方面，抗坏血酸钠在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用。
第二方面，一种恢复猪链球菌敏感性的方法，采用抗坏血酸钠与抗生素共孵育猪链球菌。优选地，所述抗生素为氟苯尼考。
第三方面，抗坏血酸钠在如下任意一种的应用：
（a）、抑制猪链球菌生物被膜的形成；
（b）、制备抑制猪链球菌生物被膜形成的药物。
优选地，所述抗坏血酸钠的抑制浓度为10μg/mL-2560μg/mL。更优选地，所述抗坏血酸钠的抑制浓度为160μg/mL。
第四方面，一种抗菌增效剂，所述抗菌增效剂包含抗坏血酸钠。优选地，所述菌为猪链球菌；所述增效是指利用抗坏血酸钠恢复氟苯尼考猪链球菌的敏感性或干扰猪链球菌生物被膜的形成。
第五方面，抗坏血酸钠在饲料或饲料添加剂制备中的应用。
有益效果：本发明中的抗坏血酸钠是一种天然物质盐，具有应用临床有效的最小剂量、较少的毒副作用和细菌对药物的耐受性等特点，本发明利用该种天然物质盐恢复耐药菌株的敏感性，降低抗生素的最小抑菌浓度与猪链球菌生物被膜形成量。本发明为抗坏血酸钠作为一种抗菌增效剂或饲料添加剂提供理论依据。
附图说明
图1是抗坏血酸钠的分子结构图；
图2是不同浓度抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜形成的影响结果图。
具体实施方式
本发明首先检测抗坏血酸钠与氟苯尼考对猪链球菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），发现抗坏血酸钠不抑菌不杀菌且该菌对氟苯尼考高度耐药；其次加入1280μg/mL的氟苯尼考和不同浓度梯度的抗坏血酸钠（5-2500μg/mL）共培养猪链球菌，检测猪链球菌是否恢复对抗生素的敏感性；最后建立猪链球菌生物被膜体外模型，研究抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜形成能力的干预作用。
试验证实，抗坏血酸钠可以恢复耐氟苯尼考猪链球菌的敏感性及干扰其形成生物被膜的能力。单独使用抗坏血酸钠时，该物质干预猪链球菌生物被膜的形成，可能是恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性的潜在机制。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实验例1 抗坏血酸钠、氟苯尼考对猪链球菌最小抑菌浓度测定
一、实验药物
抗坏血酸钠单体、氟苯尼考（99.5%）单体均购于上海麦克林生化科技股份有限公司。
抗生素储备液的制备：以适量的乙腈溶解氟苯尼考，再用水稀释成终浓度为1280μg/mL药物储备液，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装到无菌10mL离心管中，4℃保存。抗坏血酸钠储备液的制备：以少量的水溶解药物，再用水稀释配制终浓度为10240μg/mL药物储备液，用0.22μm滤膜过滤后分装到无菌10mL离心管中，4℃遮光保存。
二、实验方法
取在-20℃甘油保存的猪链球菌临床分离株，在超净工作台中无菌操作，用移液枪将菌接种于TSB液体培养基中，放入37℃恒温培养箱中过夜培养。将培养浑浊的菌液使用接种环四区划线于TSA平板上培养24h，挑取纯化好的单菌落于TSB中过夜培养，备用。
在96孔板各孔中加入100μL TSB培养基，在第二、三列加入1280μg/mL的氟苯尼考，按照梯度稀释法从第三列使用移液枪依次稀释，将培养好的猪链球菌按照1:100稀释，使其最终浓度为106CFU/mL，使用移液枪吸取100μL加入除第二列的各列中，在37℃下孵育24h。肉眼没有可见细菌生长的最低浓度为氟苯尼考的最小抑菌浓度。抗坏血酸钠对猪链球菌最小抑菌浓度测定的方法于上述相同。
三、实验结果
通过观察96孔板中底板的透明度，可知氟苯尼考对猪链球菌最小抑菌浓度为640μg/mL，而抗坏血酸钠在发挥功能的药物浓度下不抑菌杀菌，结果如表一所示。
表1氟苯尼考、抗坏血酸钠对猪链球菌的最小抑菌浓度。
药物 氟苯尼考 抗坏血酸钠
最小抑菌浓度 640μg/mL ＞5000μg/mL
实验例2 抗坏血酸钠与氟苯尼考共孵育猪链球菌，检测该菌是否恢复对抗生素的敏感性。
一、实验药物
1280μg/mL的氟苯尼考和10240μg/mL的抗坏血酸钠。
二、实验方法
在96孔板各孔中加入100μL TSB培养基，将抗坏血酸钠和氟苯尼考的梯度稀释液在TSB培养基中混合。将复苏好的猪链球菌按照1:100稀释，使其最终浓度为106CFU/mL，使用移液枪吸取100μL加入除第二列的其他列中，在37℃下孵育24h。为了评估抗生素与抗坏血酸钠组合的抗菌效果，使用以下等式根据分数抑制浓度指数(FICI)分析棋盘试验产生的数据。FICI=FICIA+FICIB=(CA coMB／MICA)+(CB coMB／MICB) ，其中MICA和MICB是单独作用时抗坏血酸钠和抗生素的MIC，CACOMB和CBCOMB是抗坏血酸钠和抗生素联合使用时的MIC。协同作用定义为FICI≤0.5，相加作用定义为0.5＜FICI＜4，拮抗作用定义为FICI≥4。
三、实验结果
通过观察96孔板中底板的透明度统计药物用量情况，根据FICI计算公式算得抗坏血酸钠与氟苯尼考联合使用时的FICI均值，结果如下：
FICI=(40μg/mL/640μg/mL)+(5μg/mL/＞5000μg/mL)≈0.0625 。
根据结果判定FICI≤0.5，则两种药物联合使用时为协同作用。加入抗坏血酸钠前的抗生素浓度为640μg/mL，加入抗坏血酸钠后的抗生素浓度为40μg/mL，抗生素发挥作用的浓度大幅降低，说明抗坏血酸钠可以恢复耐氟苯尼考猪链球菌的敏感性。
实验例3 建立猪链球菌生物被膜体外模型，研究抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜形成能力的干预作用。
一、实验药物
10240μg/mL的抗坏血酸钠。
二、实验方法
将甘油保存的猪链球菌接种于TSA琼脂平板，37℃培养24h。再挑取单个菌落接种于TSB培养基中，37℃过夜培养。将培养好的菌稀释为约1×106CFU/mL，取200μL接种于96孔聚苯乙烯微纤维板中，37℃培养24h。
取出96孔板，用移液枪轻轻吸弃游离态细菌，并用灭菌的PBS洗涤两次确保彻底去除。向每孔加入95％乙醇240μl，固定15min，无菌PBS清洗后，晾干。每孔加入1％结晶紫240μl染色20min后，将染色液用无菌PBS冲洗掉，晾干。将结合染料的贴壁细菌用95％乙醇240μl溶解30min。使用酶标仪(595nm)测量OD值，每组实验重复三次。
研究抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜形成能力的干预作用时，预先加入不同浓度（5-2560μg/mL）的抗坏血酸钠，再培养细菌被膜进行分析，实验方法与上述相同。
三、实验结果
如图2所示，结果表明，10μg/mL-2560μg/mL浓度下的抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜的形成均有不同程度的干扰作用，但在160μg/mL下使用抗坏血酸钠能显著抑制猪链球菌生物被膜的形成，抑制率可达到29.5％。
综上所述，本发明采用药物敏感性分析和生物被膜体外模型，首次提出了抗坏血酸钠可以恢复耐药菌株对抗生素的敏感性及对猪链球菌生物被膜的体外干预作用。在使用抗坏血酸钠前，氟苯尼考在640μg/mL的浓度下才能发挥抑菌作用，添加抗坏血酸钠共孵育后，40μg/mL即可抑菌，说明抗坏血酸钠可以使耐药菌株恢复对抗生素的敏感性。此外，我们检测了抗坏血酸钠对猪链球菌生物被膜形成的干预作用，我们发现10μg/mL-2560μg/mL浓度下的抗坏血酸钠对生物被膜的形成均有不同程度的干扰，但在160μg/mL浓度下这种干扰作用达到顶峰，对生物被膜的抑制率可达到29.5％。这一研究发现可能是抗坏血酸钠恢复耐药菌株对抗生素敏感性的一个潜在机制。抗坏血酸钠是抗坏血酸盐，即使用抗坏血酸钠在恢复药物敏感性、抑制生物被膜形成量的同时，还可以保护机体组织器官、增强机体免疫力，并有利于降低药物的毒副作用。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗坏血酸钠在恢复耐氟苯尼考猪链球菌敏感性中的应用。
2.一种恢复猪链球菌敏感性的方法，其特征在于：采用抗坏血酸钠与抗生素共孵育猪链球菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抗生素为氟苯尼考。
4.抗坏血酸钠在如下任意一种的应用：
（a）、抑制猪链球菌生物被膜的形成；
（b）、制备抑制猪链球菌生物被膜形成的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗坏血酸钠的抑制浓度为10μg/mL-2560μg/mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗坏血酸钠的抑制浓度为160μg/mL。
7.一种抗菌增效剂，其特征在于：所述抗菌增效剂包含抗坏血酸钠。
8.根据权利要求7所述的抗菌增效剂，其特征在于：所述菌为猪链球菌；所述增效是利用抗坏血酸钠恢复氟苯尼考猪链球菌的敏感性或干扰猪链球菌生物被膜的形成。
9.抗坏血酸钠在饲料或饲料添加剂制备方面的应用。
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