CN116209757A - 用于从基质组分中分离寡核苷酸的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

用于从基质组分中分离寡核苷酸的组合物、试剂盒和方法 Download PDF

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CN116209757A CN202180049433.4A CN202180049433A CN116209757A CN 116209757 A CN116209757 A CN 116209757A CN 202180049433 A CN202180049433 A CN 202180049433A CN 116209757 A CN116209757 A CN 116209757A
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Abstract

本公开涉及可用于从一种或多种寡核苷酸中去除基质组分的试剂盒和方法，所述基质组分包括蛋白质和脂质。所述方法包括将包含一种或多种靶寡核苷酸和一种或多种包含蛋白质、脂质或两者的基质组分的样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上，该多孔阴离子交换吸附剂包含本体材料以及pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团，其中靶寡核苷酸被吸附剂保留并且基质组分被吸附剂保留或不保留；使一种或多种洗涤溶液流过吸附剂，其中洗涤溶液从吸附剂去除任何保留的基质组分，而留下保留在吸附剂上的靶寡核苷酸；和使一种或多种洗脱溶液流过吸附剂，其中保留在吸附剂上的靶寡核苷酸被释放。

Description

用于从基质组分中分离寡核苷酸的组合物、试剂盒和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月14日提交的美国临时申请号63/051,595以及于2021年4月28日提交的名称为“COMPOSITIONS,KITS AND METHODS USEFUL FOR SEPARATINGOLIGONUCLEOTIDES FROM MATRIX COMPONENTS”的美国临时申请号63/180,878的权益，其全部公开内容据此以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及可用于从寡核苷酸中去除基质组分(包括蛋白质和脂质)的组合物、试剂盒和方法。
背景技术
寡核苷酸是核苷酸(RNA、DNA、它们的类似物以及它们的衍生物)的聚合序列，这些聚合序列广泛用作生命科学研究和基于寡核苷酸的诊断测试试剂盒(作为引物和探针试剂)中的PCR(聚合酶链反应)试剂和基于微阵列的试剂。寡核苷酸也被开发为用于多种疾病病症的治疗药物。作为治疗剂开发的寡核苷酸可呈多种形式，包括反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、以及可实现“基因沉默”(“基因沉默”是下调或关闭特定基因/蛋白质的表达)的微小RNA(miRNA)、表现得像小分子药物并结合特定疾病靶标的适体、以及可以很长并且被设计成上调特定蛋白质的表达的信使RNA(mRNA)，以及质粒(双链体DNA)。
从复杂的生物基质诸如血浆、血液、尿液和组织中萃取寡核苷酸面临着困难的分析挑战。寡核苷酸的聚阴离子性质确保这些化合物除了与其他基质组分结合外，还与血浆蛋白强效结合。成功的生物分析样品制备取决于从基质中分离寡核苷酸的困难过程。最常用的萃取方法涉及多步液-液萃取，随后进行附加的固相萃取(SPE)以进一步净化样品。这种方法是普遍的，因为它总是成功地萃取寡核苷酸。然而，该过程中涉及多个步骤，这在再现性方面引入了误差来源，并且增加了所需的时间，使得该方法效率低下。
随着在工业中进行的寡核苷酸研究项目的激增，需要开发用于寡核苷酸的生物分析的快速、通用的SPE解决方案。
发明内容
根据一些方面，本公开涉及吸附剂，该吸附剂包含本体材料以及pKa在约8至约12，更典型地约9至约12，甚至更典型地约10至约12范围内的可电离表面基团。
根据一些方面，本公开涉及进行固相萃取的方法，该方法包括：(a)将包含一种或多种靶寡核苷酸和一种或多种包含蛋白质、脂质或两者的基质组分的样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上，该多孔阴离子交换吸附剂包含本体材料以及pKa在约8至约12，更典型地约9至约12，甚至更典型地约10至约12范围内的可电离表面基团，其中靶寡核苷酸被吸附剂保留并且基质组分被吸附剂保留或不保留(在各种实施方案中，基质组分的至少一部分被吸附剂保留)；(b)使一种或多种洗涤溶液流过吸附剂，其中洗涤溶液从吸附剂去除保留的基质组分，而留下保留在吸附剂上的靶寡核苷酸；以及(c)使一种或多种洗脱溶液流过吸附剂，其中保留在吸附剂上的靶寡核苷酸被释放。
在各种实施方案中，可电离表面基团可包括含胺基团。例如，含胺基团可选自—NHR1基团、—NR1R2基团和含有至少一个氮原子的杂环体系，其中R1和R2独立地选自C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C3-C18杂环烷基、C6-C18芳基或C5-C18杂芳基。在特定实施方案中，含胺基团包括二乙基氨基丙基(DEAP)、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基或二乙基氨基甲基基团。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，含胺基团通过连接部分连接到本体材料。例如，连接部分可以包含烷基基团、酰胺基团、酯基团、磺基基团、醚基团、氨基甲酸酯基团和脲基团中的一者或多者。在某些实施方案中，连接部分可以包含位于两个C1-C6-烷基基团之间的酰胺基团、酯基团、磺基基团、醚基团、氨基甲酸酯基团或脲基团。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，本体材料包括无机材料、无机-有机杂化材料、有机聚合物材料或它们的组合。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，本体材料可包括二氧化硅基材料。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，本体材料可包括无机-有机杂化材料，该无机-有机杂化材料包括二氧化硅区域和有机二氧化硅区域，在该二氧化硅区域中，材料包含具有四个硅-氧键的硅原子，在该有机二氧化硅区域中，材料包含具有一个或多个硅-氧键和一个或多个硅-碳键的硅原子。有机二氧化硅区域可包含例如桥接两个或更多个硅原子的取代或未取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚芳基部分。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，本体材料可在二氧化硅基材料的表面处包含硅烷醇基团，该硅烷醇基团通过与C1-C18烷基硅烷化合物反应而浓度降低。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，所采用的多孔阴离子交换吸附剂可以是整体形式或颗粒形式。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，一种或多种靶寡核苷酸具有3聚体至7000聚体范围内的大小。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，(a)多孔阴离子交换吸附剂具有75埃至200埃范围内的孔径并且样品含有一种或多种具有3聚体至50聚体范围内的大小的靶寡核苷酸，(b)多孔阴离子交换吸附剂具有200埃至500埃范围内的孔径并且样品含有一种或多种具有25聚体至200聚体范围内的大小的靶寡核苷酸，并且/或者(c)多孔阴离子交换吸附剂具有500埃至2000埃范围内的孔径，并且样品含有一种或多种具有100聚体至7000聚体范围内的大小的靶寡核苷酸。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，一种或多种洗涤溶液可包含有机溶剂和挥发性缓冲液。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，一种或多种洗脱溶液可具有10至13范围内的pH。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，一种或多种洗脱溶液可包含多膦酸。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，一种或多种洗脱溶液可包含一种或多种选自有机胺、碳酸氢铵、氢氧化铵或乙酸铵的碱以及一种或多种选自甲醇、乙醇、六氟异丙醇或四氢呋喃的有机溶剂。在某些实施方案中，一种或多种洗脱溶液可以包含三乙胺(TEA)、甲醇和水，或者一种或多种洗脱溶液可以包含TEA、甲醇、六氟异丙醇和水。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，样品包括选自以下的生物流体：全血样品、血浆样品、血清样品、口腔液、脑脊液、粪便样品、鼻样品和尿液、生物组织诸如肝、肾和脑组织、组织匀浆、细胞或细胞培养上清液。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，该方法还包括在将样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上之前用变性剂处理样品。例如，变性剂可选自蛋白酶诸如蛋白酶K、MS相容的表面活性剂、有机溶剂、脲、胍或取代的胍。
在可与以上方面和实施方案中的任一者一起使用的各种实施方案中，本公开涉及试剂盒，该试剂盒包含多孔阴离子交换吸附剂，该多孔阴离子交换吸附剂包含pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团(例如，根据前述方面和实施方案中的任一者的多孔阴离子交换吸附剂)；用于吸附剂的壳体；以及一种或多种选自以下的试剂盒组分：变性剂溶液、洗脱溶液或洗涤溶液等等。
在一些实施方案中，壳体可以选自多孔条带、多孔板、单次使用的筒或被配置用于在线SPE的多次使用的筒。
在阅读以下具体实施方式后，本公开的这些和其他方面和实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1是GEM91的校准曲线，示出使用基于OasisTM的20μm
Figure BDA0004048062290000041
-DEA SPE板的线性回收率。
图2是GEM91的校准曲线，示出使用BEH 10μm
Figure BDA0004048062290000052
-DEAP SPE板的线性回收率。
图3是大的50聚体寡核苷酸的校准曲线，示出使用BEH 10μm
Figure BDA0004048062290000053
DEAP SPE板的高达12μg/mL的线性回收率。
图4是在从血浆基质中萃取GEM 91时用基于OasisTM的SPE板和BEH 10μm
Figure BDA0004048062290000051
-DEAP SPE板观察到的回收率的比较。
图5A至图5C示出使用以下固定相颗粒对具有15聚体至35聚体范围内的五个长度的寡核苷酸的第一洗脱步骤的百分比回收率数据：具有二乙基氨基丙基表面基团的固定相颗粒(图5A)，具有4-吡啶基乙基表面基团的固定相颗粒(图5B)和具有哌嗪表面基团的固定相颗粒(图5C)。
图6A至图6B示出使用以下固定相颗粒对具有15聚体至35聚体范围内的五个长度的寡核苷酸的附加洗脱步骤的百分比回收率数据：具有二乙基氨基丙基表面基团的固定相颗粒(图6A)和具有哌嗪表面基团的固定相颗粒(图6B)。
具体实施方式
根据本公开的各个方面，提供了例如在用于固相萃取的试剂盒和方法中使用的阴离子交换吸附剂。阴离子交换吸附剂包含本体材料和具有在约8或更小至约12或更大范围内的一个或多个pKa的可电离表面基团。例如，可电离表面基团可以具有在8至8.5至9至9.5至10至10.5至11至11.5至12的任何范围内(即，在前述值中的任意两个值之间的范围内)的一个或多个pKa。
在一些实施方案中，可电离表面基团的范围可以为0.01μmol/m2至10.0μmol/m2，例如，范围为0.01μmol/m2至0.05μmol/m2至0.10μmol/m2至0.30μmol/m2至0.50μmol/m2至1.0μmol/m2至3.0μmol/m2至5.0μmol/m2至10μmol/m2。
在一些实施方案中，可电离表面基团包括胺基团，诸如仲胺基团和/或叔胺基团，包括例如—NHR1基团、—NR1R2基团和含有至少一个氮原子的杂环体系，其中R1和R2独立地选自C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C3-C18杂环烷基、C6-C18芳基或C5-C18杂芳基，例如选自C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、C6-C12芳基或C6-C12杂芳基等等。含有至少一个氮原子的杂环体系可选自例如吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基或三嗪基基团等等。在其中可电离表面基团包括仲氨基团(例如，—NHR1基团)的实施方案中，可电离表面基团可包括大体积基团(例如，大体积R1基团)以抑制可电离表面基团的亲核活性。
在一些实施方案中，可电离表面基团可包括将胺基团连接到本体材料的连接部分。连接部分的示例包括包含烃基团的那些，例如C1-C18亚烷基、C2-C18亚烯基、C2-C18亚炔基或C6-C18亚芳基基团，在一些实施方案中，C1-C4亚烷基、C2-C4亚烯基、C2-C4亚炔基或C6-C12亚芳基基团。在一些实施方案中，连接部分可包含位于两个烃基团(例如，独立地选自C1-C18亚烷基、C2-C18亚烯基、C2-C18亚炔基或C6-C18亚芳基基团，在一些实施方案中，C1-C4亚烷基、C2-C4亚烯基、C2-C4亚炔基或C6-C12亚芳基基团)之间的非反应性非烃基团(例如，酰胺基团、酯基团、磺基基团、醚基团、氨基甲酸酯基团、脲基团等)。
在某些实施方案中，可电离表面基团可包括氨基烷基基团(例如，氨基-C1-C4-烷基基团)、烷基氨基烷基基团(例如，C1-C4-烷基氨基-C1-C4烷基基团)或二烷基氨基烷基基团(例如，二-C1-C4-烷基-氨基-C1-C4-烷基基团)。在某些实施方案中，可电离表面基团可包括甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、乙基氨基甲基、二乙基氨基甲基、甲基氨基乙基、二甲基氨基乙基、乙基氨基乙基、二乙基氨基乙基、甲基氨基丙基、二甲基氨基丙基、乙基氨基丙基或二乙基氨基丙基基团等等。
在某些实施方案中，可电离表面基团可通过使本体材料与含有一个或多个胺基团的有机硅烷反应而形成。在某些实施方案中，可电离表面基团可以通过使本体材料与可电离改性试剂反应而形成，该可电离改性试剂选自以下等等中的一者或多者：1-丙胺、3-(二甲氧基苯基甲硅烷基)-；3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷；N-环己基氨基甲基三乙氧基硅烷；2-(4-吡啶基乙基)三乙氧基硅烷；[3-(1-哌嗪基)丙基]三乙氧基硅烷；(N,N-二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷；(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷；N-3-[(氨基(聚丙烯氧基)]氨基丙基三甲氧基硅烷；N,N'-双(2-羟乙基)-N,N'-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺；N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷；N-环己基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷；1-(三甲氧基甲硅烷基)-N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷3-十八胺；N,N-双[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]-1-十六胺；以及4,4,7,7-四乙氧基-N-十六烷基-N-丙基3,8-二氧杂-4,7-二硅杂癸烷-5-胺。
阴离子交换吸附剂的本体材料可包括例如完全多孔材料或表面多孔材料。阴离子交换吸附剂的完全多孔或表面多孔材料可选自例如(a)无机材料(例如，二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆)，(b)无机-有机杂化材料，(c)有机聚合物材料，(d)(a)和(b)的组合，(e)(b)和(c)的组合，(f)(a)和(c)的组合，或(g)(a)、(b)和(c)的组合，以及其他可能性。
在各种实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料可包括二氧化硅基完全多孔材料或二氧化硅基表面多孔材料。例如，在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料可包括二氧化硅完全多孔材料或二氧化硅表面多孔材料。
在一些实施方案中，除了完全多孔材料或表面多孔材料之外，本文所用的本体材料还可包括包含无机-有机杂化材料的周围层。
在一些实施方案中，完全多孔材料、表面多孔材料或阴离子交换吸附剂的本体材料的包围层可包括二氧化硅基无机-有机杂化材料，该二氧化硅基无机-有机杂化材料包括二氧化硅区域和有机二氧化硅区域，在该二氧化硅区域中，材料包含具有四个硅-氧键的硅原子，在该有机二氧化硅区域中，材料包含具有三个、两个或一个硅-氧键和一个、两个或三个硅-碳键的硅原子。在一些情况下，有机二氧化硅区域可以包含桥接两个或更多个硅原子的经取代或未取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚芳基部分。例如，有机二氧化硅区域可包含桥接两个或更多个硅原子的取代或未取代的C1-C18亚烷基、C2-C18亚烯基、C2-C18亚炔基或C6-C18亚芳基部分，在一些实施方案中，C1-C4亚烷基、C2-C4亚烯基、C2-C4亚炔基或C6-C12亚芳基基团。在特定实施方案中，有机二氧化硅区域可以包含桥接两个或更多个硅原子的经取代或未取代的C1-C6亚烷基部分，包括桥接两个硅原子的亚甲基、二亚甲基或三亚甲基部分。在特定实施方案中，有机二氧化硅区域可以包含≡Si-(CH2)n-Si≡部分，其中n是等于1、2、3或4的整数。
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料或周围层可包含式I的无机-有机材料：
(SiO2)d/[R2((R)p(R1)qSiOt)m](I)
其中，
R和R1各自独立地为C1-C18烷氧基、C1-C18烷基、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基、或C1-C18杂芳基；
R2为C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C1-C18杂芳基；或不存在；其中每个R2与两个或更多个硅原子连接；
p和q各自独立地为0.0至3.0；
t为0.5、1.0、或1.5；
d为0至约30；
m是1至20的整数；其中R、R1和R2被任选地取代；
前提条件是：
(1)当R2不存在时，m＝1，并且当0<p+q<3时，
Figure BDA0004048062290000081
(2)当R2存在时，m＝2-20，并且当p+q<2时，
Figure BDA0004048062290000082
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料或周围层可包含式II的无机-有机材料：
(SiO2)d/[(R)p(R1)qSiOt](II)
其中，
R和R1各自独立地为C1-C18烷氧基、C1-C18烷基、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基、或C1-C18杂芳基；
d为0至约30；
p和q各自独立地为0.0至3.0，前提条件是当p+q＝1时，则t＝1.5；当p+q＝2时，则t＝1；或者当p+q＝3时，则t＝0.5。
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料或周围层可包含式III的无机-有机材料：
(SiO2)d/[R2((R1)rSiOt)m](III)
其中，
R1为C1-C18烷氧基、C1-C18烷基、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基、或C1-C18杂芳基；
R2为C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C1-C18杂芳基；或不存在；其中每个R2与两个或更多个硅原子连接；
d为0至约30；
r为0、1或2，前提条件是当r＝0时，则t＝1.5；或者当r＝1时，则t＝1；或者当r＝2时，则t＝0.5；并且
m为1-20的整数。
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料或周围层可包含式IV的无机-有机材料：
(A)x(B)y(C)z(IV)，
其中重复单元A、B和C的顺序可以是无规、嵌段或无规和嵌段的组合；
A是有机重复单元，其经由有机键共价键合到一个或多个重复单元A或B；
B是有机硅氧烷重复单元，其经由无机硅氧烷键键合到一个或多个重复单元B或C，并且可进一步经由有机键键合到一个或多个重复单元A或B；
C是无机重复单元，其经由无机键键合到一个或多个重复单元B或C；并且
x和y为正数，并且z为非负数，其中x+y+z＝1，在某些实施方案中，当z＝0时，则0.002≤x/y≤210，并且当z≠0时，则0.0003≤y/z≤500且0.002≤x/(y+z)≤210。
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料或周围层可包含式V的无机-有机材料：
(A)x(B)y(B*)y*(C)z(V)，
其中重复单元A、B、B*和C的顺序可以是无规、嵌段或无规和嵌段的组合；
A是有机重复单元，其经由有机键共价键合到一个或多个重复单元A或B；
B是有机硅氧烷重复单元，其经由无机硅氧烷键键合到一个或多个重复单元B或B*或C，并且可进一步经由有机键键合到一个或多个重复单元A或B；
B*是有机硅氧烷重复单元，其经由无机硅氧烷键键合到一个或多个重复单元B或B*或C，其中B*为不具有反应性(即，可聚合)有机组分并且还可具有可在聚合后脱保护的受保护官能团的有机硅氧烷重复单元；
C是无机重复单元，其经由无机键键合到一个或多个重复单元B或B*或C；并且
x、y和y*为正数，并且z为非负数，其中x+y+z＝1。在某些实施方案中，当z＝0时，则0.002≤x/(y+y*)≤210，并且当z≠0时，则0.0003≤(y+y*)/z≤500且0.002≤x/(y+y*+z)≤210。
在其中阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料和/或周围层包括有机-无机杂化材料的实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的总杂化物含量可在0.1摩尔％或更少至100摩尔％杂化物的范围内，例如在0.1摩尔％至0.25摩尔％至0.5摩尔％至1摩尔％至2.5摩尔％至10摩尔％至25摩尔％至50摩尔％至75摩尔％至100摩尔％杂化物的范围内。
在各种实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料和/或周围层可通过水解缩合一种或多种硅烷化合物来形成，该一种或多种硅烷化合物通常包括(a)式SiZ1Z2Z3Z4的一种或多种硅烷化合物，其中Z1、Z2、Z3和Z4独立地选自Cl、Br、I、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和C1-C4烷基，但是Z1、Z2、Z3和Z4中的至多三者可以是C1-C4烷基，例如四烷氧基硅烷，包括四-C1-C4-烷氧基硅烷诸如四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷，烷基-三烷氧基硅烷，例如，C1-C4-烷基-三-C1-C4-烷氧基硅烷诸如甲基三乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷或乙基三乙氧基硅烷，以及二烷基-二烷氧基硅烷，例如，C1-C4-二烷基-二-C1-C4-烷氧基硅烷诸如二甲基二乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷或二乙基二乙氧基硅烷以及许多其他可能性，和/或(b)式Si Z1Z2Z3—R—SiZ4Z5Z6的一种或多种化合物，其中Z1、Z2和Z3独立地选自Cl、Br、I、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和C1-C4烷基，但是Z1、Z2和Z3中的至多两个可以是C1-C4烷基，其中Z4、Z5和Z6独立地选自Cl、Br、I、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和C1-C4烷基，但是Z4、Z5和Z6中的至多两个可以是C1-C4烷基，其中R是有机基团，例如，选自C1-C18亚烷基、C2-C18亚烯基、C2-C18亚炔基或C6-C18亚芳基基团。示例包括双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃，例如双(三-C1-C4-烷氧基甲硅烷基)C1-C4-烷烃诸如双(三甲氧基甲硅烷基)甲烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)甲烷和双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷以及许多其他可能性。
在一些实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料的完全多孔材料、表面多孔材料和/或周围层可通过水解缩合一种或多种烷氧基硅烷化合物而形成。烷氧基硅烷化合物的示例包括例如四烷氧基硅烷(例如，四甲氧基硅烷(TMOS)、四乙氧基硅烷(TEOS)等)、烷基烷氧基硅烷诸如烷基三烷氧基硅烷(例如，甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷(MTOS)、乙基三乙氧基硅烷等)和双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃(例如，双(三甲氧基甲硅烷基)甲烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)甲烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(BTE)等)，以及前述的组合。在这些实施方案中的某些实施方案中，无机-有机杂化二氧化硅基材料可由两种烷氧基硅烷化合物制备，例如：四烷氧基硅烷诸如TMOS或TEOS，以及烷基烷氧基硅烷诸如MTOS，或双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃诸如BTEE。当BTEE用作单体时，所得材料是有机-无机杂化材料，其有时被称为乙烯桥连杂化(BEH)材料，并且可提供优于常规基于硅胶的材料的各种优点，包括化学稳定性和机械稳定性。一种特定的BEH材料可以由TEOS和BTEE的水解缩合形成。
另外的无机-有机杂化材料描述于美国专利号6,686,035B2中，该专利据此以引用方式并入。
在其中本体材料包含表面硅烷醇基团的各种实施方案中，表面硅烷醇基团的浓度可通过与一种或多种合适的反应性有机硅烷化合物，例如一种或多种式SiZ7Z8Z9Z10的硅烷化合物反应而降低，其中Z7、Z8、Z9和Z10独立地选自Cl、Br、I、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基或C6-C18芳基，其中Z7、Z8、Z9和Z10中的至少一者且至多三者为C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基或C6-C18芳基。在一些实施方案中，Z7、Z8、Z9和Z10中的至少一者且至多三者为C1-C4烷基。在某些实施方案中，可以通过与选自氯三烷基硅烷、二氯二烷基硅烷或三氯烷基硅烷(诸如氯三甲基硅烷、氯三乙基硅烷、二甲基二氯硅烷、二乙基二氯硅烷、甲基三氯硅烷或乙基三氯硅烷)的卤代烷基硅烷化合物反应来降低二氧化硅基吸附剂的表面处的硅烷醇基团的浓度。在一些实施方案中，反应性有机硅烷化合物以足以形成有机硅烷表面基团的量提供，该有机硅烷表面基团的量在0.1μmol/m2至3.5μmol/m2的范围内。
如前所述，在各种实施方案中，阴离子交换吸附剂的本体材料可包括有机聚合物材料。例如，阴离子交换吸附剂的完全多孔材料或表面多孔材料可包含有机共聚物，该有机共聚物包含至少一种疏水性有机单体和至少一种亲水性有机单体。
在某些实施方案中，亲水性有机单体可选自具有酰胺基团的有机单体、具有酯基团的有机单体、具有碳酸酯基团的有机单体、具有氨基甲酸酯基团的有机单体、具有脲基团的有机单体、具有羟基基团的有机单体和具有含氮杂环基团的有机单体，以及其他可能性。亲水性有机单体的具体示例包括例如2-乙烯基吡啶、3-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基-哌啶酮、N-乙烯基己内酰胺、丙烯酸低级烷基酯(例如，丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯等)、甲基丙烯酸低级烷基酯(例如，甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯等)、乙酸乙烯酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酰
Figure BDA0004048062290000121
N-乙烯基-2-哌啶酮或N-乙烯基己内酰胺)。
在某些实施方案中，有机共聚物的疏水性有机单体可包含C2-C18烯烃单体和/或包含C6-C18单环或多环碳环基团(例如，苯基基团、亚苯基基团、萘基团等)的单体。疏水性有机单体的具体示例包括例如：单官能和多官能芳族单体，诸如苯乙烯和二乙烯基苯；单官能和多官能烯烃单体，诸如乙烯、丙烯或丁烯、聚碳酸酯单体、对苯二甲酸乙二醇酯；单官能和多官能氟化单体，诸如氟乙烯、1,1-二氟乙烯、四氟乙烯、三氟氯乙烯、六氟丙烯、全氟丙基乙烯基醚或全氟甲基乙烯基醚；具有高级烷基或碳环基团的单官能或多官能丙烯酸酯单体；例如具有C6-C18烷基、烯基或炔基基团或C6-C18饱和、不饱和或芳族碳环基团的单官能或多官能丙烯酸酯单体；具有高级烷基或碳环基团的单官能或多官能甲基丙烯酸酯单体；例如具有C6-C18烷基、烯基或炔基基团或C6-C18饱和、不饱和或芳族碳环基团的单官能或多官能甲基丙烯酸酯单体等等。在某些实施方案中，可采用DVB 80，其为包含二乙烯基苯(80％)以及乙基-苯乙烯异构体、二乙基苯的混合物的有机单体混合物，并且也可包括其他异构体。
在某些实施方案中，有机共聚物可包含多官能疏水性有机单体(诸如二乙烯基苯)和/或多官能亲水性有机单体(诸如二甲基丙烯酸乙二醇酯、亚甲基双丙烯酰胺或甲基丙烯酸烯丙酯)，以便在有机共聚物中提供交联。
在某些实施方案中，有机共聚物可包含作为亲水性有机单体的正乙烯基吡咯烷酮或正乙烯基己内酰胺以及作为疏水性有机单体的二乙烯基苯。
在一些实施方案中，诸如上述那些的含胺的可电离表面基团可以使用合适的连接化学附接到本体材料的有机共聚物。作为具体示例，在形成包含二乙烯基苯的共聚物之后，共聚物内的二乙烯基苯单体可被氯甲基化，随后沿着例如美国专利号7,442,299中描述的路线胺化，该专利据此以引用方式并入。
在各种实施方案中，除本体材料和可电离表面基团之外，本公开的阴离子交换吸附剂还可包含疏水性表面基团，例如包含烃或碳氟化合物基团的表面基团，通常为烷基基团，芳族基团或烷基-芳族基团，其可含有6至30个碳原子并且任选地被一个或多个氟原子取代。
在各种实施方案中，本文所述的多孔阴离子交换吸附剂可为整体形式。
在各种实施方案中，本文所述的多孔阴离子交换吸附剂可为颗粒形式。例如，在一些实施方案中，多孔阴离子交换吸附剂可为颗粒的形式，通常为球形颗粒，直径在1μm至100μm的范围内，例如1μm至2μm至5μm至10μm至25μm至50μm至100μm的范围内。
在各种实施方案中，本文所述的多孔阴离子交换吸附剂的孔径(平均孔直径)可在75埃至2000埃的范围内，例如在75埃至100埃至200埃至500埃至1000埃至2000埃的范围内，如通过常规孔隙度测定方法所测量的。对于低于500埃的孔，平均孔直径(APD)可以使用多点N2吸附方法(Micromeritics ASAP 2400；Micromeritics Instruments Inc.,Norcross,GA)来测量，其中APD使用本领域已知的BJH方法由等温线的解吸段计算。如在本领域中已知的，Hg孔隙度测定法可以用于500埃或更大的孔。
在本公开的一些方面，诸如本文所述的那些的阴离子交换吸附剂可与合适的壳体(本文称为“吸附剂壳体”)结合提供。吸附剂和吸附剂壳体可以独立供应，或者吸附剂可以预先包装在吸附剂壳体中，例如在填充床中。根据本公开使用的吸附剂壳体通常包括用于接收和保持吸附剂的室。在各种实施方案中，吸附剂壳体可设置有入口和出口。
用于吸附剂壳体的合适的构造材料包括无机材料，例如，金属诸如不锈钢和陶瓷诸如玻璃，以及合成聚合物材料诸如聚乙烯、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)和聚四氟乙烯等等。
在某些实施方案中，吸附剂壳体可包括用于将吸附剂保持在吸附剂壳体中的一个或多个过滤器。示例性过滤器可为例如膜、筛网、玻璃料或球形多孔过滤器的形式。
在某些实施方案中，接收在吸附剂壳体中的溶液可自发地(例如，通过毛细管作用)流入吸附剂中。在某些实施方案中，可通过外力(诸如重力或离心)或者通过向吸附剂壳体的出口施加真空或者向吸附剂壳体的入口施加正压力来产生穿过吸附剂的流。
用于本公开的吸附剂壳体的具体示例包括例如注射器，单次使用的注射筒，在高达HPLC压力(约5000psi)或与UHPLC相容的更高压力(约20000psi)下适用于在线SPE的多次使用的筒，柱，多孔装置诸如4孔至8孔支架、4孔至8孔条带、48孔至96孔板或96孔至384孔微洗脱板，微洗脱尖端装置(包括4至8尖端微洗脱条带、96至384微洗脱尖端阵列、单个微洗脱移液管尖端)、薄层板，微量滴定板，旋转管或旋转容器。
在本公开的各个方面，诸如上文所述的那些等等的包含pKa在约8至约12，更典型地约9至约12，甚至更典型地10至12范围内的可电离表面基团的阴离子交换吸附剂用于固相萃取程序中。
在一些实施方案中，本公开提供了进行固相萃取的方法，其包括(a)将包含至少一种靶寡核苷酸和一种或多种基质组分(例如，包括蛋白质、脂质或两者的基质组分)的样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上，该多孔阴离子交换吸附剂包含pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团，诸如上文所述的那些可电离表面基团等等中的任一者，由此至少一种靶寡核苷酸被吸附剂保留，(b)使至少一种洗涤溶液流过吸附剂，由此至少一种洗涤溶液从吸附剂中去除基质组分，而留下保留在吸附剂上的至少一种靶寡核苷酸，以及(c)使至少一种洗脱溶液流过吸附剂，由此至少一种洗脱溶液释放保留在吸附剂上的至少一种靶寡核苷酸。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指两个或更多个核苷酸的聚合物序列，包括RNA、DNA、它们的类似物，包括具有用于修饰生物利用度的碱修饰，糖修饰或接头的那些，修饰的示例包括2’-O-甲氧基乙基、2’-氟、硫代磷酸酯和/或GalNAc修饰。寡核苷酸的示例包括反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和质粒。
在一个示例性实施方案中，在步骤(a)中，组分诸如盐、糖和大蛋白质能够流过吸附剂，而感兴趣的靶寡核苷酸、较小蛋白质和脂质通过混合模式的弱阴离子相互作用结合到吸附剂。在步骤(b)中，将较小的蛋白质和脂质从吸附剂洗去，而感兴趣的靶寡核苷酸仍然结合到吸附剂。在步骤(c)中，从吸附剂中回收现在纯化的感兴趣的寡核苷酸。
在各种实施方案中，在固相萃取方法中采用的多孔阴离子交换吸附剂的孔径将具有基于至少一种靶寡核苷酸的长度而改变的孔径。
例如，在其中一种或多种靶寡核苷酸的大小在3聚体至50聚体范围内的实施方案中，可以选择75埃至200埃范围内的孔径。在其中一种或多种靶寡核苷酸的大小在25聚体至200聚体范围内的实施方案中，可以选择200埃至500埃范围内的孔径。在其中一种或多种靶寡核苷酸的大小在100聚体至7000聚体范围内的实施方案中，可以选择500埃至2000埃范围内的孔径。
在一些实施方案中，用于固相萃取中的至少一种洗涤溶液可包含有机溶剂，通常为20体积％至100体积％，例如在20体积％至40体积％至60体积％至80体积％至90体积％至95体积％至98体积％至99体积％至100体积％范围内的有机溶剂诸如甲醇、乙腈或反相液相色谱中使用的其他常见溶剂，盐诸如高达250mM乙酸铵、甲酸铵、或氯化钠或通常用于离子交换液相色谱中的其他洗脱剂溶液，其中用乙酸铵/甲酸盐或磷酸盐缓冲液或色谱中使用的(半)挥发性缓冲液(例如，吗啉代缓冲液、乙酸铵、乙酸三乙基铵等)控制pH。在这方面，通过在洗涤中使用挥发性缓冲液，最终的洗脱物(萃取物)将含有尽可能少的非挥发性盐。在一些实施方案中，洗涤溶液可具有4或更低至10或更高范围内的pH值，例如，洗涤溶液可具有4至5至6至7至8至9至10的任何范围内的pH值。可以针对所选择的特定多孔阴离子交换吸附剂优化洗涤溶液的pH。
在一些实施方案中，在固相萃取中使用的至少一种洗脱溶液可以具有至少10，例如在10至13范围内，更典型地在10至12范围内的pH。
在一些实施方案中，用于固相萃取中的至少一种洗脱溶液可包含多膦酸。多膦酸可以是例如双膦酸或三膦酸。多膦酸可以选自例如依替膦酸、氯膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、次氮基三(甲基膦酸)或乙烷-1,1,2-三膦酸。在一些实施方案中，至少一种洗脱溶液可包含浓度在约0.01M至约0.1M范围内，例如0.01M至0.02M至0.05M至0.10M至0.20M至0.5M至1M范围内的多膦酸。
在一些实施方案中，用于固相萃取中的至少一种洗脱溶液可包含一种或多种碱。一种或多种碱可以选自有机胺、碳酸氢铵、氢氧化铵或乙酸铵。有机胺包括烷基胺，例如三甲基胺、三乙基胺或二异丙基乙基胺等等。
在一些实施方案中，用于固相萃取中的至少一种洗脱溶液可包含一种或多种有机溶剂。一种或多种有机溶剂可选自例如甲醇、乙醇、六氟异丙醇(HFIP)和/或四氢呋喃等等。
在特定实施方案中，用于固相萃取中的至少一种洗脱溶液可包含三乙胺(TEA)、甲醇和水，或者一种或多种洗脱溶液可包含TEA、甲醇、HFIP和水。
在一些实施方案中，对其进行固相萃取的样品可以选自例如选自以下的生物流体：全血样品、血浆样品、血清样品、口腔液、脑脊液、粪便样品、鼻样品和尿液、生物组织诸如肝、肾和脑组织、组织匀浆、细胞或细胞培养上清液，以及许多其他可能性。
在一些实施方案中，可在将样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上之前处理对其进行固相萃取的样品。例如，可以用变性剂处理样品。合适的变性剂可以选自例如蛋白酶诸如蛋白酶K、质谱相容的表面活性剂、有机溶剂、脲、胍或取代的胍。
在一些实施方案中，取代的胍选自四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合。在一些实施方案中，取代的胍包括来自四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合的组中的至少一者。在一些实施方案中，四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的1,1,3,3-四甲基胍：
在一些实施方案中，叔丁基四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍：
Figure BDA0004048062290000171
在一些实施方案中，三氮杂双环癸烯的取代的胍是具有以下化学结构的1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯：
Figure BDA0004048062290000172
在一些实施方案中，取代的胍是胍盐阳离子。在一些实施方案中，取代的胍具有大于约10的pKa值。在一些实施方案中，取代的胍的浓度小于250mM。
在本公开的另外方面，可提供可用于进行固相萃取程序的试剂盒。在各种实施方案中，本公开提供了试剂盒，该试剂盒包含多孔阴离子交换吸附剂，该多孔阴离子交换吸附剂包含pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团，诸如上文所述的那些可电离表面基团中的任一者等等；用于吸附剂的壳体，诸如上文所述的那些壳体中的任一者等等；以及一种或多种选自以下的试剂盒组分：(a)变性剂溶液，诸如上文所述的那些变性剂溶液中的任一者等等，(b)洗脱溶液，诸如上文所述的那些洗脱溶液中的任一者等等，(c)洗涤溶液，诸如上文所述的那些洗涤溶液中的任一者等等，(d)收集板或收集小瓶，(e)盖垫，(f)校准和参考标准，(g)使用说明书和(h)每种组分的识别标签，其可包括无源标签，诸如RFID标签，用于跟踪组分。
实施例
实施例1.
如美国专利公布号2019/0091657和2019/0091657中所述，用有机/无机杂化周围材料通过TEOS和BTEE的水解缩合对完全多孔二氧化硅颗粒进行表面改性，以产生具有有机/无机表面的多孔二氧化硅颗粒。
实施例2.
通过在无水条件下在甲苯和含有一个或多个胺基团的有机硅烷(参见表1)中回流2小时，将来自实施例1的颗粒官能化。然后分离颗粒并在甲苯、丙酮和丙酮/水混合物中洗涤。然后在真空下在升高的温度下干燥颗粒。此类颗粒也可以使用实施例3的附加配体以相同的方式官能化。
表1
Figure BDA0004048062290000181
/>
Figure BDA0004048062290000191
实施例3.
完全多孔乙烯桥联杂化(BEH)颗粒可以按照如美国专利6,686,035中所述的方法制备，或者可以以各种粒径和孔径以柱从Waters Corporation,Milford,MA,USA商购获得，包括具有
Figure BDA0004048062290000193
孔径(BEH 130)和/>
Figure BDA0004048062290000194
孔径(BEH 300)的10μm颗粒。通过在无水条件下在甲苯和含有一个或多个胺基团的有机硅烷(参见表2)中回流2小时，将BEH颗粒官能化。然后分离颗粒并在甲苯、丙酮和丙酮/水混合物中洗涤。然后在真空下在升高的温度下干燥颗粒。在一些情况下，可通过在无水条件下将颗粒在甲苯、硅烷和吡啶中回流20小时，然后分离颗粒并在甲苯、丙酮和丙酮/水混合物中洗涤，用乙基三氯硅烷将颗粒进一步官能化(即，在完成初始官能化之后)。
表2
Figure BDA0004048062290000192
实施例4.
通过在无水条件下将颗粒在甲苯和硅烷中回流2小时，然后分离颗粒并在甲苯、丙酮和丙酮/水混合物中洗涤，用[3-(二乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷(参见表3)将完全多孔二氧化硅颗粒官能化。然后在真空下在升高的温度下干燥颗粒。在一些情况下，然后通过在无水条件下将颗粒在甲苯、硅烷和吡啶中回流20小时，然后分离颗粒并在甲苯、丙酮和丙酮/水混合物中洗涤，用乙基三氯硅烷(参见样品ID 4c)将颗粒进一步官能化。然后在真空下在升高的温度下干燥颗粒。此类颗粒也可以使用实施例3的附加配体以相同的方式官能化。
表3
Figure BDA0004048062290000201
实施例5.
除了TEOS和BTEE之外，可以将如实施例1中描述的有机/无机周围材料改性为包括含有一个或多个胺基团的有机硅烷(例如，[3-(二乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷)作为第三组分，以产生具有与实施例2中描述的最终颗粒类似的表面组成的颗粒。
实施例7.
在该实施例中，将根据实施例3制备的具有3-(二乙基氨基)丙基配体的BEH 130和BEH 300颗粒，以及具有二乙基氨基官能团的基于OasisTM的阴离子交换剂的颗粒用于分析含有GEM 91、完全硫代化的25聚体(mw 7776.3)和来自Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA的定制合成的50聚体(mw 15,879.6)的样品。制备在水中含有寡核苷酸的溶液。
使用装载有约2mg吸附剂颗粒的96孔板。用甲醇调节板，并且用50mM乙酸铵平衡至pH 5.5。将样品装载到板上并用50mM乙酸铵(pH 5.5)洗涤两次，随后用20:80甲醇:乙酸铵(pH 5.5)再洗涤两次。然后通过使用20:80甲醇:50mM TEA(pH 12)的2次洗脱洗涤，随后使用20:80甲醇:羟乙磷酸(pH 8)的另外2次洗脱洗涤从吸附剂洗脱分析物。在氮气下在70℃下短暂蒸发样品以在分析之前蒸发甲醇。为了评估回收率，在洗脱溶剂中制备标准物并在蒸发前添加到洗脱板中。使用负离子MRM分析通过LC/MS分析样品。使用WatersTargetLynxTM应用管理器软件对色谱峰进行定量以将每个峰相对于内部标准进行积分，并将峰面积比对浓度作图。结果示于图1至图4中。
发现最有效的配体是基于BEH的材料上的3-(二乙基氨基)丙基(DEAP-pKa约11)，这证明分析物从板几乎完全回收。
OasisTM20μm
Figure BDA0004048062290000211
-DEAP(GEM 91)展示出约45％的回收率，从188ng/mL来看呈线性关系。BEH 300-DEAP封端(GEM 91)展示出>90％的回收率并且与从23ng/mL呈线性。
BEH 300-DEAP封端(50聚体)展示出>96％的回收率并且与从82ng/mL呈线性。
实施例7.
在该实施例中，根据实施例3制备的固定相颗粒，具体地，具有二乙基氨基丙基表面基团(pKa为约11)的固定相BEH 130颗粒，具有4-吡啶基乙基表面基团(pKa为约6.0)的固定相BEH 130颗粒以及具有哌嗪表面基团(pKa为约9.8)的固定相BEH 130颗粒用于分析从Integrated DNA Technologies获得的长度范围为15聚体、20聚体、25聚体、30聚体和35聚体的寡核苷酸。制备在水中含有寡核苷酸的溶液。
使用装载有约2mg吸附剂颗粒的96孔板。用甲醇调节板，并且用50mM乙酸铵平衡至pH 5.5。将每个样品装载到板上并用50mM乙酸铵(pH 5.5)洗涤两次，随后用20:80甲醇:乙酸铵(pH 5.5)再洗涤两次。然后通过使用50:50MP B:200mM TEA的2种洗脱溶液从吸附剂中洗脱分析物，其中MP B由50％ MeOH、7.5mM TEA和200mM六氟异丙醇(HFIP)形成。将从第一洗脱步骤和第二洗脱步骤中的每一者获得的样品在氮气下在70℃下短暂蒸发以在分析之前蒸发甲醇和HFIP。为了评估回收率，在洗脱溶剂中制备标准物并在蒸发前添加到洗脱板中。使用负离子MRM分析通过LC/MS分析样品。使用Waters TargetLynxTM应用管理器软件对色谱峰进行定量以将每个峰相对于内部标准进行积分，并将峰面积比对浓度作图。
从第一洗脱步骤获得的样品的结果示于图5A至图5C中，其示出在所有低聚物中，具有pKa为约11的二乙基氨基丙基表面基团的固定相颗粒的百分比回收率最高(图5A)，具有4-吡啶基乙基表面基团(pKa为约6.0)的固定相颗粒的百分比回收率最低(图5B)，并且具有哌嗪表面基团(pKa为约9.8)的固定相颗粒的百分比回收率为中等(图5C)。因此，观察到百分比回收率随pKa增加而增加。
图6A至图6B示出具有二乙基氨基丙基表面基团的固定相颗粒(图6A)和具有哌嗪表面基团的固定相颗粒(图6B)的第二洗脱步骤的百分比回收率数据。这些结果表明，相对于具有二乙基氨基丙基表面基团的固定相颗粒(图6A)，具有哌嗪表面基团的固定相颗粒的百分比回收率更高(图6B)。这被认为是由于具有二乙基氨基丙基表面基团的颗粒的百分比回收率在第一洗脱步骤中较高的事实。

Claims (25)

1.一种执行固相萃取的方法，所述方法包括：
将包含一种或多种靶寡核苷酸和一种或多种包含蛋白质、脂质或两者的基质组分的样品装载到多孔阴离子交换吸附剂上，所述多孔阴离子交换吸附剂包含本体材料以及pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团，其中靶寡核苷酸被所述吸附剂保留并且基质组分被所述吸附剂保留或不保留；
使一种或多种洗涤溶液流过所述吸附剂，其中所述洗涤溶液从所述吸附剂去除任何保留的基质组分，而留下保留在所述吸附剂上的所述靶寡核苷酸；以及
使一种或多种洗脱溶液流过所述吸附剂，其中保留在所述吸附剂上的所述靶寡核苷酸被释放。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可电离表面基团包括含胺基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述含胺基团选自—NHR1基团、—NR1R2基团和含有至少一个氮原子的杂环体系，其中R1和R2独立地选自C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C3-C18杂环烷基、C6-C18芳基或C5-C18杂芳基。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述含胺基团包括二乙基氨基丙基(DEAP)、二异丙基氨基丙基、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、二丙基氨基乙基、或二异丙基氨基乙基或二乙氨基甲基基团。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述含胺基团通过连接部分连接至所述本体材料。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接部分包含烷基基团、酰胺基团、酯基团、磺基基团、醚基团、氨基甲酸酯基团和脲基团中的一者或多者。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接部分包含位于两个C1-C6-烷基基团之间的酰胺基团、酯基团、磺基基团、醚基团、氨基甲酸酯基团或脲基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述本体材料包括无机材料、无机-有机杂化材料、有机聚合物材料或它们的组合。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述本体材料包括二氧化硅基材料。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述二氧化硅基材料包括无机-有机杂化材料，所述无机-有机杂化材料包括二氧化硅区域和有机二氧化硅区域，在所述二氧化硅区域中，所述材料包含具有四个硅-氧键的硅原子，在所述有机二氧化硅区域中，所述材料包含具有一个或多个硅-氧键和一个或多个硅-碳键的硅原子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述有机二氧化硅区域包含桥接两个或更多个硅原子的取代或未取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚芳基部分。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中通过与C1-C18烷基硅烷化合物反应来降低所述二氧化硅基材料的表面处的硅烷醇基团的浓度。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述多孔阴离子交换吸附剂为整体形式或颗粒形式。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶寡核苷酸具有3聚体至7000聚体范围内的大小。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述多孔阴离子交换吸附剂具有75埃至200埃范围内的孔径并且所述样品含有一种或多种具有3聚体至50聚体范围内的大小的靶寡核苷酸，其中所述多孔阴离子交换吸附剂具有200埃至500埃范围内的孔径并且所述样品含有一种或多种具有25聚体至200聚体范围内的大小的靶寡核苷酸，并且/或者其中所述多孔阴离子交换吸附剂具有500埃至2000埃范围内的孔径，并且所述样品含有一种或多种具有100聚体至7000聚体范围内的大小的靶寡核苷酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种洗涤溶液包含有机溶剂和挥发性缓冲液。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述一种或多种洗脱溶液具有10至13范围内的pH。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种洗脱溶液包含多膦酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述一种或多种洗脱溶液包含一种或多种选自有机胺、碳酸氢铵、氢氧化铵或乙酸铵的碱以及一种或多种选自甲醇、乙醇或四氢呋喃的有机溶剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种洗脱溶液包含三乙胺(TEA)和甲醇。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述样品包括选自以下的生物流体：全血样品、血浆样品、血清样品、口腔液、脑脊液、粪便样品、鼻样品和尿液、生物组织诸如肝、肾和脑组织、组织匀浆、细胞或细胞培养上清液。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述样品装载到所述多孔阴离子交换吸附剂上之前用变性剂处理所述样品。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述变性剂选自蛋白酶诸如蛋白酶K、MS相容的表面活性剂、有机溶剂、脲、胍或取代的胍。
24.一种试剂盒，所述试剂盒包含：多孔阴离子交换吸附剂，所述多孔阴离子交换吸附剂包含pKa在约8至约12范围内的可电离表面基团；用于所述吸附剂的壳体；以及一种或多种选自以下的试剂盒组分：变性剂溶液、洗脱溶液或洗涤溶液。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述壳体选自多孔条带、多孔板、单次使用的筒或被配置用于在线SPE的多次使用的筒。
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