CN116179450A - 基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂 - Google Patents

基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂 Download PDF

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Abstract

基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，属于代谢工程技术领域。本发明包括通过弱化高附加值代谢物的关键性酶基因表达，采用自动化技术，结合突变‑筛选‑突变的闭环式蛋白进化方法，从迭代的关键性酶基因突变文库中筛选出效率高的关键性酶突变体基因。还提供了一种高附加值代谢物智能细胞工厂的构建方法和应用。本发明可有效解决目前高附加值代谢物无高通量分子探针或者分子探针筛选不稳定的问题，减少人力成本，缩短蛋白进化时间，减少中间产物与终产物抑制效应，增强核心代谢通量，实现高附加值化合物高效合成。

Description

基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂
技术领域
本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂。
背景技术
植物富含生理活性的天然产物(如萜类、生物碱、聚酮类化合物、黄酮类化合物等)，具有抗菌消炎抗癌等生理活性。自然条件多变、提取成本昂贵、产品纯度低等因素限制这些高附加值物质的市场供应。相比植物提取法，微生物合成法因发酵周期短、生产成本低、产品纯度高、环境友好等优势而被广泛关注。随着测序技术、基因操作技术的发展，国内外研究者已系统性建立各类底盘(如大肠杆菌、酵母菌、放线菌)的分子工具，便于外源途径克隆至微生物。
细胞需20-30％的能量用于蛋白合成，这些蛋白质参与各类小分子合成，用于组成细胞基本骨架与生长所需。外源天然产物合成途径导入微生物时，易打破生长所需平衡，诱发细胞生理环境改变或毒性信号产生，进而限制其产量。因此，理性设计微生物内源代谢网络与外源途径，可有效扭转微生物目标代谢物产量低的现状。系统生物学技术如基因组代谢网络技术可全局分析微生物代谢网络，便于后期理性改造关键性节点，进而提高目标代谢物产量。例如，OptForce工具可理性预测提高胞内丙二酰辅酶A含量的基因调控的最优方案，即敲除sucC和fumC基因，并强化pdh、pgk、gapd和acc等基因，最终，细胞内丙二酰辅酶A含量提高4倍，且柚皮素产量提升至474mg/L。理性改造天然产物外源途径为其目标代谢物产量提高的另一有效方法：分别进化核心代谢流各关键性酶，进而增强各代谢反应转化率、减少溢流、弱化中间产物与终产物毒性，实现底盘细胞正常生长情况下的核心代谢通路资源分配的最优解。
合成生物学打破了传统“格物致知”的研究思路，促使生命科学迈向“造物致知、造物致用”的新格局。基于此，合成生物学成为微生物设计与改造的有效工具，保障高附加值代谢物高效合成。例如，Liu等团队深度挖掘Erigeron breviscapus基因组序列，并借助合成生物学工具，实现在酵母生产breviscapine。其中，合成生物学的自动化技术以“设计-构建-测试-学习”的闭环思维，实现从上游基因元件设计、组装与下游产物测试、再设计等各个环节一体化，有效增强合成生物学理性改造微生物代谢流的深度与广度，实现高附加值代谢物高效合成。因此，借助自动化技术连续进化各类高附加值化合物代谢通路关键性酶，可有效维持细胞正常的生理环境，平衡细胞生长与核心代谢物合成代谢的资源分配，减少代谢溢流，并理性强化目标代谢物通路，创制微生物智能细胞工厂，实现高附加值化合物高效合成。
微生物合成法可有效克服植物来源天然产物供应不足的技术瓶颈。值得注意的是，微生物内源代谢网络复杂，且代谢物合成的细胞生理环境实时变化，因此，需借助系统生物学技术平衡细胞内源与外源代谢流的资源分配，但是系统生物学技术仅从全局水平提供可调控的关键性节点，后期仍需基因操作技术予以验证。
针对该瓶颈，近期崛起的系统基因组网络操作技术与合成生物学技术加速了微生物高附加值智能细胞工厂的进程。其中，合成生物学的自动化技术以“设计-构建-测试-学习”的闭环式理念，革新了微生物代谢工程改造的进程。此外，理性进化核心代谢流关键性酶，保障微生物打赢“内源生长代谢与目标代谢的实时博弈战事”，智能分配生长代谢与目标代谢流资源，保障高效合成目标代谢物。目前，大部分关键性酶缺乏晶体结构，随机突变成为酶定向改造的常用方法。突变库库容量宏大，且无高效、稳定的分子探针系统或化学方法，上述困境严重阻碍了最优突变体筛选，因此，高效的筛选方法成为核心代谢改造的瓶颈性问题。
若能借助自动化技术，即可实现载体构建、菌体培养、克隆子筛选及后续循环操作的闭环回路，保障高附加值目标代谢通路的连续自动进化，解决无高通量筛选方法获取突变体的瓶颈性问题，同时可解放人力，减少人为错误与时间成本，最终，跨越式提升高附加值代谢物产量，满足其市场需求，解决国民健康危机，提高国民生活品质。
植物中约有9000种黄酮类化合物(主要为柚皮素及其衍生物)被验证，具有抗氧化活性，可延缓衰老，广泛应用于食品与护肤品行业；也具有抗菌消炎、抗癌症等生理活性，且可缓解糖尿病、高血压、高血脂等病痛。黄酮类化合物作为新冠病毒的有效药物，可保障着人类生存与健康水准。综上所述，黄酮类化合物展现出极高的经济效益与医药战略价值。作为黄酮类基本骨架结构，柚皮素合成途径需要4个酶参与，包括酪氨酸氨裂解酶(tyrosineammonia lyase，TAL)、4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)、查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)。因此，本发明以柚皮素代谢流为实例，借助自动化技术连续进化柚皮素核心代谢流，解除其代谢屏障，实现黄酮类化合物高效合成。本发明可为其余各类高附加值代谢物核心代谢流连续进化，提供理论支撑与技术保障；有效解决其市场供应，保障国民生活品质与健康水准。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂。本发明首先弱化各类高附加值代谢物关键基因表达，并借助自动化技术，迭代筛选基因突变文库，进而连续定向改造高附加值化合物(如黄酮类物质)代谢通路关键性酶，使其达到或优于高拷贝数、强启动子的催化效能，解除代谢屏障，平衡代谢流，实现代谢物高产。
基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于通过弱化高附加值代谢物的关键性酶基因表达，采用自动化技术，结合突变-筛选-突变的闭环式蛋白进化方法，从迭代的关键性酶基因突变文库中筛选出效率高的关键性酶突变体基因。
所述的基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于所述高附加值代谢物包括类黄酮化合物、类黄酮化合物衍生物、类黄酮化合物经修饰后的化合物，所述类黄酮化合物包括柚皮素、花青素、黄芩素或生松素。
所述的高附加值代谢物智能细胞工厂的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将目标代谢物的关键性酶基因克隆至低拷贝数、弱启动子的质粒中，得到含有关键性酶基因的质粒；进而弱化各基因表达；
(2)以上述步骤(1)得到的含有关键性酶基因的质粒为模板，采用易错PCR技术制备突变文库，结合Gibson技术，将上述突变文库连接至低拷贝数质粒上，经抗生素平板筛选质粒，经电转化至BL21(DE3)感受态，得到关键性酶基因突变文库；
(3)采用QPix自动化挑菌设备挑取上述步骤(2)得到的关键性酶基因突变文库中的突变体，进行发酵培养，得到突变体发酵液；该类突变体呈现出高拷贝数、强启动子质粒野生型酶的催化效能；
(4)采用自动化移液工作站移取上述步骤(3)得到的突变体发酵液，自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛；
(5)采用自动化移液工作站移取上述步骤(4)中高产量的目标代谢物的突变体发酵液，定量测定目标代谢物的产量；
(6)重复上述步骤(1)-(5)，直至目标代谢物的产量不再提高为止，即得到关键性酶基因的目标突变体。使该突变体呈现出等同于或者优于高拷贝数、强启动子质粒野生型酶的催化效率，进而增强各关键性酶的转化效率，减少中间产物与终产物抑制，提高核心代谢流通量。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中抗生素平板包括氯霉素平板或链霉素平板。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中发酵培养的具体操作为：将挑取的突变体置于深孔板中，运用自动化机械臂，转移至高速摇床培养过夜，以0.5-3％接种量转移至发酵培养基中，培养1-3天。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛的具体步骤为：测定荧光与UV信号，即为数值A，加入显色剂，测定数值为B，根据计算机编译程序自动计算B-A的数据，即为目标代谢物的产量初筛。
所述的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中定量测定目标代谢物的产量的具体步骤为：将高产量的目标代谢物的突变体发酵液与等体积无水乙醇混合，静置，采用自动化机械臂转移样品至离心机中离心，采用自动化移液工作站转移上清液至深孔板，利用HPLC方法定量突变体目标代谢物的产量。
所述的制备方法，其特征在于所述静置的时间为20-60分钟，所述离心的条件为：转速4000-12000rpm，时间5-30分钟。
任一所述的高附加值代谢物智能细胞工厂在高附加值代谢物高效合成上的应用。
任一所述的构建方法在利用自动化技术对高附加值化合物代谢通路关键性酶连续进化上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过首先弱化基因表达，借助自动化技术，结合“突变-筛选-突变”的闭环式蛋白进化方法，从迭代的随机突变库中筛选出高效率的关键酶，为各类高附加值代谢物途径平衡与进化，提供新思路，可有效解决目前高附加值代谢物无高通量分子探针或者分子探针筛选不稳定的问题，减少人力成本，缩短蛋白进化时间，减少中间产物与终产物抑制效应，增强核心代谢通量，实现高附加值化合物高效合成。
(2)本发明能够平衡核心代谢流基因表达水平，实现高附加值代谢物的高效合成，可根本性解决黄酮类化合物市场供应不足的问题，缓解全民健康的危机，抵御新冠病毒的威胁，保障国民生存与健康水平。
附图说明
图1为本发明的构建方法流程图；
图2为黄酮类化合物基本骨架结构；
图3为柚皮素(Naringenin)的合成路径；
图4为自动化技术连续进化核心代谢流关键性基因流程图；
图5为不同工程菌及其柚皮素的产量。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例1说明了自动化技术连续进化各目标核心代谢流的普适性方法，其具体技术方案如下所示：如图1所示为本发明的构建方法流程图。
(1)分别将目标高附加代谢物的关键性基因克隆至低拷贝数、弱启动子质粒。以自动化操作技术完成如下操作：以上述目标基因的质粒为模板，借助易错PCR技术，制备各基因的突变文库，结合Gibson技术，将突变文库连接至低拷贝数质粒，氯霉素抗生素平板筛选突变文库。高附加值代谢物包括类黄酮化合物、类黄酮化合物衍生物、类黄酮化合物经修饰后的化合物，黄酮类化合物基本骨架结构如图2所示。
(2)各基因突变文库：获取各氯霉素抗性平板菌体对应质粒，并电转化至BL21(DE3)感受态，氯霉素平板筛选，即为各关键性基因突变体文库。
(3)自动化的基因突变文库挑取与培养技术：即运用QPix自动化挑菌设备，挑取克隆子至96深孔板，运用自动化机械臂，转移至高速摇床培养过夜。以1％接种量，转移至发酵培养基，培养1-3天。
(4)提自动化工作站筛选突变文库：即运用自动化移液工作站移取发酵上清100ul，测定荧光与UV信号，即为数值A，加入显色剂，测定数值为B，根据计算机编译程序自动计算B-A数据，即为突变体目标代谢物产量C。
(5)自动化测定突变文库目标高附加值产物产量：运用自动化移液工作站，移取第四方面代谢物产量较高的突变体发酵培养液，并与等体积无水乙醇混合，静止30分钟。借助自动化机械臂转移样品至离心机，4000rpm离心10分钟。运用移液工作站转移300ul上清样品至96深孔板，并借助HPLC方法定量突变体目标代谢物产量。
(6)运用上述自动化平台技术重复第(1)-(5)步骤，直至各基因突变体产量不再提高为止，即为对应基因的最优突变体，借助Sanger测序技术分析突变位点信息，系统性阐释各基因突变体增强核心代谢通路的机制。
实施例2：
本实施例2进一步以柚皮素为具体实例，详细说明自动化技术连续进化目标代谢流的方案流程，如下所示：柚皮素(Naringenin)的合成路径如图3所示。
本发明提供柚皮素核心代谢流的4个关键性酶：Rhodotorulaglutinis来源的酪氨酸氨裂解酶(tyrosine ammonia lyase，TAL；KF765779)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Petroselinumcrispum来源的4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL；KF765780)，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；PetuniaXhybrida来源的查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS；KF765781)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Medicago sativa来源的查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI；KF765782)，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(1)分别将柚皮素合成的关键性基因克隆至pSC101拷贝数质粒。并以自动化操作技术完成如下操作，以这些质粒为模板，借助Agilent突变试剂盒，制备各基因的突变文库，结合Gibson技术，将突变文库连接至pSC101质粒，氯霉素抗生素平板筛选突变文库。
(2)各基因突变文库：如TAL基因对应含pCDF-4CL-CHS-CHI基因型的电转感受态，电转TAL突变库至该感受态，在链霉素与氯霉素平板筛选所得的克隆子，即为TAL基因突变体。以此类推，获得4CL、CHS、CHI突变文库。
(3)自动化的基因突变文库挑取与培养技术：即运用QPix自动化挑菌系统，挑取克隆子至96深孔板，运用自动化机械臂，转移至高速摇床培养过夜。以1％接种量，转移至发酵培养基，培养2天。
(4)自动化测定突变文库Naringenin产量初筛方法：运用自动化移液工作站，移取发酵上清培养基100uL，373nm测定Naringenin产量A，加入2％Al3+-MOPS 100uL溶液，测定Naringenin产量B。根据计算机编译程序自动计算B-A数据，即为突变体Naringenin产量C。
(5)自动化测定突变文库Naringenin产量：运用自动化移液工作站，移取第四方面Naringenin产量较高的突变体发酵培养液，并与等体积无水乙醇混合，借助HPLC方法定量突变体Naringenin产量。
(6)运用上述自动化平台技术重复第(1)-(5)步骤，直至各基因突变体Naringenin产量不再提高为止，即为对应基因的最优突变体，借助Sanger测序技术分析突变位点信息，阐释4个基因突变体如何增强Naringenin核心代谢通路。自动化连续进化核心代谢流的流程如图4所示。
本发明已经过实验验证，实验结果证明：运用自动化技术，分别进化柚皮素合成途径的三个关键性酶，可跨越式提升柚皮素产量，结果如图5所示：最优TAL突变体柚皮素产量由151mg/L提高至523mg/L，相比TAL野生型菌株提高了2.50倍；4CL突变体柚皮素产量由45mg/L提高至135mg/L，相比野生4CL菌株提高了1.96倍；CHS突变体柚皮素产量由9mg/L提高至79mg/L，相比CHS野生型菌株提高了野生菌7.78倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院,森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
<120> 基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂
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caccacgagg aagaggttaa ggttaaggat gatgaaggca ttctgcgtca ggatcgttat 1020
ccgctgcgca ccagcccgca atggctgggt ccgctggtgt ccgacctgat tcacgctcat 1080
gccgttctga ccatcgaagc gggtcaaagc accaccgata acccactgat cgatgttgag 1140
aacaagacca gccatcacgg tggcaacttt caagcggcag cggttgccaa cactatggaa 1200
aagacccgtc tgggcctggc ccaaatcggt aaactgaact tcacccagct gaccgagatg 1260
ctgaacgcgg gcatgaaccg tggcctgccg agctgcctgg cggctgaaga cccatccctg 1320
agctatcatt gcaaaggtct ggacattgcg gcggctgcat ataccagcga actgggccac 1380
ctggctaacc cggttaccac ccacgttcaa ccggctgaaa tggcaaacca ggcggtgaac 1440
agcctggcgc tgattagcgc acgtcgtacc accgaatcta acgacgttct gtccctgctg 1500
ctggcaaccc acctgtactg cgtgctgcag gcgatcgacc tgcgtgcgat tgagttcgag 1560
ttcaagaaac agtttggtcc ggccattgtt agcctgatcg accaacactt tggtagcgcg 1620
atgaccggta gcaacctgcg tgatgagctg gttgaaaagg ttaacaagac tctggccaag 1680
cgtctggagc aaaccaacag ctacgatctg gttccgcgct ggcacgacgc ttttagcttc 1740
gctgcaggca ctgttgttga ggttctgtcc agcaccagcc tgagcctggc ggccgtgaac 1800
gcatggaagg ttgcggcagc cgagagcgcg atctccctga cccgccaggt tcgtgaaacc 1860
ttttggtccg ctgcaagcac ctccagcccg gcgctgtctt acctgagccc gcgcacccag 1920
atcctgtacg catttgtgcg tgaggaactg ggtgttaaag cccgccgtgg tgacgttttc 1980
ctgggtaaac aagaagttac catcggcagc aacgttagca agatttacga agccatcaag 2040
agcggccgta tcaacaacgt tctgctgaag atgctggcat aa 2082
<210> 2
<211> 1635
<212> DNA
<213> 4CL
<400> 2
atgggtgact gcgttgcccc gaaagaggat ctgatcttcc gcagcaaact gccggacatt 60
tacattccaa agcatctgcc gctgcatacc tattgttttg agaacatcag caaggttggc 120
gacaagagct gtctgatcaa cggcgcaacc ggcgaaacct ttacctacag ccaggttgag 180
ctgctgtccc gtaaagttgc cagcggcctg aacaagctgg gcattcaaca aggtgatacc 240
attatgctgc tgctgccgaa ctccccggag tactttttcg ctttcctggg tgcgagctat 300
cgcggtgcaa tcagcactat ggcgaaccca ttctttacca gcgcagaagt gatcaagcaa 360
ctgaaagcga gccaagcgaa gctgattatc acccaggcat gctatgttga caaggttaag 420
gactacgcag cggagaaaaa catccagatc atttgtattg acgatgcacc gcaggattgc 480
ctgcacttta gcaagctgat ggaagcggat gagagcgaaa tgccggaagt ggttattaac 540
agcgatgatg tggtggcact gccgtacagc tctggcacca ccggcctgcc gaaaggcgtt 600
atgctgaccc acaagggtct ggttaccagc gttgcacaac aggtggatgg tgataacccg 660
aacctgtata tgcactccga ggatgttatg atctgcatcc tgccactgtt ccatatctat 720
agcctgaacg ctgttctgtg ttgtggtctg cgtgcgggcg ttaccattct gatcatgcaa 780
aagttcgaca ttgtgccgtt tctggagctg attcagaagt ataaggttac cattggtccg 840
tttgttccgc cgatcgtgct ggccatcgcg aaaagcccgg ttgttgacaa gtacgacctg 900
tctagcgtgc gcaccgttat gagcggtgca gcgccgctgg gtaaagagct ggaggacgct 960
gttcgtgcga aattcccgaa cgcgaagctg ggtcaaggct atggcatgac cgaagccggt 1020
ccggttctgg cgatgtgtct ggcgttcgcc aaagagccgt atgagattaa gtctggcgca 1080
tgcggtaccg ttgtgcgtaa cgccgagatg aaaatcgttg acccagaaac caacgcgtct 1140
ctgccgcgta accagcgtgg tgagatttgc atccgtggtg atcagattat gaaaggttac 1200
ctgaacgacc cggaaagcac ccgcaccacc atcgacgaag agggttggct gcacaccggt 1260
gacattggtt tcatcgacga tgacgatgaa ctgttcattg ttgatcgtct gaaagaaatc 1320
attaagtaca aaggttttca agttgctccg gcggagctgg aagcactgct gctgacccac 1380
ccgaccatca gcgatgccgc ggtggttccg atgattgacg agaaagcggg tgaagtgcca 1440
gtggcgtttg ttgtgcgtac caacggtttt accaccaccg aagaagaaat caaacaattt 1500
gtgagcaaac aggttgtgtt ctacaaacgt atcttccgcg ttttcttcgt tgacgctatt 1560
ccgaaatccc cgagcggcaa gattctgcgt aaggatctgc gcgctcgtat tgcgagcggc 1620
gacctgccga agtaa 1635
<210> 3
<211> 1170
<212> DNA
<213> CHS
<400> 3
atggttacgg tggaagaata ccgcaaagct caacgcgctg aaggcccggc gacggtgatg 60
gcgattggca cggcaacccc gacgaactgt gttgatcaga gcacctatcc ggactattac 120
tttcgtatca ccaactctga acataaaacg gatctgaaag aaaaattcaa acgtatgtgc 180
gaaaaaagca tgatcaaaaa acgctatatg cacctgaccg aagaaattct gaaagaaaat 240
ccgagcatgt gtgaatacat ggcaccgtct ctggatgctc gccaggacat tgtggttgtc 300
gaagtgccga aactgggtaa agaagcggcc cagaaagcga tcaaagaatg gggccaaccg 360
aaatcaaaaa ttacccatct ggtcttttgc accacgtcgg gtgtggatat gccgggttgt 420
gactatcaac tgacgaaact gctgggtctg cgtccgagcg tgaaacgcct gatgatgtac 480
cagcaaggct gcttcgcagg cggtaccgtt ctgcgtctgg cgaaagatct ggccgaaaac 540
aataaaggtg cgcgtgttct ggtggtgtgt agtgaaatca ccgctgttac gtttcgtggt 600
ccgaacgata cgcacctgga ctccctggtt ggccaggccc tgttcggtga tggtgcaggt 660
gccattatca ttggtagcga cccgattccg ggcgttgaac gtccgctgtt tgaactggtc 720
agcgcagctc aaaccctgct gccggatagc cacggcgcaa ttgacggtca cctgcgtgaa 780
gtcggtctga cgttccatct gctgaaagat gtgccgggcc tgatctcaaa aaacattgaa 840
aaaagcctgg aagaagcgtt tcgcccgctg agtatctccg attggaacag cctgttctgg 900
attgcacatc cgggcggccc ggcaatcctg gaccaggtcg aaattaaact gggtctgaaa 960
ccggaaaaac tgaaagcgac ccgtaatgtt ctgtcaaact acggcaatat gagctctgcc 1020
tgcgtcctgt ttattctgga tgaaatgcgc aaagcatcgg ctaaagaagg tctgggcacc 1080
acgggtgaag gcctggaatg gggcgtgctg ttcggctttg gtccgggtct gacggtggaa 1140
acggtggttc tgcatagtgt ggctacctaa 1170
<210> 4
<211> 669
<212> DNA
<213> CHI
<400> 4
atggcagcaa gcattacggc aatcacggtt gaaaatctgg aatatccggc ggtcgttacc 60
tctccggtca cgggcaaatc atactttctg ggcggtgccg gtgaacgtgg tctgaccatt 120
gagggtaact ttatcaaatt cacggcaatt ggcgtttatc tggaagatat cgcggtcgcc 180
tcactggcgg ccaaatggaa aggtaaaagc tctgaagaac tgctggaaac cctggatttt 240
taccgtgaca ttatctcagg cccgttcgaa aaactgatcc gtggttcgaa aattcgcgaa 300
ctgagcggcc cggaatattc tcgcaaagtc atggaaaact gcgtggctca tctgaaatcc 360
gtcggcacgt acggtgacgc agaagctgaa gcgatgcaga aatttgccga agcattcaaa 420
ccggtgaatt ttccgccggg tgccagtgtt ttctatcgtc aatccccgga tggcatcctg 480
ggtctgtcat tttcgccgga caccagcatc ccggaaaaag aagcagctct gattgaaaat 540
aaagctgtga gttccgcggt tctggaaacg atgattggcg aacacgcggt ttctccggat 600
ctgaaacgct gtctggctgc tcgcctgccg gctctgctga atgaaggtgc ctttaaaatc 660
ggtaactga 669

Claims (10)

1.基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于通过弱化高附加值代谢物的关键性酶基因表达，采用自动化技术，结合突变-筛选-突变的闭环式蛋白进化方法，从迭代的关键性酶基因突变文库中筛选出效率高的关键性酶突变体基因。
2.如权利要求1所述的基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于所述高附加值代谢物包括类黄酮化合物、类黄酮化合物衍生物、类黄酮化合物经修饰后的化合物，所述类黄酮化合物包括柚皮素、花青素、黄芩素或生松素。
3.如权利要求1所述的高附加值代谢物智能细胞工厂的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将目标代谢物的关键性酶基因克隆至低拷贝数、弱启动子的质粒中，得到含有关键性酶基因的质粒；
(2)以上述步骤(1)得到的含有关键性酶基因的质粒为模板，采用易错PCR技术制备突变文库，结合Gibson技术，将上述突变文库连接至低拷贝数质粒上，经抗生素平板筛选质粒，经电转化至BL21(DE3)感受态，得到关键性酶基因突变文库；
(3)采用QPix自动化挑菌设备挑取上述步骤(2)得到的关键性酶基因突变文库中的突变体，进行发酵培养，得到突变体发酵液；
(4)采用自动化移液工作站移取上述步骤(3)得到的突变体发酵液，自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛；
(5)采用自动化移液工作站移取上述步骤(4)中高产量的目标代谢物的突变体发酵液，定量测定目标代谢物的产量；
(6)重复上述步骤(1)-(5)，直至目标代谢物的产量不再提高为止，即得到关键性酶基因的目标突变体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中抗生素平板包括氯霉素平板或链霉素平板。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中发酵培养的具体操作为：将挑取的突变体置于深孔板中，运用自动化机械臂，转移至高速摇床培养过夜，以0.5-3％接种量转移至发酵培养基中，培养1-3天。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛的具体步骤为：测定荧光与UV信号，即为数值A，加入显色剂，测定数值为B，根据计算机编译程序自动计算B-A的数据，即为目标代谢物的产量初筛。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中定量测定目标代谢物的产量的具体步骤为：将高产量的目标代谢物的突变体发酵液与等体积无水乙醇混合，静置，采用自动化机械臂转移样品至离心机中离心，采用自动化移液工作站转移上清液至深孔板，利用HPLC方法定量突变体目标代谢物的产量。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述静置的时间为20-60分钟，所述离心的条件为：转速4000-12000rpm，时间5-30分钟。
9.如权利要求1-2任一所述的高附加值代谢物智能细胞工厂在高附加值代谢物高效合成上的应用。
10.如权利要求3-8任一所述的构建方法在利用自动化技术对高附加值化合物代谢通路关键性酶连续进化上的应用。
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