CN116165187B - 一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法及成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法及成像方法。本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法包括如下步骤：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物；对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位；荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物；利用定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹；基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正。本发明的有益效果为：提高目标分子的定位精度，有效提高了成像性能。

Description

一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法及成像方法
技术领域
本发明涉及生物样品成像技术领域，具体涉及一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，还涉及一种采用所述基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法的成像方法。
背景技术
由于单分子定位显微镜（SMLM）具有前所未有的分辨率，其对细胞的成像过程提供了重要的见解。SMLM方法，例如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM），通过在时间上切换荧光分子的发射状态来克服衍射极限，以便每次都可以很好地识别和定位来自单个荧光分子的点扩散函数（PSF）以找到其中心位置，这使得定位精度受限于信噪比（SNR）而不是光的波长。
尽管荧光分子的光开关能够精确定位它们的位置，但由于需要数千帧的成像序列来重构超分辨率图像，成像时间延长至几十分钟甚至是数小时。在采集过程中，光学装置的机械运动，例如机械部件的振动和弛豫，使得样品和物镜之间产生相对移动。这种漂移会严重降低重建图像的分辨率。为了进行漂移矫正，常用的方法是使用基准标记物，例如可以在整个实验中保持发光的荧光珠，测量和跟踪基准标记（附在盖玻片上）与图像视野（由物镜设置）的相对位置。通常，基准标记是一个亚微米大小的珠子，它应该足够亮，这样它的位置就可以比成像的单个分子的定位精度更好的精度来确定。荧光珠固定在显微镜盖玻片上，其位置由单分子定位算法进行定位，然后通过计算这些荧光珠的位移轨迹来估计载物台漂移。这样就可以通过减去估计的漂移量来矫正每一帧中目标分子的定位。
在漂移矫正中使用基准标记的一个关键假设是基准标记相对于样本是静态的。然而，基准标记是否静止一直是一个悬而未决的问题。珠子的热运动已在先前的一些研究中有所报道。但荧光珠在SMLM中常规使用的不同固定条件下是否保持静态的，以及它们的运动如何影响漂移的矫正，尚未得到充分研究。
基准标记物的运动会大大降低漂移矫正的准确性，导致基准标记物或单个分子的定位精度变差。因此，基准标记物的运动筛选在漂移矫正中是非常有必要的，可确保高精度漂移矫正和良好的成像性能，为了研究这个问题，应该开发一种能够有效评估基准标记物运动幅度、并对基准标记物进行漂移矫正和筛选的方法。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明提供一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，还提供一种采用所述基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法的成像方法，从而提高目标分子的定位精度，提高成像性能。
本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，包括如下步骤：
S1：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物；
S2：对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位；
S3：荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物；
S4：利用定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹；
S5：基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正。
进一步地，步骤S1中，所述荧光基准标记物通过固定技术固定在盖玻片上，或者固定到需要成像的生物样品内部，所述固定技术包括但不限于：非共价键的吸附、共价键结合或者用链亲和素的亲和捕获。
进一步地，步骤S2中，所述荧光基准标记物定位的方法为：
使用定位算法对荧光基准标记物和生物样品中的荧光分子进行定位；再通过聚类算法将每一个荧光基准标记物在成像序列中的定位位置序列归成一簇；获取每一个荧光基准标记物的定位序列。
进一步地，步骤S3中，所述荧光基准标记物筛选的具体方法为：
S301：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹值取平均，作为初始漂移轨迹；
S302：利用初始漂移轨迹对成像视场中的荧光基准标记物做漂移矫正，并利用矫正之后的荧光基准标记物坐标计算均方距离或者平均距离；
S303：筛选所述均方距离或者平均距离小于设定值的荧光基准标记物，作为定位荧光基准标记物。
进一步地，在步骤S301执行前，还可以包括误差抑制步骤：通过平滑算法抑制所述荧光基准标记物的定位位置计算误差。
进一步地，步骤S302中，所述均方距离或者平均距离的计算公式为：
、/>，其中，为均方距离，/>为平均距离，/>为时间间隔，/>为整个成像序列中时间窗口为/>的所有可能组合，/>，/>为时间节点/>的定位位置。
本发明还提供一种成像方法，所述成像方法采用所述的基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法。
进一步地，所述成像方法借助单分子定位实现超越衍射极限分辨率的成像，所述成像方法包括：随机光学重建显微镜成像技术及其各种技术衍化、光激活定位显微镜成像技术及其各种技术衍化、DNA点积累定位成像技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于荧光基准标记物的运动会大大降低漂移矫正的准确性，导致基准标记物或单个分子的定位精度变差，本发明基于荧光基准标记物充足的质心定位轨迹信息，通过时间平均的均方位移或平均位移分析，可以清楚地揭示荧光基准标记物的运动，从而能够对运动幅度比较大的基准标记物进行筛除，无需对成像装置进行任何复杂的硬件修改，有效地筛选出适合定位用的定位基准标记物，并采用所述定位基准标记物的漂移轨迹进行漂移矫正，有效提高了样品的定位精度，提高了成像技术的成像性能。此外，本发明不会影响单分子定位显微镜的成像过程，简单易用，易于实施，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或现有技术中的方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法流程图；
图2为现有技术在弱光条件下采用显微镜所成图像；
图3为利用被矫正物潜在结构进行漂移矫正的correlation方法矫正得到的超分辨图像；
图4为用均方位移（MSD）最小的一颗荧光微珠矫正得到的超分辨图像；
图5为用均方位移（MSD）最小的两颗荧光微珠矫正得到的超分辨图像；
图6为用均方位移（MSD）最大的荧光微珠矫正图像得到的超分辨图像。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
如图1所示，本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，包括如下步骤：
S1：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物。
本例将荧光微珠、量子点等荧光基准标记物通过各种固定技术固定到盖玻片上，或者固定到需要成像的生物样品内部，如细胞内部；固定的方法可参考单分子定位显微镜的常规样品制备方法。通过调节荧光基准标记物的密度，确保每个成像视场有多个荧光基准标记物，本例选用5-6颗荧光微珠。
本例选用地固定技术包括但不限于：非共价键的吸附、共价键结合或者用链亲和素的亲和捕获等。
S2：对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位。
对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，使用各种定位软件或算法（比如ImageJ等）对荧光基准标记物和生物样品中的荧光分子进行定位；再通过聚类算法（比如DBSCAN等），将每一个荧光基准标记物在成像序列中的定位位置序列归成一簇，由于荧光基准标记物发光亮且持续时间长的特点，可认为含有较多定位的簇代表了荧光基准标记物；然后计算获取每一个荧光基准标记物的定位序列。
S3：荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物。
本例所述荧光基准标记物筛选的具体方法为：
S301：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹值取平均，作为初始漂移轨迹；
S302：利用初始漂移轨迹对成像视场中的荧光基准标记物做漂移矫正，并利用矫正之后的荧光基准标记物坐标计算均方距离或者平均距离；
S303：筛选所述均方距离或者平均距离小于设定值的荧光基准标记物，作为定位荧光基准标记物。
由于单个荧光基准标记物的定位位置随着时间的变化，定位位置的变化情况包含定位位置的计算误差、自身的运动和样品台的漂移运动。所以在步骤S301执行前，还包括误差抑制步骤：通过平滑算法消除所述荧光基准标记物的定位位置计算误差。定位误差是每一次定位的时候由于信噪比引起的不确定性，可先通过平滑算法将定位位置计算误差减小。平滑之后再进行筛选处理。
步骤S302中，所述均方距离或者平均距离的计算公式为：
、/>，其中，为均方距离，/>为平均距离，/>为时间间隔，/>为整个成像序列中时间窗口为/>的所有可能组合，/>，/>为时间节点/>的定位位置。
步骤S303中，如果是荧光基准标记物有自身运动，那么均方距离或者平均距离的时间平均值会比较大。本例设定一筛选值，这些数值比较大、超过所述筛选值的基准标记物可以筛掉，剩下的基准标记物作为定位基准标记物，用于重新进行漂移矫正。
S4：利用定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹。
这个时候定位荧光基准标记物的定位位置随着时间的变化，仅包含了定位位置的计算误差和样品台的漂移运动。通过平滑算法减小定位误差的影响，对多颗定位基准标记物的轨迹取平均，得到新的漂移运动轨迹。
S5：基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正。
本例将同一视频帧中生物样品中的荧光分子的定位，减去视频帧中计算的新的漂移轨迹，完成漂移矫正。
本发明能够应用于现有的样品成像技术中，从而显著提高成像技术的成像性能，本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法适用于单分子定位显微成像技术，比如随机光学重建显微镜（STORM）及其各种技术衍化（如直接随机光学重建显微镜等）、光激活定位显微镜（PALM）及其各种技术衍化、DNA 点积累定位（DNA-PAINT）等各种借助单分子定位实现超越衍射极限分辨率的成像技术。
如图2-图6所示，作为本发明的一个实施例，本实施例提供了一种利用荧光微珠进行微管成像的漂移矫正实验方案。
微管样品所用细胞为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），使用含有Triton、PIPES、EGTA、MgCl2、甲醛和戊二醛的buffer进行固定与破膜，并使用α-Tubulin-Mouse与AF-647_Mouse等试剂对微管进行染色；荧光微珠使用多聚甲醛溶液固定在样品细胞中；最后使用含有glucose、超纯水、Tris、NaCl、NaOH、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和β-巯基乙醇的成像缓冲液buffer对样品进行封存，在STORM装置上进行拍摄。
样品制备的时候，通过调整微珠的密度，确保视场中至少含有5颗用实验常用方法固定在样品中的荧光微珠。
首先，使用STORM装置进行拍摄，在弱光下得到分辨率受衍射极限限制低分辨率图像，如图2所示。
其次，使用利用被矫正物潜在结构进行漂移矫正的correlation方法进行漂移矫正作为对照，并通过矫正后的坐标进行图像重构，得到的图像如图3所示。
然后，使用Matlab中的DBSCAN聚类算法对18000帧定位数据进行聚类，将目标物按空间聚集特性分类，找出荧光微珠的所有定位坐标，画出每颗荧光微珠的定位坐标随着时间变化的漂移轨迹曲线。通过平滑算法将定位位置计算误差减小。平滑之后，对多颗荧光微珠的定位轨迹取平均，作为初始的漂移轨迹估计。
荧光微珠的定位位置，减去每帧的初始漂移量，得到矫正后的定位位置。使用矫正后的定位位置，计算均方距离（MSD）。均方距离的时间平均值的大小，揭示了荧光微珠运动幅度的大小。
选取均方距离的时间平均值比较小的荧光微珠，作为定位荧光微珠，重新通过平滑算法将定位位置计算误差减小，并且对这些定位荧光微珠的定位轨迹取平均，作为更精确的漂移轨迹。将微管的定位数据减去重新计算的漂移轨迹，可以得到更好的微管成像效果。
为了展示微珠运动对漂移矫正的影响，本实施例中选取了具有不同均方距离平均值的微珠，分别对微管图像进行漂移矫正，其中，图4为用均方位移（MSD）最小的一颗荧光微珠矫正得到的超分辨图像；图5为用均方位移（MSD）最小的两颗荧光微珠矫正得到的超分辨图像；图6为用均方位移（MSD）最大的荧光微珠矫正图像得到的超分辨图像。
通过图4-图6成像效果对比可知，使用均方位移比较大的荧光微珠以及correlation方法漂移矫正后，其重构得到的超分辨图像比较模糊，而使用均方位移比较小的荧光微珠矫正漂移，其超分辨图像更加清晰，分辨率更高。
以上所述之具体实施方式为本发明的较佳实施方式，并非以此限定本发明的具体实施范围，本发明的范围包括并不限于本具体实施方式，凡依照本发明所作的等效变化均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物；
S2：对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位；
S3：荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物；
S4：利用筛选过的定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹；
S5：基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正，
步骤S2中，所述荧光基准标记物定位的方法为：
使用定位算法对荧光基准标记物和生物样品中的荧光分子进行定位；再通过聚类算法将每一个荧光基准标记物在成像序列中的定位位置序列归成一簇；获取每一个荧光基准标记物的定位序列，
步骤S3中，所述荧光基准标记物筛选的具体方法为：
S301：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹值取平均，作为初始漂移轨迹；
S302：利用初始漂移轨迹对成像视场中的荧光基准标记物做漂移矫正，并利用矫正之后的荧光基准标记物坐标计算均方距离或者平均距离；
S303：筛选所述均方距离或者平均距离小于设定值的荧光基准标记物，作为定位荧光基准标记物。
2.根据权利要求1所述的基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，其特征在于：步骤S1中，所述荧光基准标记物通过固定技术固定在盖玻片上，或者固定到需要成像的生物样品内部，所述固定技术包括：非共价键的吸附、共价键结合或者用链亲和素的亲和捕获。
3.根据权利要求1所述的基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，其特征在于：在步骤S301执行前，还包括误差抑制步骤：通过平滑算法抑制所述荧光基准标记物的定位位置计算误差。
4.根据权利要求1所述的基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，其特征在于：步骤S302中，所述均方距离或者平均距离的计算公式为：
、/>，其中，/>为均方距离，/>为平均距离，/>为时间间隔，/>为整个成像序列中时间窗口为/>的所有可能组合，/>，/>为时间节点/>的定位位置。
5.一种成像方法，其特征在于：所述成像方法采用权利要求1-4任一项所述的基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法。
6.根据权利要求5所述的成像方法，其特征在于：所述成像方法借助单分子定位实现超越衍射极限分辨率的成像，所述成像方法包括：随机光学重建显微镜成像技术及其各种技术衍化、光激活定位显微镜成像技术及其各种技术衍化、DNA点积累定位成像技术。
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