CN109523577A - 基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法 - Google Patents

基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，包括：(1)获取亚细胞结构的时间序列图像；(2)对获取的图像进行高斯滤波去噪；(3)采用局部最大值算法检测去噪后图像中的亚细胞结构质心；(4)根据亚细胞结构的运动速度、运动方向、运动趋势以及相机成像速率设计扇形滤波器；(5)根据扇形滤波器和图像中亚细胞结构质心，计算亚细胞结构候选点的匹配概率；(6)对当前帧图像中的每个候选点，寻找从当前帧开始的后续m帧图像中的所有可能候选点的全连接方式，计算每种m帧连续轨迹的平均匹配概率；(7)选取当前帧图像中全局平均匹配概率最大的候选点作为轨迹点，将此轨迹点连接到目标亚细胞结构的运动轨迹。

Description

基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法
技术领域
本发明涉及生物图像处理领域，具体涉及一种基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法。
背景技术
细胞内很多至关重要的生命活动都是在细胞膜表面完成的，如信号传导，蛋白质转运和病原体入侵等。因而，对细胞膜表面浅层亚细胞结构的记录分析对于生物化学和细胞生物学的研究来说，具有极其重要的意义。
随着如全内反射荧光显微镜(TIRFM)、结构光照明显微镜(SIM)、受激发射损耗荧光显微镜(STED)等超高分辨光学显微镜技术的发展，人们可以利用前所未有的时空分辨来观察细胞内复杂的生命状态和活动，甚至实时拍摄大量时间序列图像来研究细胞内部复杂的动态过程，从而为人类生理健康的研究做出科学的分析和指导性建议。
单粒子追踪技术是处理图像序列并定量分析粒子动态过程的关键技术。将传统的追踪算法分为是否采用了概率模型两大类。其中，基于概率模型的追踪算法，需要一些和目标运动状态相关的先验知识，如目标的运动方向，运动速度以及运动趋势等。基于这些先验知识设计各种粒子滤波器；然后用这些滤波器来筛选每一根轨迹线在下一帧图像中可能出现的位置点；最后再根据他们自己定义的匹配原则，来计算每一个候选点的匹配概率并完成轨迹线连接。因此，这些滤波器更适用于目标的运动趋势可预估的场景。而非概率模型的追踪算法，缺乏先验知识的约束，更多考虑的是图像上的特征因而更适用于目标的运动趋势比较随机的场景。
虽然经典追踪算法在性能上各有所长，但它们都存在一个共通的问题，就是容易在轨迹交叉处出现失误，造成这种失误的原因为：一是在轨迹交叉所产生的点重叠处缺乏点补偿，二是缺乏或者采用了并不是很合适的滤波器。
缺乏点重叠处的点补偿，会造成软件在点检测步骤中，对这个重叠位置只能检测到一个，并在后续的轨迹线连接中根据自身算法的原则优先匹配给交叉轨迹线其中的一根。那么剩余的几根轨迹线在当前位置找不到候选点，就容易被判断成轨迹线终止。再等点从重叠状态重新分为多个点后，又会重新生成新的轨迹线。整体来看，缺乏点补偿会导致轨迹线断裂，进而极大地增加轨迹线数量。即对于目标点来说缺乏了完整的轨迹线信息。
当缺乏有效的运动预测，极有可能将多个目标点的轨迹线错误拼接，导致后续的轨迹线定量信息完全失去意义。
发明内容
为减小轨迹线断裂的次数，以提高亚细胞结构的运动轨迹追踪的准确度，本发明提供一种基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法。
本发明的技术方案为：
一种基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，包括以下步骤：
(1)采用超高分辨光学显微镜获取亚细胞结构的时间序列图像；
(2)采用两个高斯核不同的高斯滤波器对所有图像进行过滤处理后，利用大高斯核的高斯滤波器处理后的图像减去小高斯核的高斯滤波器处理后的图像，获取去噪后的图像；
(3)采用局部最大值算法检测去噪后图像中的亚细胞结构，以确定每个亚细胞结构质心在所有图像中的位置；
(4)根据亚细胞结构的运动速度、运动方向、运动趋势以及相机成像速率设计扇形滤波器；
(5)针对经步骤(3)处理后的每帧图像，在当前帧图像中确定扇形滤波器的位置，使得扇形滤波器的顶点与已经确定的目标亚细胞结构运动轨迹的最后轨迹点重合，扇形滤波器的中心线与运动轨迹的生长趋势重合，则扇形滤波器内的所有亚细胞结构质心为目标亚细胞结构运动轨迹的候选点，每个候选点与扇形滤波器的中心线形成一个子扇形，然后，根据子扇形和扇形滤波器的关系，计算每个候选点的匹配概率；
(6)对当前帧图像中的每个候选点，寻找从当前帧开始的后续m帧图像中的所有可能候选点的全连接方式，计算每种m帧连续轨迹中的平均匹配概率作为每个候选点的全局平均匹配概率，不存在候选点的连接方式中用0代替匹配概率值；
(7)选取当前帧图像中全局平均匹配概率最大的候选点作为目标亚细胞结构的轨迹点，将此轨迹点连接到目标亚细胞结构的运动轨迹中。
该亚细胞结构运动轨迹确定方法中，采用两个高斯滤波器对图像进行滤波，大大提高了图像的信噪比，为确定亚细胞结构质心位置奠定可靠基础，在此基础上，通过设计的扇形滤波器的限定亚细胞结构轨迹点的候选点，为确定亚细胞结构轨迹点奠定基础，同时，根据扇形滤波器内候选点的全局平均匹配概率确定最佳匹配候选点为轨迹点，以此建立目标亚细胞结构的运动轨迹。
优选地，步骤(2)中：
小高斯核的高斯滤波器的高斯函数的标准差
大高斯核的高斯滤波器的高斯函数的标准差
其中，d表示预估的目标亚细胞结构的直径。
超高分辨光学显微镜获得的时间序列图像是一些含有各种噪声的图像，这些图像中存在的噪声直接会影响目标亚细胞结构质心的检测精度，为此，本发明采用两个高斯斑大小不同的二维高斯滤波器对图像进行高斯滤波，然后以两个高斯滤波器处理后的图像之差作为去噪后图像，这样可以极大地提升图像的信噪比强化亚细胞结构在图像中的信号。这样在采用局部最大值算法对去噪后图像进行目标检测时，检测出来的亚细胞结构质心更加准确。
优选地，步骤(4)中：
任意两帧图像中同一亚细胞结构在图像上的运动距离，与该两帧图像的成像时间间隔之比，作为亚细胞结构的运动速度；
单位时间亚细胞结构的最大运动长度作为扇形滤波器的半径，以90°作为扇形的圆心角，建立扇形滤波器。
本发明中，建立的扇形滤波器用来筛选每条运动轨迹线在下一帧图像中的候选点，根据候选点与运动轨迹线的匹配概率来完成运动轨迹线的连接。具体地，扇形滤波器是一个扇形区域，将该扇形投放到帧图像中，将扇形区域内的亚细胞结构质心作为目标亚细胞结构轨迹的候选点。扇形滤波器的半径与亚细胞结构的运动速度有关，以单位时间(秒)亚细胞结构的最大运动长度作为扇形滤波器的半径。本发明中，运动长度以像素点表示，即单位时间(秒)亚细胞结构经过的最长像素点个数作为扇形滤波器的半径。
以单位时间(秒)亚细胞结构经过的最长像素点个数作为扇形滤波器的半径，这样可以获取到亚细胞结构尽可能是每秒亚细胞结构的运动轨迹点，以精准地确定亚细胞结构的运动轨迹。
优选地，根据扇形滤波器的形态(半径和圆心角)和子扇形的形态计算形成子扇形的候选点的匹配概率，即具体为：步骤(5)中：
利用公式(1)计算每个候选点的匹配概率：
其中，S，R和θmax分别表示扇形滤波器的面积、半径以及圆心角的一半；a，b和c是三个超参数，分别表示面积、半径以及圆心角对概率公式(1)的影响程度；分别表示子扇形的面积、半径以及圆心角的一半，n和k分别表示第n根轨迹线的第k个候选点。
上述超参数a，b和c的取值直接影响候选点的概率值，经大量实验研究，优选地，所述超参数a，b和c的取值分别为0.8～1，0.8～1，0.85～1。进一步地，为了简化公式(1)，所述超参数a，b和c的取值分别为1,1,1。
本发明中，当前帧中的候选点和后几帧图像中候选点会呈现一个轨迹趋势，根据后几帧图像中候选点的匹配概率计算当前帧中候选点的全局平均匹配概率，能够大大提升前帧中的候选点作为轨迹点的准确性。具体地，步骤(6)中：
针对当前帧中每个候选点，利用公式(2)计算候选点的全局平均匹配概率：
其中，表示候选点的全局平均匹配概率，Pi表示第i帧图像任意候选点的匹配概率，P0表示当前帧图像中任意候选点的匹配概率，P1，P2，…，Pm分别表示当前帧图像后的第1～m帧图像。
当确定多个目标亚细胞结构运动轨迹时，多个目标亚细胞结构在一张图像中形成的轨迹点会出现重叠的情况，为了防止因为轨迹点重叠造成某些目标亚细胞结构的运动轨迹中断，本发明在重叠处引入了点补偿策略，通过点补偿减少运动轨迹断裂的次数，以此提高亚细胞结构的运动轨迹追踪的准确度。
具体地，所述亚细胞结构运动轨迹确定方法还包括：
在当前帧中，若候选点L已经匹配给第一目标亚细胞结构，即连接到第一目标亚细胞结构的轨迹；
对于第二目标亚细胞结构的运动轨迹，在当前帧图像中被判定为终止时，执行以下步骤：
若在当前帧中除候选点L外的剩余候选点的全局平均匹配概率均小于概率阈值，则计算候选点L的全局平均匹配概率，当候选点L的全局平均匹配概率大于概率阈值时，说明候选点L同样是第二目标亚细胞结构的轨迹点，同时将候选点L连接到第二目标亚细胞结构的运动轨迹。
利用预先设定的概率阈值判断某一目标亚细胞结构的最佳候选点是否为已经匹配给其他目标亚细胞结构，并根据该概率阈值，最终确定已经匹配给其他目标亚细胞结构的候选点是否为该目标亚细胞结构的最佳候选点，因此，在点补偿策略中，概率阈值的选取对轨迹点的准确性起到至关重要的作用，因此，经大量实验验证，优选地，所述概率阈值为0.6～0.8，进一步地，所述概率阈值为0.7。
相比于现有的亚细胞结构运动轨迹预测方法，本发明提供的亚细胞结构运动轨迹确定方法具有以下有益效果：
(1)利用本发明建立的扇形滤波器来筛选轨迹线在帧图像中的候选点，极大地减少了候选点的个数并提升了候选点的检测准确率。
(2)在轨迹线交叉造成的点重叠处，创新性地引入了一个点补偿策略，减少了轨迹线断裂的可能性，确保了轨迹线的完整确定。
(3)利用全局平均匹配概率最大原则，用到了多帧图像数据来做轨迹线连接，进一步确保了轨迹线连接的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1是实施例提供的亚细胞结构运动轨迹确定方法的流程示意图；
图2是实施例提供的扇形滤波器的模拟追踪示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
为解决传统亚细胞结构(如囊泡、蛋白)运动轨迹预测方法存在预测不准确的问题，本实施例通过设计的扇形滤波器和点补偿策略，成功地提升了亚细胞结构运动轨迹的准确性。具体地，本实施例提供的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法包括以下步骤：
S101，采用超高分辨光学显微镜获取亚细胞结构的时间序列图像。
本实施例中，采用的超高分辨光学显微镜可以为TIRFM、SIM以及STED，成像速率为5帧/秒。
S102，对获取的时间序列图像进行高斯滤波，获得去噪后的图像。
由于在荧光显微成像中，点目标成像的效果类似于高斯斑，因此，本实施例中采用符合目标样本大小特征的二维高斯滤波器对图像进行滤波以突出图像中的高斯斑质心区域，弱化背景区域。
具体地，采用两个高斯核不同的高斯滤波器对所有图像进行过滤处理后，利用高斯函数的标准差的高斯滤波器处理后的图像减去高斯函数的标准差的高斯滤波器处理后的图像，获取去噪后的图像，其中，d表示预估的目标亚细胞结构的直径，本实施例中，d取值为6个像素点。这样能够极大提升图像的信噪比，为S103中进行亚细胞结构质心检测奠定稳定的数据基础。
S103，采用局部最大值算法检测去噪后图像中的亚细胞结构，以确定每个亚细胞结构质心在所有图像中的位置。
在获得信噪比较高的图像后，利用局部最大值算法对图像进行亚细胞结构质心检测，能够准确清楚地获得亚细胞结构质心在图像中的位置。
S104，根据亚细胞结构的运动速度、运动方向、运动趋势以及相机成像速率设计扇形滤波器。
扇形滤波器的设计目的主要是为利用超高分辨光学显微镜做活细胞中亚细胞结构的轨迹线追踪及轨迹线定量分析而准备的(如细胞中定向运动的囊泡的轨迹线分析)。因而，它是根据真实的活细胞中囊泡的运动速度，以及实验室条件下全内反射荧光显微镜成像系统的拍照效果及拍照速度来设计的。
具体地，扇形滤波器的确定方法为：任意两帧图像中同一亚细胞结构在图像上的运动距离，与该两帧图像的成像时间间隔之比，作为亚细胞结构的运动速度；
单位时间亚细胞结构的最大运动长度作为扇形滤波器的半径，以90°作为扇形的圆心角，建立扇形滤波器。
本实施例中，经分析，亚细胞结构的运动速度为2微米/秒左右，帧图像中，每个像素的真实尺寸为133纳米，相机成像速率如果按5Hz/s拍摄的话，换算后，亚细胞结构在帧间的运动速度最多为3像素/秒。此外，考虑到定向运动的亚细胞结构其运动趋势固定，因而轨迹夹角有限。综合这些条件，本实施例设计的是半径为3个像素点，圆心角为90度的扇形滤波器。
S105，根据设计的扇形滤波器和图像中检测的亚细胞结构质心，计算亚细胞结构候选点的匹配概率。
图2为实施例提供的扇形滤波器的模拟追踪示意图。图2中，黑色点线是由前n-1帧图像确定下的运动轨迹线。第n帧图像中的所有的灰色点是S103中检测获得的亚细胞结构质心,。为了确定这根轨迹线在第n帧图像中的位置。首先由轨迹线的最后几个点，确定了轨迹线的生长趋势，从而也就确定了扇形滤波器的放置位置，即图2中的扇形滤波器的中心线和轨迹线的生长趋势重合，扇形滤波器的顶点和轨迹线的最后一个点重合。这个扇形滤波器内部的所有点即为轨迹线在第n帧图像中的候选点，即图中点L1，L2，L3和L4。图2中，每个候选点和扇形滤波器的中心线即可组成一个子扇形，如图中点L1，L2，L3和L4形成的子扇形。
在确定扇形滤波器位置和尺寸、子扇形后，利用公式(1)计算每个候选点的匹配概率：
本实施例中，超参数a，b和c的取值分别为1,1,1，并将扇形面积根据扇形面积公式用半径和角度替换后，公式(1)简化为：
本实施例中，R和θmax取值为3个像素和45°。
S106，根据当前帧后的m帧图像中候选点的匹配概率，计算当前帧图像中每个候选点的全局平均匹配概率。
具体地，利用公式(3)计算当前帧图像中候选点的全局平均匹配概率：
其中，表示候选点的全局平均匹配概率，Pi表示第i帧图像任意候选点的匹配概率，P0表示当前帧图像中任意候选点的匹配概率，P1，P2，…，Pm分别表示当前帧图像后的第1～m帧图像。
利用后几帧图像中候选点的匹配概率计算当前帧中候选点的全局平均匹配概率，能够大大提升前帧中的候选点作为轨迹点的准确性。
S107，选取当前帧图像中全局平均匹配概率最大的候选点作为目标亚细胞结构的轨迹点，将此轨迹点连接到目标亚细胞结构的运动轨迹。
在上述亚细胞结构运动轨迹确定方法的基础上，为了防止因为轨迹点重叠造成某些目标亚细胞结构的运动轨迹中断，本发明在重叠处引入了点补偿策略，通过点补偿减少运动轨迹断裂的次数，以此提高亚细胞结构的运动轨迹追踪的准确度。具体地，所述亚细胞结构运动轨迹确定方法还包括：
在当前帧中，若候选点L已经匹配给第一目标亚细胞结构，即连接到第一目标亚细胞结构的轨迹；
对于第二目标亚细胞结构的运动轨迹，在当前帧图像中被判定为终止时，执行以下步骤：
若在当前帧中除候选点L外的剩余候选点的全局平均匹配概率均小于概率阈值，则计算候选点L的全局平均匹配概率，当候选点L的全局平均匹配概率大于概率阈值时，说明候选点L同样是第二目标亚细胞结构的轨迹点，同时将候选点L连接到第二目标亚细胞结构的运动轨迹。
在本实施例中，概率阈值取值为0.7，该概率阈值会提升候选点作为轨迹点的准确性。
基于上述，本实施例提供的亚细胞结构运动轨迹确定方法的优点在于：本实施例提供的扇形滤波器来筛选轨迹线在下一帧图像中的候选点，极大地减少了候选点的个数并提升了候选点的检测准确率；在重叠处创新性地引入了一个点补偿的原则，减少了轨迹线断裂的可能性，确保了轨迹线的完整提取；利用全局平均匹配概率最大原则，用到了多帧图像数据来做轨迹线连接，进一步确保了轨迹线连接的准确性。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，包括以下步骤：
(1)采用超高分辨光学显微镜获取亚细胞结构的时间序列图像；
(2)采用两个高斯半径不同的高斯滤波器对所有图像进行滤波处理后，利用大高斯核滤波器处理后的图像减去小高斯核的高斯滤波器处理后的图像，获取去噪后的图像；
(3)采用局部最大值算法检测去噪后图像中的亚细胞结构，以确定每个亚细胞结构质心在所有图像中的位置；
(4)根据亚细胞结构的运动速度、运动方向、运动趋势以及相机成像速率设计扇形滤波器；
(5)针对经步骤(3)处理后的每帧图像，在当前帧图像中确定扇形滤波器的位置，使得扇形滤波器的顶点与已经确定的目标亚细胞结构运动轨迹的最后轨迹点重合，扇形滤波器的中心线与运动轨迹的生长趋势重合，则扇形滤波器内的所有亚细胞结构质心点为目标亚细胞结构运动轨迹的候选点，每个候选点与扇形滤波器的中心线形成一个子扇形，然后，根据子扇形和扇形滤波器的关系，计算每个候选点的匹配概率；
(6)对当前帧图像中的每个候选点，寻找从当前帧开始的后续m帧图像中的所有可能候选点的全连接方式，计算每种m帧连续轨迹中的平均匹配概率作为每个候选点的全局平均匹配概率，不存在候选点的连接方式中用0代替匹配概率值；
(7)选取当前帧图像中全局平均匹配概率最大的候选点作为目标亚细胞结构的轨迹点，将此轨迹点连接到目标亚细胞结构的运动轨迹中。
2.如权利要求1所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，步骤(2)中：
小高斯核的高斯滤波器的高斯函数的标准差
大高斯核的高斯滤波器的高斯函数的标准差
其中，d表示预估的目标亚细胞结构的直径。
3.如权利要求1所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，步骤(4)中：
任意两帧图像中同一亚细胞结构在图像上的运动距离，与该两帧图像的成像时间间隔之比，作为亚细胞结构的运动速度；
单位时间亚细胞结构的最大运动长度作为扇形滤波器的半径，以90°作为扇形的圆心角，建立扇形滤波器。
4.如权利要求1所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，步骤(5)中：
利用公式(1)计算每个候选点的匹配概率：
其中，S，R和θmax分别表示扇形滤波器的面积、半径以及圆心角的一半；a，b和c是三个超参数，分别表示面积、半径以及圆心角对概率公式(1)的影响程度；分别表示子扇形的面积、半径以及圆心角的一半，n和k表示第n根轨迹线的第k个候选点。
5.如权利要求1所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，步骤(6)中：
针对当前帧中每个候选点，利用公式(2)计算候选点的全局平均匹配概率：
其中，表示候选点的全局平均匹配概率，Pi表示第i帧图像任意候选点的连接匹配概率，P0表示当前帧图像中任意候选点的匹配概率，P1，P2，…，Pm分别表示当前帧图像后的第1～m帧图像。
6.如权利要求1～5任一项所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，所述亚细胞结构运动轨迹确定方法还包括：
在当前帧中，若候选点L已经匹配给第一目标亚细胞结构，即连接到第一目标亚细胞结构的轨迹；
对于第二目标亚细胞结构的运动轨迹，在当前帧图像中被判定为终止时，执行以下步骤：
若在当前帧中除候选点L外的剩余候选点的全局平均匹配概率均小于概率阈值，则计算候选点L的全局平均匹配概率，当候选点L的全局平均匹配概率大于概率阈值时，说明候选点L同样是第二目标亚细胞结构的轨迹点，同时将候选点L连接到第二目标亚细胞结构的运动轨迹。
7.如权利要求6所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，所述概率阈值为0.6～0.8。
8.如权利要求4所述的基于显微图像的亚细胞结构运动轨迹确定方法，其特征在于，所述超参数a，b和c的取值分别为0.8～1，0.8～1，0.85～1。
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