CN116162647A - 一种延迟水稻抽穗期的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种延迟水稻抽穗期的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过全基因组关联分析挖掘调控水稻抽穗期的潜在候选基因，鉴定得到1个新的稳定的抽穗期数量性状基因座，命名为qHD2‑1。利用转录组数据对该区间上下游基因进行组织表达模式分析，鉴定得到OsMADS57作为候选基因进行表型分析。进一步实验获得OsMADS57基因的T‑DNA插入突变体；通过提取基因组DNA，利用PCR进行鉴定得到T‑DNA插入纯和突变株系，其抽穗期相比对照延迟了6天，统计分析表明差异显著。本发明为改造和调节水稻抽穗期，提供了有效技术手段，具有重要应用价值。

Description

一种延迟水稻抽穗期的方法
技术领域
本发明属于生物技术育种领域，更具体地说，涉及一种延迟水稻抽穗期的方法。
背景技术
水稻是我国的主要粮食作物，对保障国家粮食安全发挥着决定性的作用。开花时间是水稻由营养生长阶段向生殖生长阶段转换的标志。水稻的开花时间早晚通过其抽穗来衡量，也表述为抽穗期。抽穗期是水稻的一个重要农艺性状，也是水稻品种选育的重要指标。水稻的抽穗期决定了品种的种植区域性以及季节适应性，也极大影响其产量和品质，进而影响生产效益和经济效益。因此，开展水稻抽穗期相关基因的研究具有重要的意义。
近年来，关于水稻抽穗期调控基因的挖掘及其作用机理的解析等研究，取得了重要进展。但挖掘新的调控水稻抽穗期的基因，利用现代生物技术手段改造和调节水稻抽穗期，创制不同生育期的水稻种质资源，指导适应特定区域成熟期不同的水稻品种选育，提高水稻的适应性和产量，具有重要的理论和实践意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种延迟水稻抽穗期的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，敲除或沉默水稻中OsMADS57基因。
所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述敲除或沉默水稻中OsMADS57基因的具体方法为以下任一种：
1)通过基因同源重组敲除OsMADS57基因；
2)插入突变敲除OsMADS57基因；
3)RNA干扰沉默OsMADS57基因；
4)CRISPR/Cas9敲除OsMADS57基因。
进一步地，所述插入突变敲除基因具体为T-DNA插入突变。
进一步地，所述T-DNA插入突变具体包括以下步骤：
1)构建含有目的基因的Ti质粒并转化农杆菌；
2)将农杆菌转化水稻组织或细胞，然后进行培养获得T-DNA突变水稻群体；
3)筛选得到osmads57突变体，即为抽穗期延迟的水稻株系。
进一步地，所述步骤3)具体为：通过提取基因组DNA，利用PCR进行鉴定得到突变株系；或，对突变株系提取总RNA，经反转录后利用qPCR进行转录水平鉴定获得osmads57突变体。
进一步地，所述的用于osmads57突变体DNA水平鉴定的引物序列具体为：
LP：TGACTTGGTTGACACGGTTG
RP：TTCGCCTTCTCTCCACTCTC
RB：AACGCTGATCAATTCCACAG。
进一步地，所述的用于osmads57突变体RNA水平鉴定的引物序列具体为：
RTF：GGGGAAGATAGTGATAAGG
RTR：TTCAAGACTAGGAGGCATA。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本申请通过使用来自3000水稻基因组计划中的276份水稻种质和与之对应的497K单核苷酸多态性标记进行全基因组关联分析挖掘调控水稻抽穗期的潜在候选基因，鉴定得到1个新的稳定的抽穗期数量性状基因座，命名为qHD2-1。利用转录组数据对该区间上下游基因进行组织表达模式分析，鉴定得到OsMADS57作为候选基因进行表型分析。获得OsMADS57基因的T-DNA插入突变体；通过提取基因组DNA，利用PCR进行鉴定得到T-DNA插入纯和突变株系；对纯和突变体提取总RNA，经反转录后利用qPCR进行转录水平鉴定osmads57突变体；对OsMADS57突变体抽穗期表型进行鉴定，证实OsMADS57纯合突变株系的水稻抽穗期相比对照延迟了6天，统计分析表明差异显著。本发明为改造和调节水稻抽穗期，创制不同生育期的水稻种质资源，指导适应特定区域成熟期不同的水稻品种选育以及提高水稻的适应性和产量提供了有效技术手段，具有重要应用价值。
附图说明
图1为水稻抽穗期全基因组关联分析结果图；
图2为qHD2-1候选基因OsMADS57的突变体鉴定结果图；
图3为osmads57突变体在试验田条件下的抽穗期表型观察及统计结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规办法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1、全基因组关联分析定位水稻抽穗期关键位点
通过使用来自3000水稻基因组计划(3,000Rice Genomes project，3K-RG)中的276份水稻种质和与之对应的497K单核苷酸多态性标记进行全基因组关联分析挖掘调控水稻抽穗期的潜在候选基因。基于该水稻群体抽穗期表型数据，选用FaST-LMM模型进行全基因组关联分析，在2号染色体鉴定得到1个新的稳定的抽穗期数量性状基因座(Quantitative trait locus，QTL)，并命名为qHD2-1。利用转录组数据对该区间上下游基因进行组织表达模式分析(http：//bar.utoronto.ca//efp_rice/cgi-bin/efpWeb.cgi)，鉴定得到LOC_Os02g49840(OsMADS57)在抽穗期高量表达，因此OsMADS57作为候选基因进行表型分析。
2、OsMADS57的突变体鉴定
获得OsMADS57基因的T-DNA插入突变体(PFG_3A-15619.R)，插入位置位于第1个外显子上(图2A)。通过提取基因组DNA，利用PCR进行鉴定得到T-DNA插入纯和突变株系(图2B)。对纯和突变体提取总RNA，经反转录后利用qPCR进行转录水平鉴定。结果显示，与野生型相比，osmads57突变体转录水平完全缺失(图2C)，说明osmads57突变体为OsMADS57基因功能完全缺失突变体。
用于osmads57突变体DNA水平鉴定的引物序列：
LP：TGACTTGGTTGACACGGTTG
RP：TTCGCCTTCTCTCCACTCTC
RB：AACGCTGATCAATTCCACAG
用于osmads57突变体RNA水平鉴定的引物序列：
RTF：GGGGAAGATAGTGATAAGG
RTR：TTCAAGACTAGGAGGCATA
A，OsMADS57基因的T-DNA插入突变体插入位置；B，osmads57突变体DNA水平鉴定结果；C，osmads57突变体RNA水平鉴定结果。
3、qHD2-1候选基因OsMADS57突变体抽穗期表型鉴定
2021年和2022年分别将上述纯合突变体植株osmads57与对照植株Dongjin同时种植于淮阴师范学院生物科技园试验田(119°01′E/33°36′N)，并对上述材料进行了抽穗期表型观察和数据统计，统计株系数量≥20株。首先，2021年和2022年Dongjin和突变体osmads57抽穗时间重复性良好。Dongjin大约84天左右(平均84.25天)抽穗，与Dongjin对照相比，osmads57突变体90天左右(平均90.42天)抽穗，抽穗时间明显延迟6天。经t检验，突变体与对照抽穗时间差异显著(图3)。

Claims (7)

1.一种延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，敲除或沉默水稻中OsMADS57基因。
2.根据权利要求1所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述敲除或沉默水稻中OsMADS57基因的具体方法为以下任一种：
1)通过基因同源重组敲除OsMADS57基因；
2)插入突变敲除OsMADS57基因；
3)RNA干扰沉默OsMADS57基因；
4)CRISPR/Cas9敲除OsMADS57基因。
3.根据权利要求2所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述插入突变敲除基因具体为T-DNA插入突变。
4.根据权利要求3所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)构建含有目的基因的Ti质粒并转化农杆菌；
2)将农杆菌转化水稻组织或细胞，然后进行培养获得T-DNA突变水稻群体；
3)筛选得到osmads57突变体，即为抽穗期延迟的水稻株系。
5.根据权利要求4所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：通过提取基因组DNA，利用PCR进行鉴定得到突变株系；或，对突变株系提取总RNA，经反转录后利用qPCR进行转录水平鉴定获得osmads57突变体。
6.根据权利要求5所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述的用于osmads57突变体DNA水平鉴定的引物序列具体为：
LP：TGACTTGGTTGACACGGTTG
RP：TTCGCCTTCTCTCCACTCTC
RB：AACGCTGATCAATTCCACAG。
7.根据权利要求1或2所述的延迟水稻抽穗期的方法，其特征在于，所述的用于osmads57突变体RNA水平鉴定的引物序列具体为：
RTF：GGGGAAGATAGTGATAAGG
RTR：TTCAAGACTAGGAGGCATA。
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