CN116158431A - 一种增强植物抗病性的小分子挥发物及其应用 - Google Patents

一种增强植物抗病性的小分子挥发物及其应用 Download PDF

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CN116158431A CN202211493900.5A CN202211493900A CN116158431A CN 116158431 A CN116158431 A CN 116158431A CN 202211493900 A CN202211493900 A CN 202211493900A CN 116158431 A CN116158431 A CN 116158431A
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贺丹霞
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Abstract

本发明涉及一种增强植物抗病性的小分子挥发物及其应用，具体地，本发明提供一种式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于增强植物对病原菌的抗性；或制备组合物或制剂，所述制剂或组合物用于增强植物对病原菌的抗性。本发明还首次发现，式I化合物通过激活植物本身的免疫响应来增强植物对病原菌的抗性，对植物以及病原菌的正常生长无影响。

Description

一种增强植物抗病性的小分子挥发物及其应用
技术领域
本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及一种增强植物抗病性的小分子挥发物及其应用。
背景技术
植物病原菌的侵染对农业的生产应用产生了重要的负面影响，为了促进植物生长或提高植物抗病性能，往往使用农用化合物来辅助解决问题。然而，这些农用化合物往往会造成一定程度的环境污染。
以稻瘟病为例，农业病原菌胁迫问题极大地影响到农业生产。已发现，使用某些根际促生菌(PGPRs)可以帮助解决生物和非生物胁迫下植物生长效率的有效方法之一。
根际促生菌释放的小分子挥发物会做为重要的信号分子可以诱导多种植物响应，比如2，3-丁二酮在低磷条件下诱导植物的免疫响应等。然而，目前其他许多根际促生菌的特性、以及其在植物中应对胁迫的响应机制仍不清楚，或者对抗逆性能的改善程度有限。
因此，本领域迫切需要开发能够显著增强植物抗病胁迫能力，抗非生物胁迫能力和/或显著提高植物生长性能的菌株或者其释放的小分子挥发物或者其分泌的代谢物或农用制剂。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够显著增强植物抗病胁迫能力，抗非生物胁迫能力和/或显著提高植物生长性能的菌株或者其释放的小分子挥发物或者其分泌的代谢物或农用制剂。
本发明的第一方面提供了一种式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于增强植物对病原菌的抗性；或制备一组合物或制剂，所述制剂或组合物用于增强植物对病原菌的抗性，所述式I化合物的结构如下所示：
Figure BDA0003964738610000021
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
在另一优选例中，所述的卤素包括F、Cl、Br或I。
在另一优选例中，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic结构：
Figure BDA0003964738610000022
式中，R1、R2、R3的定义如上所述。
在另一优选例中，R1为H、氨基、或-OH。
在另一优选例中，R2为H、氨基、或-OH。
在另一优选例中，R1为氨基。
在另一优选例中，R2为氨基。
在另一优选例中，R3为-N(Ra)2或取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的取代基所取代：氨基，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
在另一优选例中，R3为取代的甲基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的取代基所取代：氨基。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
Figure BDA0003964738610000023
在另一优选例中，通过激活植物本身的免疫响应来增强植物对病原菌的抗性。
在另一优选例中，所述病原菌包括农业病原菌，比如植物病原菌。
在另一优选例中，所述病原菌包括番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringaepv.Tomato)。
在另一优选例中，所述病原菌选自下组：Pseudomonas syringae pv.TomatoDC3000(Pto DC3000)、Pseudomonas syringae pv.Actinidiae ICMP9617(Pac ICMP9617)、Pseudomonas aeruginosa(CGMCC号：1.15148)、或其组合。
在另一优选例中，所述式I化合物来源于根际促生菌，如Psudomonas aeruginosasp.、Paenibacillus alvei或Streptomyces或来源于葡萄和蜜蜂。
在另一优选例中，所述的组合物为农用组合物。
在另一优选例中，所述组合物包含(a)式I化合物；和(b)农学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他用于增强植物对病原菌的抗性的物质。
在另一优选例中，所述其他用于增强植物对病原菌的抗性的物质包括：flg22、elf18、Chitin、无毒蛋白如Avrpto。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物包括农业植物、园艺植物、林业植物。
在另一优选例中，所述的植物包括木本植物、草本植物。
在另一优选例中，所述植物包括茄科、十字花科、禾本科、豆科、芭蕉科、香蕉科、藜科、百合科。
在另一优选例中，所述植物包括茄属、稻属、烟草属、拟南芥属、辣椒属、油菜属、苜蓿属。
在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、水稻、油菜、番茄、烟草、辣椒、油菜、苜蓿。
本发明第二方面提供了一种组合物，包括：
(i)式I化合物；
(ii)其他用于增强植物对病原菌的抗性的物质；
(iii)农学上可接受的载体；
所述式I化合物的结构如下所示：
Figure BDA0003964738610000041
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述组合物包括抗菌剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(a)，以所述组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(b)，以所述组合物的总重量计。
在另一优选例中，组分(a)在农用组合物中的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.001-90wt％，更佳地，0.01-50％。
在另一优选例中，组分(a)在农用组合物中的浓度为5-800μM，较佳地，20-400μM，更佳地，50-200μM。
在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。
在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述其他用于增强植物对病原菌的抗性的物质包括：flg22、elf18、Chitin、无毒蛋白如Avrpto。
本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的组合物的用途，用于增强植物对病原菌的抗性。
本发明第四方面提供了一种增强植物对病原菌的抗性的方法，包括步骤：
给所述植物施用式I化合物，或施用本发明第二方面所述的组合物，所述式I化合物的结构如下所示：
Figure BDA0003964738610000051
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
在另一优选例中，所述的施用选自下组：喷洒、浇灌、滴灌、喷雾、包被、注射或本领域的普通技术人员已知的其他方法。
在另一优选例中，所述的施用可一次性施用、重复施用或连续施用。
在另一优选例中，所述的施用方法为施用于植物、或围绕植物的土壤中。
在另一优选例中，所述施用的剂量为0.01-5μmol/株，较佳地，0.1-3μmol/株，更佳地，0.4-2μmol/株。
在另一优选例中，所述施用的剂量为1-800μM/株，较佳地，10-400μM/株，更佳地，50-200μM/株。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了2’-氨基苯乙酮帮助拟南芥对抗病原菌Pseudomonas syringaepv.Tomato DC3000的入侵。其中，[A]2’-氨基苯乙酮帮助拟南芥抵御病原菌DC3000的表型。n＝12，白色标尺表示1cm。[B]病原菌的定殖定量结果。n>12，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.05表示差异显著性。三次独立的实验验证同样的结果。
图2显示了2’-氨基苯乙酮不影响植物的正常生长和病原菌的正常生长。其中，[A]2’-氨基苯乙酮处理5天大的拟南芥苗，7天之后的植物侧根的数量。n>7，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.01表示差异极显著性，***表示p<0.001。[B]2’-氨基苯乙酮处理5天大的拟南芥苗，7天之后的植物叶片表面积。n>7，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.05表示差异显著性，ns表示没有显著差异。[C]2’-氨基苯乙酮处理5天大的拟南芥苗，7天之后的植物主根的长度。n＝7，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.05表示差异显著性，ns表示没有显著差异。[D]2’-氨基苯乙酮处理DC3000，在不同的时间点，测定DC3000的OD值，检测2’-氨基苯乙酮对DC3000生长速度的影响。误差线表示的是4个生物学重复的标准差，3次独立的实验验证了同样的结果。
图3显示了2’-氨基苯乙酮帮助水稻对抗病原菌Pseudomonas syringaepv.Tomato DC3000的入侵。其中，[A]2’-氨基苯乙酮帮助水稻抵御病原菌DC3000的表型。n>12。[B]病原菌的定殖定量结果。n>12，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.01表示差异极显著性，***表示p<0.001。两次独立的实验验证同样的结果。
图4显示了2’-氨基苯乙酮帮助油菜对抗病原菌Pseudomonas syringaepv.Tomato DC3000的入侵。其中，[A]2’-氨基苯乙酮帮助油菜抵御病原菌DC3000的表型。n＝9。[B]病原菌的定殖定量结果。n>12，Student t-test用于检测样品之间的显著性，p<0.01表示差异极显著性，***表示p<0.001。两次独立的实验验证同样的结果。
图5：2’-氨基苯乙酮帮助拟南芥抵御铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosasp.(CGMCC 1.1514)的侵染。2’-氨基苯乙酮帮助拟南芥抵御病原菌Pseudomonasaeruginosa sp.的表型。2’-氨基苯乙酮的预处理和病原菌侵染处理同DC3000处理一致。n＝15，白色标尺表示2cm。[B]病原菌的定殖定量结果。n＝14，Student t-test用于检测样品之间的显著性，*表示p<0.05有显著差异。三次独立的实验验证同样的结果。
图6：2’-氨基苯乙酮的同分异构体2-氨基苯乙酮和4’-氨基苯乙酮帮助拟南芥抵御病原菌Pseudomonas syringae pv.Tomato DC3000的侵染。[A]100uL浓度为1mM化合物预处理拟南芥2天，对植物进行OD＝0.01的DC3000处理。两天后，收集样品进行病原菌的定殖分析，统计分析显示2-氨基苯乙酮可以显著的降低DC3000在拟南芥中的定殖量。n>24，one-way anova用于检测样品之间的显著性，**表示p<0.01。两次独立的实验验证相似的结果。[B]100uL浓度为1mM化合物预处理2天的拟南芥病原菌侵染后的定殖结果。n>24，one-wayanova用于检测样品之间的显著性，**表示p<0.01。两次独立的实验验证相似的结果。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，本发明人意外发现，式I化合物可有效增强植物对病原菌的抗性。并且，本发明人还意外的发现，式I化合物通过激活植物本身的免疫响应来增强植物对病原菌的抗性，对植物以及病原菌的正常生长无影响。在此基础上，发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“flg22”为一种鞭毛蛋白，是一段含有22个氨基酸的肽段。
如本文所用，术语“elf18”为细菌的翻译延伸因子，含有18个氨基酸的多肽。
如本文所用，术语“Chitin”为真菌细胞壁的组成成分，是甲壳素，又名几丁质。
如本文所用，术语“Avrpto”为病原菌分泌的一种能够诱导植物免疫的蛋白。
基团定义
如本文所用，术语“C1-C3烷基”是指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、或类似基团。
如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴、或碘。
本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物和纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明包括化合物的所有异构形式。
活性成分
如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明的式I化合物”可互换使用，都指来源于根际促生菌，如Psudomonas aeruginosa sp.或来源于葡萄和蜜蜂，具有增强植物对病原菌的抗性功能的活性成分。
在本发明中，本发明的活性成分具有式I所示的通式：
Figure BDA0003964738610000081
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
在另一优选例中，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic结构：
Figure BDA0003964738610000082
式中，R1、R2、R3的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
Figure BDA0003964738610000083
在另一优选例中，所述式I化合物、或其药学上可接受的盐为化学合成的或从根际促生菌中分离的。
2’-氨基苯乙酮作为重要的细菌释放的群体效应因子(quorum sensing，QS)，在指导细菌聚团，形成生物膜等方面起到了不可代替的作用。研究发现2’-氨基苯乙酮可以作为检测人类感染肺部病菌pseudomonas aeruginosa的标准，其含量的多少可以作为诊断疾病严重的重要标准。
2’-氨基苯乙酮除了在细菌中被报导可以有效的合成之外，在很多其他的物种中也被检测到，比如葡萄，酒粮，蚂蚁等。2’-氨基苯乙酮的分子量也很小，只有135.16道尔顿。商品化的2’-氨基苯乙酮呈现油状液体，有强烈的芳香味，挥发性强，价格低(平均每一毫升只需要约150元人民币)，易获得。2’-氨基苯乙酮可以作为食品添加剂增加食品的风味，比如葡萄酒，或者作为香料运用于香水中。
4’-氨基苯乙酮是氨基苯酮的一种无毒衍生物，可以用于制备氰化物的解毒剂。分子量为135.16道尔顿。商品化的4’-氨基苯乙酮呈现出一种淡黄色，有芳香味，固体，价格低(平均每克约为7元)。
2-氨基苯乙酮是一种天然的小分子挥发物产物，也是一种重要的化工产品制备的中间物，分子量为135.16道尔顿。商品化的2-氨基苯乙酮(2-氨基苯乙酮盐酸盐)是一种白色晶体，有淡淡的芳香味，水溶之后呈带黄色，价格相比较于2‘-氨基苯乙酮和4’-氨基苯乙酮稍高(平均每克约为600元)。
然而目前关于细菌小分子2’-氨基苯乙酮、4’-氨基苯乙酮、2-氨基苯乙酮在植物体中的研究尚不清楚。在本发明的一优选实施方式中，本发明以模式植物拟南芥为例，通过处理2’-氨基苯乙酮、4’-氨基苯乙酮、2-氨基苯乙酮发现，2’-氨基苯乙酮、4’-氨基苯乙酮、2-氨基苯乙酮均可以有效的帮助拟南芥抵御病原菌Pseudomonas syringae pv.TomatoDC3000的入侵，实现抗病。并且，这一发现在水稻以及油菜中通过处理2‘-氨基苯乙酮得到验证。
在本发明中，2’-氨基苯乙酮、4’-氨基苯乙酮、2-氨基苯乙酮均可在根际促生菌中发现，如2’-氨基苯乙酮可在Psudomonas aeruginosa sp.中检测到；4’-氨基苯乙酮可以在Paenibacillus alvei(T19)中检测到；2-氨基苯乙酮可以在Streptomyces中检测到。
农用组合物或制剂
可将本发明的活性物质(如式I化合物或其药学上可接受的盐)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。
这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性物质与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。
用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。
就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。
固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。
非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。
可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。
在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有式I化合物或其药学上可接受的盐作为增强植物对病原菌的抗性的活性成分；以及农业上可接受的载体。
如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。
本发明的农用制剂可与其他增强植物对病原菌的抗性的物质制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的增强植物对病原菌的抗性的物质包括(并不限于)：flg22(一种鞭毛蛋白，是一段含有22个氨基酸的肽段)、elf18(细菌的翻译延伸因子，含有18个氨基酸的多肽)、Chitin(真菌细胞壁的组成成分，甲壳素又名几丁质)、无毒蛋白如Avrpto(病原菌分泌的一种能够诱导植物免疫的蛋白)。
此外，本发明的农用制剂也可与增效剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些增效剂是提高活性物质作用的化合物，由于活性物质本身有活性，也可不必加增效剂。
本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂或溶液制剂。
本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的本发明的活性物质。商品制剂或使用剂型中的本发明的活性物质的浓度可在广阔的范围内变动。商品制剂或使用剂型中的本发明化合物的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与1％(g/v)之间。
增强植物对病原菌的抗性的方法
本发明提供了一种增强植物对病原菌的抗性的方法，包括步骤：给植物施用式I化合物或其药学上可接受的盐，或施用相应的农用组合物或制剂。
施用可采用已知的各种方法，例如，通过在植物叶片、繁殖材料上喷洒、喷雾、喷粉或播撒式I化合物或其药学上可接受的盐或含有式I化合物或其药学上可接受的盐的农用组合物或制剂，或以其他方式使植物接触式I化合物或其药学上可接受的盐或含有式I化合物或其药学上可接受的盐的农用制剂。
在一优选实施方式中，还可以通过喷洒(如飞机喷洒)或灌溉将式I化合物或其药学上可接受的盐或含有式I化合物或其药学上可接受的盐的农用组合物或制剂递送给所述植物。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，式I化合物或其药学上可接受的盐可有效增强植物对病原菌(尤其是番茄细菌性斑点病菌)的抗性。
(2)本发明人首次发现，式I化合物或其药学上可接受的盐通过激活植物本身的免疫响应来增强植物对病原菌的抗性，对植物以及病原菌的正常生长无影响。
(3)本发明的方法安全性高并且成本极低。
(4)本发明使用范围广泛，操作简单。
(5)本发明产品易获得。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
本实例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为本领域的常规手段和方法。所用的实验试剂盒耗材和试剂，若无特殊说明也均为本领域常规试剂和耗材，均可以在商业产品中购买获得。
以下实例涉及到的拟南芥型号为Col-0获自ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center)，水稻型号为Oryza sativa L.japonica，获自AmkhaSeed，油菜型号为Brassica napus L.，获自隆平高科(淘宝采购)，2’-氨基苯乙酮购自Sigma，纯度为>99％，4’-氨基苯乙酮、2-氨基苯乙酮购自Sigma，纯度为>99％。
Pseudomonas aeruginosa(CGMCC号：1.15148)购自保藏中心CGMCC，Pseudomonassyringae pv.Tomato DC3000(Pto DC3000)从参考文献：doi:10.15252/embj.2019102602中可以获得，Pseudomonas syringae pv.Actinidiae ICMP9617(Pac ICMP9617)从参考文献：10.5423/PPJ.NT.12.2017.0281中可以获得。
通用方法
1，植物生长
拟南芥生长在条件为:温度22℃,湿度:65％,光照强度:100umol/m2/s1光照周期为:10小时光照,14小时黑暗。拟南芥长到4-5周左右大小时,开始处理2’-氨基苯乙酮,之后注射或者喷洒DC3000菌液。
2，2’-氨基苯乙酮处理
配置母液浓度为100mM的2’-氨基苯乙酮水溶液,分装在不同的离心管中，用缝口膜封好，放在4度储存。稀释母液至终浓度为200μM，根据不同的实验目的和体系，施加适量体积的2’-氨基苯乙酮水溶液。土里的体系，需要对处理了2’-氨基苯乙酮的植物用保鲜膜封好，密闭2天，再处理病原菌。
3，DC3000的处理
DC3000使用50％的甘油保存在-80度。在新鲜的含有25ug/mL的LB板子上划线活化DC3000，培养温度为28度。用10mM的氯化镁溶液悬浮DC3000，测定稀释浓度在OD＝0.001～0.02，加入0.02％的表面活化剂，充分混匀，均匀的喷洒在植物叶片的表面。处理了DC3000的植物通过保鲜膜密闭6小时，取样记录0天和3天的DC3000的菌定殖效率。
4. 4’-氨基苯乙酮的处理
4’-氨基苯乙酮的处理方式同2’-氨基苯乙酮处理方式。准备水溶的100mM母液，分装在不同的PCR管中，每个管中加入100uL的母液储存在4度以备用。培养皿体系：5～6颗5-6天大的苗长在两分格培养皿中的一侧，100uL 1mM的4’-氨基苯乙酮加在培养基的另一侧，培养皿重新用不透气的封口膜包裹放回原来的生长箱。化合物处理48小时后，活化DC3000病原菌，调至OD为0.01的终浓度加入0.02％的表面活化剂SilwetL77，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，将病原菌处理之后的植物重新放回培养箱在指定的时间内取样进行细菌定殖检测。
5. 2-氨基苯乙酮的处理
2-氨基苯乙酮的处理方式同2’-氨基苯乙酮处理方式。准备水溶的100mM母液，分装在不同的PCR管中，每个管中加入100uL的母液储存在4度以备用。培养皿体系：5～6颗5-6天大的苗长在两分格培养皿中的一侧，100uL 1mM的2-氨基苯乙酮加在培养基的另一侧，培养皿重新用不透气的封口膜包裹放回原来的生长箱。化合物处理48小时后，活化DC3000病原菌，调至OD为0.01的终浓度加入0.02％的表面活化剂SilwetL77，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，将病原菌处理之后的植物重新放回培养箱在指定的时间内取样进行细菌定殖检测。
实施例1 2’-氨基苯乙酮增强拟南芥对病原菌DC3000的抵抗
将拟南芥培养在短日照的环境下，取4-5周大左右的健康的苗子用于处理2’-氨基苯乙酮和DC3000。配置终浓度为200μM的2’-氨基苯乙酮水溶液，浇灌50mL 2’-氨基苯乙酮水溶液到单个砵里(4-5颗苗种在一个砵里)，一组实验共6个砵，用到的苗子约为n>24株。对照组则加入等体积的水，将浇灌处理了苗子用保鲜膜密封好处理2天再开始DC3000的处理。活化DC3000病原菌，调至OD为0.2的终浓度加入0.02％的表面活化剂SilwetL77，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，并用保鲜膜包裹6小时后再揭膜。DC3000处理后第三天，取样做DC3000的定殖实验，平均每组样收集4个生物学重复，每个生物学重复收集来自4片不同的植物叶片小孔样本。第五天拍照记录下感病症状。定殖的实验表明，处理了2’-氨基苯乙酮的拟南芥DC3000的定殖量明显少于对照组，说明2’-氨基苯乙酮可以帮助拟南芥有效的抵御DC3000的入侵，见图1，A。感病的症状进一步验证了定殖实验的结果，表明2’-氨基苯乙酮处理的植物可以明显的减弱DC3000的侵染效率，对照组的植物呈现出更加枯黄，萎蔫的状态，而处理了2’-氨基苯乙酮的植物则表型出更加健康的状态，见图1，A，B。
实施例2 2’-氨基苯乙酮增强水稻对病原菌DC3000的抵抗
将水稻种子在培养土中萌芽并使其正常生长至苗高10cm左右。每个砵里种12株苗，对健康的幼苗处理2’-氨基苯乙酮和DC3000。配置终浓度为200μM的2’-氨基苯乙酮水溶液，浇灌50mL 2’-氨基苯乙酮水溶液到单个砵里，一组实验共6个砵，用到的苗子约为n>70株。对照组则加入等体积的水，将浇灌处理了苗子用保鲜膜密封好处理2天再开始DC3000的处理。活化DC3000病原菌，调至OD为0.2的终浓度加入0.02％的表面活化剂Si lwetL77，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，并用保鲜膜包裹6小时后再揭膜。第3-5天拍照记录下感病症状。水稻的感病症状表明2’-氨基苯乙酮处理的植物可以明显的减弱DC3000的侵染效率，对照组的植物呈现出更大面积的枯黄，萎蔫的状态，而处理了2’-氨基苯乙酮的植物则表型出更加健康的状态，见图3，A，B。
实施例3 2’-氨基苯乙酮增强油菜对病原菌DC3000的抵抗
将油菜种子在培养土中萌芽并使其正常生长至3片叶子时期。每个砵里种4株苗，对健康的幼苗处理2’-氨基苯乙酮和DC3000。配置终浓度为200μM的2’-氨基苯乙酮水溶液，浇灌50mL 2’-氨基苯乙酮水溶液到单个砵里，一组实验共6个砵，用到的苗子约为n＝12株。对照组则加入等体积的水，将浇灌处理了苗子用保鲜膜密封好处理2天再开始DC3000的处理。活化DC3000病原菌，调至OD为0.2的终浓度加入0.02％的表面活化剂Silwet，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，并用保鲜膜包裹6小时后再揭膜。第3-5天拍照记录下感病症状。油菜的感病症状表明2’-氨基苯乙酮处理的植物可以明显的减弱DC3000的侵染效率，对照组的植物呈现出更大面积的枯黄，萎蔫的状态，而处理了2’-氨基苯乙酮的植物则表型出更加健康的状态，见图4，A，B。
实施例4 2’-氨基苯乙酮不改变植物以及病原菌的正常生长
将5天左右大小的拟南芥移苗到两分隔皿的还有1％琼脂的培养皿基中的一边，一个培养皿中移5-6株苗，另外一边加入100μL浓度为1mM的2’-氨基苯乙酮水溶液，用不透气的封口膜封住培养皿放置在光照培养箱下培养7天。苗子的表征通过照相机记录，照片在imageJ软件里处理分析，结果表明，2’-氨基苯乙酮可以显著增加植物的侧根的数量，见图2A，但是对于植物的叶片表面积以及主根的长度并没有显著的影响，见图2，B，C。通过对DC3000进行浓度为200μM的2’-氨基苯乙酮的处理，对照组加入等体积的无菌水，在28度培养箱中培养DC3000，在指定的时间点里测定DC3000的OD值，结果表明，相比较于对照组，2’-氨基苯乙酮对DC3000的正常生产并没有表型出显著影响，见图2D。这说明2’-氨基苯乙酮增强植物对病原菌的抵御能力不是通过抑制病原菌的生长或者是通过影响植物的生长而达到抗病的目的，而是通过激活植物本身的免疫响应来增强植物对病原菌的侵染。
实施例5 2’-氨基苯乙酮增强了番茄和烟草对DC3000的抵御能力
番茄实验：将7天左右大小的的番茄苗移到还有15mL 200μM浓度为2’-氨基苯乙酮的培养基上处理2天，将处理和未处理化合物的番茄喷洒OD＝0.04的DC3000，2-3天后，番茄受感染表型被观察到。处理了化合物的番茄表现出了对DC3000的抵御能力。烟草的实验：4-5周大小的烟草健康的叶子，先预处理flg22(正对照)，2’-氨基苯乙酮和水(对照)，9小时后，向已经预处理过的烟草叶片注射OD＝0.001的DC3000，一天至两天之后，2’-氨基苯乙酮帮助烟草抵御DC3000造成的细胞死亡表型明显。
实施例6 2’-氨基苯乙酮增强了拟南芥对Pseudomonas aeruginosa(CGMCC号：1.15148的抵御能力
将拟南芥培养在短日照的环境下，取4-5周大左右的健康的苗子用于处理2’-氨基苯乙酮和Pseudomonas aeruginosa。配置终浓度为200μM的2’-氨基苯乙酮水溶液，浇灌50mL 2’-氨基苯乙酮水溶液到单个砵里(4-5颗苗种在一个砵里)，一组实验共6个砵，用到的苗子约为n>12株。对照组则加入等体积的水，将浇灌处理了苗子用保鲜膜密封好处理2天再开始Pseudomonas aeruginosa的处理。活化Pseudomonas aeruginosa病原菌，调至OD为0.2的终浓度加入0.02％的表面活化剂SilwetL77，混合好均匀的喷洒在植物的叶片表面，并用保鲜膜包裹6小时后再揭膜。Pseudomonas aeruginosa处理后第三天，取样做Pseudomonas aeruginosa的定殖实验，平均每组样收集4个生物学重复，每个生物学重复收集来自4片不同的植物叶片小孔样本。第五天拍照记录下感病症状。定殖的实验表明，处理了2’-氨基苯乙酮的拟南芥Pseudomonas aeruginosa的定殖量明显少于对照组，说明2’-氨基苯乙酮可以帮助拟南芥有效的抵御Pseudomonas aeruginosa的入侵，见图1，A。感病的症状进一步验证了定殖实验的结果，表明2’-氨基苯乙酮处理的植物可以明显的减弱Pseudomonas aeruginosa的侵染效率，对照组的植物呈现出更多叶片的枯黄状态，而处理了2’-氨基苯乙酮的植物则表型出更加健康的状态，见图5，A，B。
实施例7 2’-氨基苯乙酮的同分异构体对病原菌DC3000的响应情况
对生长在培养基上的5-6天左右大小的拟南芥进行2‘-氨基苯乙酮的同分异构体--2-氨基苯乙酮，4’-氨基苯乙酮预处理，处理浓度同2‘-氨基苯乙酮一样，都是100μL浓度为1mM的水溶液，对照组处理等体积的水。2天后再处理病原菌DC3000 OD＝0.01观察其对病原菌的响应情况。
结果如图6(A-B)所示，结果表明，2-氨基苯乙酮，4’-氨基苯乙酮预处理之后的植物表现出更强的对病原菌DC3000的抵御能力。处理了化合物的植物表现出相比较与对照显著的更少的DC3000定殖数量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于增强植物对病原菌的抗性；或制备一组合物或制剂，所述制剂或组合物用于增强植物对病原菌的抗性，所述式I化合物的结构如下所示：
Figure FDA0003964738600000011
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
2.如权利要求1上述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic结构：
Figure FDA0003964738600000012
式中，R1、R2、R3的定义如上所述。
3.如权利要求1上述的用途，其特征在于，R1和R2各自独立的为H、氨基、或-OH。
4.如权利要求1上述的用途，其特征在于，所述的化合物选自下组：
Figure FDA0003964738600000013
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病原菌包括番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.Tomato)。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病原菌选自下组：Pseudomonassyringae pv.Tomato DC3000(Pto DC3000)、Pseudomonas syringae pv.ActinidiaeICMP9617(Pac ICMP9617)、Pseudomonas aeruginosa(CGMCC号：1.15148)、或其组合。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物包括茄科、十字花科、禾本科、豆科、芭蕉科、香蕉科、藜科、百合科。
8.一种组合物，其特征在于，包括：
(i)式I化合物；
(ii)其他用于增强植物对病原菌的抗性的物质；
(iii)农学上可接受的载体；
所述式I化合物的结构如下所示：
Figure FDA0003964738600000021
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
9.一种权利要求8所述的组合物的用途，其特征在于，用于增强植物对病原菌的抗性。
10.一种增强植物对病原菌的抗性的方法，其特征在于，包括步骤：
给所述植物施用式I化合物，或施用权利要求8所述的组合物，所述式I化合物的结构如下所示：
Figure FDA0003964738600000031
式中，
R1为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R2为H、氨基、卤素、-OH、C1-C3烷基；
R3为H、-N(Ra)2、卤素、-OH、取代或未取代的C1-C3烷基，其中，所述“取代的”是指基团中的H被选自下组的一个或多个取代基所取代：氨基、卤素、-OH，Ra选自下组：H、C1-C3烷基、或其组合。
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