CN116148477A - 生物标志物组合在制备暴发性心肌炎药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明“生物标志物组合在制备暴发性心肌炎药物方面的应用”属于药物领域。所述应用的特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec‑5；所述生物标志物组合进一步选自由sST2、PAI‑1、Siglec‑5、CD163、CD40、P‑Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。本发明发现所述生物标志物在暴发性心肌炎患者血浆中的表达增高，并证实了其作为药物靶标在缓解和/或改善暴发性心肌炎中的作用，可通过药物控制这些生物标志物的水平，可以对疾病进行更强化的诊断和后续治疗，在临床上有巨大的应用价值。

Description

生物标志物组合在制备暴发性心肌炎药物方面的应用
本申请是中国专利申请CN 114414812 A的分案申请，母案申请的申请信息如下：
申请号：202111559565X
申请日：2021年12月20日
优先权号：202011518438.0
优先权日：2020年12月21日
发明名称：生物标志物组合在制备暴发性心肌炎诊断试剂及暴发性心肌炎药物方面的应用
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及生物标志物组合在制备暴发性心肌炎药物方面的应用。
背景技术
暴发性心肌炎是最为严重和特殊的心肌炎类型，主要特点是起病急骤，病情进展极其迅速，患者很快出现血流动力学异常，并可伴有呼吸衰竭和肝肾功能衰竭，早期死亡率在50％以上。
暴发性心肌炎的临床特点与诊疗现状具有以下几个特点：1.暴发性心肌炎的临床认识和诊断能力严重不足，导致这类患者的漏诊和误诊率极高，治疗也经常被延误。2.在全世界尚无有效治疗方案、共识或指南。暴发性心肌炎在此前大多应用经验性治疗方案，包括抗感染、提升血压、心脏人工辅助装置等，但患者生存率一直得不到实质性提高。3.暴发性心肌炎有效救治的医学和社会价值极大。暴发性心肌炎好发于平时身体健康、无基础疾病的青壮年人群，由于早期死亡率高，将对患者家庭和社会造成巨大伤害。然而值得注意的是，暴发性心肌炎患者一旦度过危险期存活下来，其长期生存率和生存质量与普通人群几乎没有差别。一项长达11年的随访研究显示，暴发性心肌炎生存率显著高于普通急性心肌炎。
暴发性心肌炎临床发病极其凶险，病情进展快、死亡率高为其特点。既往治疗以增强心肌收缩、升高血压为核心，但未有效降低病死率。其根本原因是人们对于暴发性心肌炎的病理生理和发病机制的本质缺乏正确认识，甚至是完全错误的认识，因此无法提出有效的治疗方法，继而导致患者病情不断进展和大量死亡的严重后果。因此，亟待充分研究和认识暴发性心肌炎的发病机制，寻找新的治疗靶标和采用更加有效的措施改善或延缓暴发性心肌炎的进展，降低暴发性心肌炎的死亡率和住院率；另一方面，暴发性心肌炎的诊断仍缺乏特异性指标，因此需要寻找新的生物标志物。
发明内容
本发明针对现有技术中针对暴发性心肌炎诊断和治疗困难，风险评估不足的问题，发现了一系列新的生物标志物，并证实了它们与暴发性心肌炎发病的相关性，以及其中两种(sST2和CD163)作为药物靶标在缓解和/或改善暴发性心肌炎的作用；因此通过试剂盒检测炎症因子水平，可用来协助诊断暴发性心肌炎或评估暴发性心肌炎的预后，并通过药物控制sST2和CD163水平，以对疾病进行更强化的诊断和后续治疗，在临床上有巨大的应用价值。
生物标志物组合在制备暴发性心肌炎诊断试剂方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec-5。
所述生物标志物组合选自由sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。
具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种或一种以上；
更具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种。
所述暴发性心肌炎诊断试剂包括所述生物标志物组合和其它诊断学上可接受的辅助试剂；
所述诊断学上可接受的辅助试剂选自：ELISA检测常规试剂、或，流式检测常规试剂。
所述诊断包括判断是否罹患暴发性心肌炎、或，评估暴发性心肌炎预后；
优选地，所述诊断指，根据受试者体内的生物标志物组合中的生物标志物的表达水平来判断是否罹患暴发性心肌炎、或，评估暴发性心肌炎预后；
优选地，Siglec-5的表达水平≥89.56pg/mL、和/或，
sST2的表达水平≥21.39ng/mL、和/或，
PAI-1的表达水平≥41.29ng/mL、和/或，
CD163的表达水平≥133.8ng/mL、和/或，
CD40的表达水平≥67.43pg/mL、和/或，
P-Cadherin的表达水平≥2634pg/mL、和/或，
CD14的表达水平≥262.4ng/mL、和/或，
CTLA4的表达水平≥11.19pg/mL时，则确诊暴发性心肌炎；上述8个标志物中的任意一个都可以用于诊断暴发性心肌炎，如果同时满足的多个标志物的表达水平条件，则确诊的准确率更高。
优选地，Siglec-5的表达水平＜89.56pg/mL、和/或，
sST2的表达水平＜21.39ng/mL、和/或，
CD163的表达水平＜133.8ng/mL时，暴发性心肌炎预后良好。
所述暴发性心肌炎选自由病毒、细菌、过敏、药物、上呼吸道感染、和/或，肠道感染导致或引发的暴发性心肌炎。
生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec-5。
所述生物标志物组合选自由sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。
具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种或一种以上；
更具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种。
所述防治暴发性心肌炎的药物靶点为所述生物标志物组合中的生物标志物；
优选地，所述防治暴发性心肌炎的药物包括可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分；
优选地，所述可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分选自所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽。
所述防治暴发性心肌炎的药物以所述生物标志物组合中的生物标志物为药物靶点，通过抑制所述生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用；
优选地，所述防治暴发性心肌炎的药物通过针对所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽减低暴发性心肌炎患者血浆中的生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用；
优选地，所述暴发性心肌炎选自由病毒、细菌、过敏、药物、上呼吸道感染、和/或，肠道感染导致或引发的暴发性心肌炎。
所述防治暴发性心肌炎的药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明目的一，提供对暴发性心肌炎进行诊断和/或评估暴发性心肌炎预后的炎症因子生物标志物。
本发明目的二，提供该生物标志物在诊断和/或评估暴发性心肌炎预后中的应用。
本发明目的三，提供一种以前述生物标志物为新的治疗靶标，通过抑制暴发性心肌炎患者血浆中的sST2水平为例，从而达到缓解和/或改善暴发性心肌炎的作用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
本发明的目的一在于提供一种对暴发性心肌炎进行诊断和/或评估暴发性心肌炎预后的生物标志物，所述生物标志物包括：sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14和CTLA4。
进一步的，所述暴发性心肌炎包括病毒、细菌、过敏、药物、各种病因导致的暴发性心肌炎。
本发明的目的二在于提供生物标志物在制备对暴发性心肌炎进行诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
进一步的，通过检测人体血浆生物标志物水平，若人体内血浆生物标志物浓度显著升高，认为该人体存在暴发性心肌炎和/或预后较差。
所述生物标志物选自：sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4。
本申请通过大样本临床试验，发现暴发性心肌炎患者血浆中以上炎症因子水平显著升高，证实了这些炎症因子可以作为生物标志物用于诊断暴发性心肌炎疾病。因此，通过检测血浆中炎症因子的水平可用来协助诊断暴发性心肌炎或评估暴发性心肌炎的预后。
本发明目的三在于生物标志物作为治疗靶标在制备缓解和/或改善暴发性心肌炎药物中的应用，通过抑制暴发性心肌炎患者血浆中升高的生物标志物水平为例，从而达到在缓解和/或改善暴发性心肌炎的作用。
进一步的，通过生物标志物中和抗体降低暴发性心肌炎模型小鼠血浆中的生物标志物水平，从而降低暴发性心肌炎模型小鼠血浆中的生物标志物水平，继而达到在缓解和/或改善暴发性心肌炎的作用。
本发明公开了多种炎症因子在暴发性心肌炎患者血浆中的表达谱，特别是生物标志物(Suppression of Tumorigenicity 2)及生物标志物中和抗体在暴发性心肌炎中的应用，具体涉及多种炎症因子在暴发性心肌炎疾病的诊断和预后评估中的应用，和生物标志物中和抗体在暴发性心肌炎的治疗中的应用，属于心血管疾病的诊断、预防和治疗领域。
本发明在大样本临床暴发性心肌炎的患者中，对122种炎症因子的表达谱进行了检测，从中筛选出8种炎症因子，并检验了其作为暴发性心肌炎生物学标志物的效能。进一步在暴发性心肌炎模式动物中对生物标志物中和抗体的作用进行了检测，确定了生物标志物在暴发性心肌炎中的应用，为缓解和/或治疗暴发性心肌炎提供了理论基础及循证依据。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过大量实验证实了特定炎症因子与暴发性心肌炎的关联性，多种炎症因子水平在暴发性心肌炎患者中显著升高，提示其可以作为生物标志物，因此，制备检测生物标志物的试剂或试剂盒，通过检测离体血浆中特定炎症因子的水平可用来协助诊断暴发性心肌炎或评估暴发性心肌炎的预后，检测手段快速、方便，大大提高了暴发性心肌炎诊断以及预后评估的效率和准确性，以便对疾病进行更强化的诊断和后续治疗，在临床上有巨大的应用价值。
2.本发明不仅为暴发性心肌炎提供了新的诊断方式，而且也提供了一种新的暴发性心肌炎的治疗靶标，生物标志物中和抗体或抑制剂通过抑制生物标志物，降低暴发性心肌炎患者血浆中的生物标志物水平，改善暴发性心肌炎的心肌损伤，有助于缓解和改善暴发性心肌炎，大大的减少暴发性心肌炎患者的住院死亡率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为对照人群及暴发性心肌炎患者入院时外周血中炎症因子表达谱；图中，control代表对照人群，FM代表暴发性心肌炎；True代表大于阈值、差异明显；False代表小于阈值、差异不明显。
图2为暴发性心肌炎患者治疗前后外周血中炎症因子水平的变化图谱；图中，FM-admission代表暴发性心肌炎患者治疗好转后出院前的血样检测结果；FM-discharge代表暴发性心肌炎患者入院未治疗时的血样检测结果；True代表大于阈值、差异明显；False代表小于阈值、差异不明显。
图3为特定炎症因子在暴发性心肌炎患者中的表达水平值；图中，FM-admission代表暴发性心肌炎患者治疗好转后出院前的血样中炎症因子的表达水平值；FM-discharge代表暴发性心肌炎患者入院未治疗时的血样中炎症因子的表达水平值；control代表对照人群的血样中炎症因子的表达水平值；folds指表达水平值的倍数；Cytokines指炎症因子。
图4为8种炎症因子在对照人群和暴发性心肌炎患者血样中的含量分析图，说明8种炎症因子可用于暴发性心肌炎的诊断评估；图中，con代表对照人群的血样中炎症因子的表达水平值；FM代表暴发性心肌炎患者的血样中炎症因子的表达水平值。
图5为9种炎症因子与心脏射血分数的相关性分析，其中3种炎症因子可用于暴发性心肌炎的预后评估；图中，Ejection Fraction代表射血分数，FM代表暴发性心肌炎患者的血样中炎症因子的表达水平值；hs-CRP代表阳性对照。
图6为外周血特定炎症因子水平针对暴发性心肌炎的诊断效能的ROC曲线图，图中，hs-CRP代表阳性对照。
图7为实验例4的4组小鼠的各炎症因子水平柱状图，表明暴发性心肌炎A/J小鼠外周血中多种炎症因子水平增高；图中，C57代表C57小鼠、A/J代表A/J小鼠、Balb/c代表Balb/c小鼠、C3H代表C3H小鼠、control代表空白对照组、CVB3代表CVB3心肌炎模型组。
图8为实验例5的3组小鼠的左室压力最大下降速度(-dp/dtmin)和左室压力最大上升速率(+dP/dtmax)的数值柱状图，表明sST2可诱导A/J小鼠心功能损伤。
图9为实验例5的3组小鼠的心肌细胞TUNEL染色照片及每一百心肌细胞中TUNEL阳性细胞率(TUNEL阳性率)的柱状图，表明sST2可诱导A/J小鼠心肌细胞凋亡；图7和图8中，control代表空白对照组；PBS代表阴性对照组；sST2代表实验组。
图10为实验例6的4组小鼠的血样中sST2的含量分析图，表明sST2中和抗体可以抑制CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠外周血中升高的sST2。
图11为实验例6的4组小鼠的心肌组织中sST2的含量分析图，表明sST2中和抗体可以抑制CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠心脏中升高的sST2。
图12为实验例6的4组小鼠的生存率分析图，表明sST2中和抗体可以提高CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠的生存率。
图13为实验例6的4组小鼠心肌组织切片染色图，说明sST2中和抗体可以改善CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠受损的心脏功能。
图14为实验例6的4组小鼠心肌组织验证区域比例柱状图，表明sST2中和抗体可以减少CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠心脏中的炎症细胞浸润。
图15为实验例6的4组小鼠的心肌细胞TUNEL染色照片及每一百心肌细胞中TUNEL阳性细胞率(TUNEL阳性率)的柱状图，表明sST2中和抗体可以减少CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠心脏中的心肌细胞凋亡。
图10-图15中，control代表空白对照组；PBS+goat IgG代表阴性对照组；CVB3+PBS代表CVB3暴发性心肌炎模型组；CVB3+anti-sST2或anti-sST2代表治疗组。
图16为实验例7的暴发性心肌炎小鼠外周血中炎症因子的表达水平，提示anti-CD163中和抗体能抑制CD163的升高。图中纵坐标为CD163炎症因子的表达水平值，横坐标control代表空白对照组、PBS+IgG代表阴性对照组、CVB3代表CVB3暴发性心肌炎模型组、CVB3+
anti-CD163代表治疗组。
图17为实验例7中小鼠的心功能，表明anti-CD163中和抗体可以改善CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠的心脏功能障碍；图中，左图纵坐标cardiac output代表心输出量测定值，右图纵坐标stroke volume代表每搏输出量，control代表空白对照组、PBS+IgG代表阴性对照组、CVB3代表CVB3暴发性心肌炎模型组、CVB3+anti-CD163代表治疗组。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
生物材料的来源
本发明实验例使用的小鼠均可商购获得。
第1组实施例、本发明的生物标志物组合的应用
生物标志物组合在制备暴发性心肌炎诊断试剂方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec-5。
所述生物标志物组合选自由sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。
具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种或一种以上；
更具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种。
所述暴发性心肌炎诊断试剂包括所述生物标志物组合和其它诊断学上可接受的辅助试剂；
所述诊断学上可接受的辅助试剂选自：ELISA检测常规试剂、或，流式检测常规试剂。
所述诊断包括判断是否罹患暴发性心肌炎、或，评估暴发性心肌炎预后；
优选地，所述诊断指，根据受试者体内的生物标志物组合中的生物标志物的表达水平来判断是否罹患暴发性心肌炎、或，评估暴发性心肌炎预后；
优选地，Siglec-5的表达水平≥89.56pg/mL、和/或，
sST2的表达水平≥21.39ng/mL、和/或，
PAI-1的表达水平≥41.29ng/mL、和/或，
CD163的表达水平≥133.8ng/mL、和/或，
CD40的表达水平≥67.43pg/mL、和/或，
P-Cadherin的表达水平≥2634pg/mL、和/或，
CD14的表达水平≥262.4ng/mL、和/或，
CTLA4的表达水平≥11.19pg/mL时，则确诊暴发性心肌炎；
优选地，Siglec-5的表达水平＜89.56pg/mL、和/或，
sST2的表达水平＜21.39ng/mL、和/或，
CD163的表达水平＜133.8ng/mL时，暴发性心肌炎预后良好。
所述暴发性心肌炎选自由病毒、细菌、过敏、药物、上呼吸道感染、和/或，肠道感染导致或引发的暴发性心肌炎。
本文中的上述标志物均具有本领域技术人员通常理解的常规技术含义，例如：
Siglec-5可以是专利申请201980062880.6一文中记载的Siglec-5；
sST2为《中国心力衰竭诊断和治疗指南》中记载的sST2；
PAI-1可以是《PAI-1基因检测对缺血性卒中预防的应用研究》一文中记载的PAI-1；
CD163可以是《M2型巨噬细胞标志物CD163与肿瘤的研究进展》一文记载的CD163；
CD40可以是《血清可溶性CD40配体水平与克罗恩病疾病活动度的相关性研究》一文记载的CD40；
P-Cadherin可以是《基于单分子阵列技术的Fn14、P-Cadherin和N-Cadherin超灵敏检测》一文记载的P-Cadherin；
CD14可以是《艾滋病合并肺结核CT征象与血浆可溶性CD14的相关性研究》一文记载的CD14；
CTLA4可以是《血清GP73、CTLA4水平与慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度的相关性》一文记载的CTLA4；
hs-CRP可以是《血清PTX3、Cav-1、hs-CRP与急性脑梗死患者病情及预后的关系研究》一文记载的hs-CRP。
第2组实施例、本发明生物标志物组合的制药用途
本组实施例提供生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec-5。
所述生物标志物组合选自由sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。
具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种或一种以上；
更具体地，所述生物标志物组合选自sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4中的一种、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种。
所述防治暴发性心肌炎的药物靶点为所述生物标志物组合中的生物标志物；
优选地，所述防治暴发性心肌炎的药物包括可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分；
优选地，所述可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分选自所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽。
所述防治暴发性心肌炎的药物以所述生物标志物组合中的生物标志物为药物靶点，通过抑制所述生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用；
优选地，所述防治暴发性心肌炎的药物通过针对所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽减低暴发性心肌炎患者血浆中的生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用；
优选地，所述暴发性心肌炎选自由病毒、细菌、过敏、药物、上呼吸道感染、和/或，肠道感染导致或引发的暴发性心肌炎。
所述防治暴发性心肌炎的药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
实验例1
暴发性心肌炎患者外周血中大量炎症因子表达水平增高
研究人群和研究设计：从2017年4月到2019年3月，在湖北省武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院连续收录暴发性心肌炎的住院患者。入选标准包括：①年龄大于18周岁；②诊断为暴发性心肌炎：心肌活检提示心肌炎或符合临床诊断(迅速出现的严重血流动力学障碍症状、cTnI增高、心脏超声提示左室EF值迅速下降或者低于40％)。排除标准包括：①急性心肌梗死；②普通急性心肌炎；③严重的神经系统疾病(阿茨海默病，帕金森综合征进展期)，下肢残缺或聋哑患者。
炎症因子表达谱检测：空腹抽取外周血于EDTA抗凝管，立即3000转/分离心8分钟取血清冻存于-80℃冰箱待分析。血浆炎症因子表达谱采用RayBiotech公司Humancytokine arrays检测。
实验结果：4例暴发性心肌炎患者入组，按性别年龄等匹配基线资料无差异的对照组人群样本4例。检测结果表明，与对照组相比，暴发性心肌炎患者外周血中的58种炎症因子的含量均明显(图1)。这些结果提示血浆中大量炎症因子水平增高与暴发性心肌炎相关。图例中control代表对照人群，FM代表暴发性心肌炎，红点表示明显差异的炎症因子。
实验例2
暴发性心肌炎患者治疗好转后外周血中特定炎症因子表达水平降低
研究人群和研究设计：从2017年4月到2019年3月，在湖北省武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院连续收录暴发性心肌炎的住院患者。入选标准包括：①年龄大于18周岁；②诊断为暴发性心肌炎：心肌活检提示心肌炎或符合临床诊断(迅速出现的严重血流动力学障碍症状、cTnI增高、心脏超声提示左室EF值迅速下降或者低于40％)。排除标准包括：①急性心肌梗死；②普通急性心肌炎；③严重的神经系统疾病(阿茨海默病，帕金森综合征进展期)，下肢残缺或聋哑患者。
炎症因子表达谱检测：空腹抽取外周血于EDTA抗凝管，立即3000转/分离心8分钟取血清冻存于-80℃冰箱待分析。血浆炎症因子表达谱采用RayBiotech公司Humancytokine arrays检测。
实验结果：4例暴发性心肌炎患者入组，在入院未经治疗时及治疗好转后出院前分别留存血样。检测结果表明，经有效治疗后，部分升高的炎症因子含量明显下降(图2)。这些结果提示外周血中特定炎症因子的水平增高与暴发性心肌炎相关，即sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、IL-17B、IL-4、VEGF-C、CD40、P-Cadherin、CD14、Angiostatin和CTLA4(图3)。*代表p<0.05。
实验例3
外周血特定炎症因子水平针对暴发性心肌炎的诊断和预后评估效能
研究人群和研究设计：从2017年4月到2019年3月，在湖北省武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院连续收录暴发性心肌炎的住院患者。入选标准包括：①年龄大于18周岁；②诊断为暴发性心肌炎：心肌活检提示心肌炎或符合临床诊断(迅速出现的严重血流动力学障碍症状、cTnI增高、心脏超声提示左室EF值迅速下降或者低于40％)。排除标准包括：①急性心肌梗死；②普通急性心肌炎；③严重的神经系统疾病(阿茨海默病，帕金森综合征进展期)，下肢残缺或聋哑患者。
炎症因子水平检测：空腹抽取外周血于EDTA抗凝管，立即3000转/分离心8分钟取血清冻存于-80℃冰箱待分析。血浆炎症因子水平采用R&D公司相应ELISA kit检测。
实验结果：32例暴发性心肌炎患者入组，按性别年龄等匹配基线资料无差异的对照组人群样本16例。检测结果表明，针对暴发性心肌炎，患者外周血中的8种炎症因子含量(sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14和CTLA4)显著变化，具有诊断价值(图4)。其中，3种炎症因子含量(sST2、Siglec-5和CD163)与心功能EF值具有相关性，具有预后评估价值(图5)。并且，与CRP相比，患者外周血中的特定炎症因子含量(sST2、Siglec-5和CD163)有更好的诊断效能(图6)。*代表p<0.05。
实验例4
暴发性心肌炎小鼠外周血中多种炎症因子水平增高
小鼠模型制备：8周龄雄性C57、A/J、Balb/c和C3H小鼠购自南京大学模式动物中心。饲养于华中科技大学同济医学院SPF级动物房。不同背景小鼠在动物房适应一周后分别予以CVB3病毒腹腔注射(104溶于0.1ml PBS)，作为CVB3心肌炎模型组。
炎症因子水平检测：采用R&D公司相应ELISA Kit检测。
实验结果：CVB3病毒腹腔注射8天后行心导管检测，随后处死动物，收集组织标本，进行上述检测，结果表明与对照组相比，CVB3感染后A/J暴发性心肌炎小鼠外周血中sST2、C163、P-Cadherin、CD14和CTLA4升高最为显著(图7)。*代表p<0.05。
实验例5
以升高最为显著的sST2为例，观察特定炎症因子对A/J小鼠心功能的影响
小鼠模型制备：8周龄雄性A/J小鼠购自南京大学模式动物中心。饲养于华中科技大学同济医学院SPF级动物房。小鼠在动物房适应一周后开始予以重组sST2蛋白腹腔注射(5ug溶于0.1ml PBS)，作为干预组(实验组)。另有一组小鼠予以PBS处理，作为阴性对照组，第3组为不做任何处理的空白对照组(control)。
小鼠心脏血流动力学检测：使用Millar Instrument PowerLab公司的Millar压力-容积系统进行。将动物麻醉至适当深度后，在颈部做正中切口，分离右颈总动脉，结扎其远心端，夹闭近心端，用显微剪在动脉上做V形切口，插入微导管，直至左心室，经过传导系统记录信号，以获得心率(HR)、左室舒张末压(PED)、左室收缩末压(PES)、左室压力最大下降速度(-dp/dtmin)和左室压力最大上升速率(+dP/dtmax)等血流动力学数据。
组织学检测：心肌组织放入包埋框中在中性甲醛溶液中浸泡固定，脱水，石蜡包埋，将蜡块上切片机切成厚度为4μm的切片。HE染色观察心肌大体观，天狼猩红染色观察心肌纤维化。TUNEL染色采用Roche公司试剂盒检测。
实验结果：重组sST2蛋白腹腔注射10天后行心导管检测，随后处死动物，收集组织标本，进行上述检测，结果表明与对照组相比，重组sST2蛋白腹腔注射使得小鼠心功能明显下降(图8)。并且重组sST2蛋白腹腔注射使得小鼠心肌细胞TUNEL阳性率增高，提示心肌细胞凋亡增多(图9)。*代表p<0.05。
实验例6
anti-sST2中和抗体可以抑制CVB3诱导的A/J暴发性心肌炎小鼠心肌损伤
小鼠模型制备：8周龄雄性A/J小鼠购自南京大学模式动物中心。饲养于华中科技大学同济医学院SPF级动物房。小鼠在动物房适应一周后开始予以CVB3病毒腹腔注射(104溶于0.1ml PBS)，作为CVB3暴发性心肌炎模型组。另有一组暴发性心肌炎模型组小鼠予以anti-sST2中和抗体(10μg溶于0.1ml PBS)腹腔注射处理，作为治疗组；第三组为不做任何处理的空白对照组；第四组为以羊IgG抗体(104溶于0.1ml PBS)腹腔注射的阴性对照组。
sST2水平检测：采用R&D公司Mouse ST2/IL-33R Quantikine ELISA Kit检测。
小鼠心脏血流动力学检测：使用Millar Instrument PowerLab公司的Millar压力-容积系统进行。将动物麻醉至适当深度后，在颈部做正中切口，分离右颈总动脉，结扎其远心端，夹闭近心端，用显微剪在动脉上做V形切口，插入微导管，直至左心室，经过传导系统记录信号，以获得心率(HR)、左室舒张末压(PED)、左室收缩末压(PES)、左室压力最大下降速度(-dp/dtmin)和左室压力最大上升速率(+dP/dtmax)等血流动力学数据。
组织学检测：心肌组织放入包埋框中在中性甲醛溶液中浸泡固定，脱水，石蜡包埋，将蜡块上切片机切成厚度为4μm的切片。HE染色观察心肌大体观，天狼猩红染色观察心肌纤维化。TUNEL染色采用Roche公司试剂盒检测。
实验结果：anti-sST2中和抗体腹腔注射8天后行心导管检测，随后处死动物，收集组织标本，进行上述检测，结果表明与对照组相比，CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠外周血中sST2升高，而anti-sST2中和抗体可以使其下降(图10)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠心脏中sST2升高，而anti-sST2中和抗体可以使其下降(图11)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠的生存率明显下降，而anti-sST2中和抗体可以使其增高(图12)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠的心脏功能明显下降，而anti-sST2中和抗体可以使其功能增强(图13)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠心脏中的炎症细胞浸润明显增多，而anti-sST2中和抗体可以使其减少(图14)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠心肌细胞TUNEL阳性率明显增多，而anti-sST2中和抗体可以使其减少(图15)。*代表p<0.05。
实验例7
anti-CD163中和抗体可以改善CVB3导致的A/J暴发性心肌炎小鼠心功能障碍
小鼠模型制备：8周龄雄性A/J小鼠购自南京大学模式动物中心。饲养于华中科技大学同济医学院SPF级动物房。小鼠在动物房适应一周后开始予以CVB3病毒腹腔注射(104溶于0.1ml PBS)，作为CVB3暴发性心肌炎模型组。不做任何处理小鼠为空白对照组，羊IgG抗体(104溶于0.1ml PBS)腹腔注射的小鼠作为阴性对照组。另有暴发性心肌炎模型组小鼠予以anti-CD163中和抗体(10μg溶于0.1ml PBS)腹腔注射处理，作为治疗组。
炎症因子水平检测：采用R&D公司相应ELISA kit检测。
小鼠心脏超声检测：使用Visual Sonics Inc.公司的Vevo 2100小动物超声进行心脏超声检测。主要测量指标包括：心率(HR)、左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张期或收缩期室间隔厚度(LVIDd和LVIDs)、左心室后壁厚度(LVPWd和LVPWs)。
实验结果：anti-CD163中和抗体腹腔注射8天后行心导管检测，随后处死动物，收集组织标本，进行上述检测，结果表明与对照组相比，CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠外周血中CD163水平升高，而anti-CD163中和抗体治疗可以使CD163水平下降(图16)。CVB3感染后暴发性心肌炎小鼠的心脏功能明显下降，而anti-CD163中和抗体治疗可以使其功能增强(图17)。*代表p<0.05。

Claims (10)

1.生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合包括：Siglec-5。
2.根据权利要求1所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述生物标志物组合选自由sST2、PAI-1、Siglec-5、CD163、CD40、P-Cadherin、CD14、CTLA4组成的组。
3.根据权利要求1所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物靶点为所述生物标志物组合中的生物标志物。
4.根据权利要求2所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物靶点为所述生物标志物组合中的生物标志物。
5.根据权利要求1-4任一所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物包括可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分。
6.根据权利要求5所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述可降低、下调、抑制所述生物标志物的活性成分选自所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽。
7.根据权利要求1-4、6任一所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物以所述生物标志物组合中的生物标志物为药物靶点，通过抑制所述生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用。
8.根据权利要求1-4、6任一所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物通过针对所述生物标志物的抑制剂、中和抗体或多肽减低暴发性心肌炎患者血浆中的生物标志物的表达水平，从而达到防治暴发性心肌炎的作用。
9.根据权利要求1-4、6任一所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述暴发性心肌炎选自由病毒、细菌、过敏、药物、上呼吸道感染、和/或，肠道感染导致或引发的暴发性心肌炎。
10.根据权利要求1-4、6任一所述的生物标志物组合在制备防治暴发性心肌炎的药物方面的应用，其特征在于，所述防治暴发性心肌炎的药物还包括药学上可接受的辅料。
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