CN116145267A - 一种全基因组dna胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法 - Google Patents

一种全基因组dna胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学技术领域。其内容包括如下步骤：5hmC标记反应；点击化学反应；样本DNA片段化；通过磁珠将片段化产物纯化；5hmC片段化DNA捕获；洗涤捕获产物；还原反应；APOBEC酶脱氨反应；脱氨产物的纯化；双链转化反应；末端修复和3′端加A反应；接头连接；连接产物纯化与双分选；文库扩增；文库纯化。该建库方法在保证数据真实的前提下，集低数据量、单碱基精确度和适用于常规双链建库试剂盒于一体。具有较高的通用性和数据高度可重复的技术优势。

Description

一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库 方法
技术领域
本发明涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法。
背景技术
表观遗传学修饰是指非基因序列改变导致的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和基因印迹等。这些表观遗传学改变通过开放或关闭某些特定基因，在胚胎发育、细胞分化、组织特异性蛋白表达、维持基因组完整性和染色体稳定性等方面发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)是一种新发现的表观遗传学修饰碱基，被称之为人类DNA的第6种碱基，以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。5hmC是甲基化胞嘧啶(5-methylated cytosine,5mC)的羟基化形式，它是10-11易位(ten-eleven translocation,TET)家族蛋白将5mC氧化而形成的产物。
1952年，Wyatt等人首次在T-偶数系噬菌体中发现了5hmC表观标志。1972年，Penn等人通过色谱分析技术在成年大鼠、小鼠以及青蛙脑组织中发现5hmC，但当时被认为是由于氧化反应引起的DNA异常，故未被重视。直到2009年，多个研究发现在小鼠浦肯野细胞及小脑颗粒细胞中存在5hmC而被广泛关注。2011年，科学家发现在人体中，不同组织之间5hmC的分布存在着差异性：在肝、肾、脑和大肠组织中，5hmC含量较高，而在肺组织内含量相对较低，最低含量的5hmC出现在乳腺、心脏和胎盘组织中。5hmC在细胞分化及组织发育进程中发挥重要作用。2012年，Freudenberg等人发现在小鼠胚胎干细胞中，随着细胞的分化，5hmC含量逐渐降低，从而导致胚胎干细胞多功能性的丧失，这表明5hmC与胚胎干细胞的分化和个体早期发育密切相关。此外，Orr等人发现当人脑组织处于发育阶段时，胎儿皮质等较分化部分的5hmC含量高，而在脑室周围的祖细胞区域含量低，这表明5hmC在中枢神经系统发育中有着特定的作用。
5hmC的含量可作为区别肿瘤组织和正常组织的指标之一，能够指导肿瘤诊断，甚至为肿瘤治疗提供表观线索。Yang等人发现5hmC在人类肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌组织中较周围正常组织含量低；Orr等人也发现在恶性胶质瘤中5hmC含量变低；此外，Lian等人的研究结果表明黑色素瘤组织中没有5hmC的存在，因此可作为是否患有黑色素瘤的依据。5hmC水平的异常还可能破坏造血细胞内的平衡，导致造血细胞增殖及异常成熟，从而发展为肿瘤细胞。Pronier等人发现，在骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合症(MDS)以及急性髓细胞白血病(AML)等多种造血系统肿瘤的形成是由于细胞中TET2表达受到抑制，导致5hmC水平降低，并干扰髓系细胞发育分化，进而发展成髓系肿瘤细胞。
目前，DNA羟甲基化的检测技术主要分为两类：依赖抗原-抗体免疫作用原理的沉淀检测技术和不依赖免疫作用原理的非沉淀检测技术。依赖抗原-抗体免疫作用沉淀检测技术的原理是通过一些化学反应或酶促反应对5hmC进行特殊处理，然后采用沉淀技术对含有5hmC的DNA片段进行特异性捕获，方法主要包括结合蛋白J沉淀法(J-binding protein，JBP)、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation，periodate oxidation，biotinylation，GLIB)。非沉淀法检测技术主要包括质谱法(mass spectrometry)、5hmC葡萄糖基化定量测定(Quantitative hmC Glucosylation assay)、薄层色谱法(thin-layerchromatography)、高压液相色谱法(high pressure liquid chromatography)和单分子实时DNA测序(single molecule real-time DNA sequencing，SMRT)。近年来，随着高通量测序技术方法的不断革新和测序费用的持续降低，其已被广泛应用于各大生物研究领域。
尽管DNA羟甲基化高通量检测技术多种多样，但它们各有优缺点。基于亚硫酸氢盐的方法如OxBS-seq、TAB-seq，能够在单碱基分辨率上检测5hmC，为科学和疾病研究提供了较为全面和精确的定量信息。然而，同时氧化和亚硫酸氢盐处理也会导致基因组DNA的大量损失，这限制了它们在有限样品量的研究实用性。相比之下，使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)的转化测序方法(ACE-seq)，在单碱基精确度的基础上，能够有效保证DNA的完整性。但在全基因组测序水平上想要达到分析需求，测序深度至少需要达到30×(人的样本需要至少90G测序数据)，无疑增加了测序费用和数据储存、分析难度。此外，OxBS-seq还需同时构建BS-seq文库，这种联合测序方式虽能实现对5hmC单碱基分辨率，但该方法除了极大的样本需求量和高昂的测序费用之外，对实验操作人员以及数据分析人员的专业素质要求极高，否则极容易出现偏差，导致数据结果可信度降低。而基于富集的分析方法在增加测序深度的同时能够有效降低测序成本。经典的羟甲基化捕获方法(5hmC-Seal)是由芝加哥大学何川教授团队开创，其流程主要包括：1)DNA样本片段化，2)末端修复加“A”，3)接头连接，4)纯化，5)5hmC标记及点击化学反应，6)亲和富集，7)PCR扩增。该方法经过5年的优化，具有用时少、操作方便、测序数据量低及便于大样本量数据分析等优点，但无法实现单碱基精确度。2021年，Xiaogang Li等将脱氨酶A3A应用于5hmC-Seal方法之上，发明了在单碱基精确度的基础上，用较少数据量检测全基因组范围DNA羟甲基化修饰的新方法DIP-CAB-Seq。
传统的5hmC-Seal及DIP-CAB-Seq方法都是建立在5hmC捕获基础上，文库富集扩增步骤仍采用带磁珠扩增法，导致20％以上捕获假阳性率，极大影响了数据的可信度、增加了数据结果验证的试错次数；同时，DIP-CAB-Seq文库构建的实现需要羟甲基化修饰接头，并不具有通用性；此外，DIP-CAB-Seq方法实验结果不稳定，重复性较差。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法以解决上述技术问题。本发明通过对捕获流程进行改造，最终将假阳性率降低至1.5％左右；同时，通过对建库流程的改进，可以实现适用于常规双链建库试剂盒，极大地提高了通用性，有利于增加市场占有率；数据结果重复率能达到将近90％。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其包括如下步骤：
5hmC标记反应；点击化学反应；样本DNA片段化；通过磁珠将片段化产物纯化；5hmC片段化DNA捕获；洗涤捕获产物；还原反应；APOBEC酶脱氨反应；脱氨产物的纯化；双链转化反应；末端修复和3′端加A反应；接头连接；连接产物纯化与双分选；文库扩增；文库纯化；
5hmC标记反应是指采用糖基化标记体系对基因组DNA上的5hmC进行标记；
点击化学反应是将DBCO-PEG3-S-S-Biotin与5hmC标记的反应产物进行混合反应；
样本DNA片段化是采用超声波对样本DNA进行片段化；
5hmC片段化DNA捕获是采用链霉亲和素磁珠对片段化了的含有5hmC的DNA进行捕获；
洗涤捕获产物包括：采用Buffer清洗磁珠3次后用ddH2O清洗磁珠1-3次；
APOBEC酶脱氨反应是将未糖基化标记的C和5mC脱氨为U；
双链转化反应是采用Klenow Fragment将纯化后的脱氨产物转化为双链DNA。
一方面，本发明提供的建库方法实现了单碱基精确度。基于抗体富集(hMeDIP-Seq)和葡糖基修饰富集(hMe-Seal化学标记法、JBP-1沉淀法和GLIB沉淀法)来评估5hmC水平的检测方法存在一定缺陷，即较难准确定量，无法达到单碱基分辨率效果。而本发明通过对样本基因组DNA进行APOBEC3A酶脱氨处理，可以有效将未糖基化保护的C和5mC脱氨成U，而糖基化的5hmC则不被脱氨，测序后仍检测为C，故达到单碱基精确度的效果。此外，酶处理法较化学试剂处理法，对DNA样本损伤小，相同投入量下可获得更高产量的文库。
第二方面，本发明提供的建库方法，可以采用较低的测序数据量获得较高的测序深度。全基因组中羟甲基化胞嘧啶的平均水平约为胞嘧啶的1％，但基于亚硫酸氢盐的TAB-Seq、OxBS-Seq以及基于APOBEC3A脱氨酶的ACE-seq检测方法虽可达到全基因组5hmC单碱基分辨率要求，却需要极大的测序数据量和测序成本。本发明通过对糖基化的5hmC进行生物素标记后，利用链霉亲和素磁珠进行特异性捕获，仅将含有5hmC的DNA片段pull down，15Gb测序数据便可达到30×，减少80％以上的测序成本。
第三方面，本发明提供的建库方法提高了数据可信度：
(1)降低捕获假阳性率。
假阳性一直是捕获实验的通病。通过标准品检测发现hMe-Seal捕获假阳性高达20％。根据一系列探索性实验证实，假阳性的产生主要源于无hmC位点的DNA片段缠绕在大分子DBCO-PEG3-S-S-Biotin、捕获的核酸片段以及捕获磁珠上。本发明通过以下操作方法将捕获假阳性率降至1.5％左右。
为了降低捕获的假阳性率，发明人采用如下技术手段：将DNA的打断流程设置到点击化学反应(加DBCO-PEG3-S-S-Biotin)之后、5hmC片段化DNA捕获之前，利用超声波将缠绕在DBCO-PEG3-S-S-Biotin上的非捕获片段震荡游离，并通过磁珠纯化将非捕获片段去除，从而降低非捕获片段产生的假阳性率。
在用链霉亲和素修饰磁珠对含有5hmC片段化DNA进行捕获洗脱时，在用1×B&WBuffer清洗磁珠后，增加一步水洗，尽可能将与磁珠捕获的DNA片段缠绕的非捕获片段洗脱去除，从而进一步降低非捕获片段产生的假阳性率。
在进行文库扩增前先利用还原剂对DBCO-PEG3-S-S-Biotin分子中的二硫键进行“切割”以去除磁珠，进一步去除缠绕在磁珠上的非捕获片段。从而更彻底地降低非捕获片段产生的假阳性率。
(2)对捕获后的DNA片段进行APOBEC3A脱氨酶处理：
仅对含有hmC位点的片段进行APOBEC3A脱氨酶处理，有助于提升非羟甲基化胞嘧啶位点的转化效率。
(3)本发明提供的建库方法能够有效增加测序深度，能将测序深度提高到60×(30G左右，远低于ACE-seq)，能够有效降低因测序深度导致的数据分析覆盖度不够的情况，且提升了单碱基检测精度。
第四方面，本发明提供的建库方法适应于常规的双链建库试剂盒。近年来，评估5hmC水平的检测方法无法同时满足单碱基精确度和低测序数据量的要求，直至2021年，出现的DIP-CAB-Seq检测方法可同时满足这两个指标，但该方法需使用单链建库试剂盒进行文库构建，这无疑降低了其方法的通用性还增加了建库成本。而本发明通过设计随机引物将脱氨后的单链DNA样本在Klenow Fragment作用下转化成双链DNA，后续进行常规双链建库即可，更具有普适性。
在本发明应用较佳的实施方式中，5hmC标记反应的反应体系包括：UDP-N3-Glu、基因组DNA、HEPES、MgCl2、和T4-β-葡糖基转移酶(T4 Phageβ-glucosyltransferase，βGT)，5hmC标记反应是在35-37℃孵育1-2h。5hmC标记反应的反应体系用于保护5hmC。
5hmC标记反应的反应体系例如包括：34.25μL基因组DNA、2.5μL HEPES、1.25μLMgCl2、8μL UDP-N3-Glu和4μLβGT，在37℃孵育2h。基因组DNA初始上样量为500～1500ng。
HEPES、MgCl2和UDP-N3-Glu浓度分别为1M、1M和1mM；HEPES的pH为8.0。
在本发明应用较佳的实施方式中，点击化学反应中，DBCO-PEG3-S-S-Biotin与5hmC标记的反应产物的体积比为1:20-24；点击化学反应是在35-37℃孵育1-2h。
在一种可选的实施方式中，DBCO-PEG3-S-S-Biotin的浓度为4-4.5mM。
在本发明应用较佳的实施方式中，在样本DNA片段化过程中，DNA样本的片段化时间为15-38min。
在一种可选的实施方式中，片段化时间为35-38min，片段化后的片段范围为200-500bp。在上述片段化时间内能够获得较高质量的目标片段的DNA片段。
片段后的纯化：取磁珠对片段化产物进行纯化，纯化的磁珠倍数为1.5×。
在本发明应用较佳的实施方式中，5hmC片段化DNA捕获包括：向片段化的基因组DNA中加入经Buffer清洗并重悬后的链霉亲和素磁珠，混匀后室温孵育20-30min以进行5hmC片段化DNA的捕获。捕获磁珠量为5μL。重悬磁珠所用的1×Buffer的体积为25μL。
在一种可选的实施方式中，Buffer中包含Tris-HCl、EDTA和NaCl；在一种可选的实施方式中，Buffer中包含10mM Tris-HCl、1mM EDTA和2M NaCl。
在本发明应用较佳的实施方式中，洗涤捕获产物的步骤有利于将缠绕在核酸片段上的非捕获片段(非特异性片段)洗脱去除，从而降低捕获假阳性。
在本发明应用较佳的实施方式中，还原反应包括：加入还原剂重悬磁珠，25-27℃、900-950rpm振荡孵育；例如振荡时间为70min。
在一种可选的实施方式中，还原剂为DTT溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，APOBEC酶脱氨反应包括：向待脱氨处理的样本中加入甲酰胺进行变性，然后将变性后的DNA与APOBEC Reaction buffer、BSA、APOBEC以及ddH2O混合孵育。
变性条件为85℃变性至少10min。例如变性10-20min。
在一种可选的实施方式中，孵育的条件为：35-37℃，孵育2-3h。
脱氨反应体系：20μL变性后的DNA、10μL 10×APOBEC Reaction buffer、1.5μLBSA、1.5μL APOBEC以及67μL无核酸酶水，37℃孵育3h。
脱氨产物纯化回收：将脱氨后的产物用柱纯化浓缩回收。纯化试剂盒为ZymoOligo Clean and Concentrator Kit。在本发明应用较佳的实施方式中，双链转化反应的反应体系包括：纯化后的脱氨产物、Klenow Buffer、Random Primers、Solution I和dNTPs；在一种可选的实施方式中，双链转化反应的条件包括：95-96℃孵育5min后，加入KlenowFragment，37℃孵育60min。Klenow Fragment的浓度为5U/μL。
在本发明应用较佳的实施方式中，接头连接的接头序列如SEQ ID NO.1-2所示。
SEQ ID NO.1：
5′-Phos-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT*C-3′
SEQ ID NO.2：
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
末端修复、磷酸化及3′端加A反应包括：在Endprep buffer和Endprep enzyme酶的作用下，30℃和72℃各孵育20min，以对双链转化后的基因组DNA片段进行末端缺口修复和3′端加A。
接头连接包括：加入30μL Ligation Enhancer、5μL T4 DNA Ligase和DNAAdaptors，以对修复和加A尾后的DNA进行连接。
连接产物纯化与双分选包括：使用磁珠对连接产物进行纯化和双分选；纯化所用磁珠为Hieff NGS DNA Selection Beads；纯化方式为0.6×磁珠纯化，分选所用方式为0.7×和0.2×磁珠分选。
文库扩增包括：加入扩增酶、反应缓冲液和含有Index的接头引物对纯化分选后的连接产物进行扩增；扩增循环数11-15个。
文库纯化包括：加入0.9×Hieff NGS DNA Selection Beads进行纯化，涡旋混匀，室温孵育5min。用20μL ddH2O水洗脱。纯化前需加ddH2O补至50μL后进行纯化。
本发明具有以下有益效果：
本发明提出了一种在保证数据真实的前提下，集低数据量、单碱基精确度和适用于常规双链建库试剂盒于一体的文库构建方法，该方法具有以下优点：
1.单碱基精确度高。
目前，基于抗体富集(hMeDIP-Seq)和葡糖基修饰富集(hMe-Seal化学标记法、JBP-1沉淀法和GLIB沉淀法)来评估5hmC水平的检测方法存在一定缺陷，即较难准确定量，无法达到单碱基分辨率效果。ACE-seq酶转化方法虽可利用APOBEC3A脱氨酶达到单碱基精确度的效果，却因处理对象为全基因组所有DNA而转化率不足。而本发明仅对捕获后含有5hmC的基因组DNA进行APOBEC3A酶脱氨处理，在提高转化率的基础上还能减小化学转化法对DNA片段的损伤，从而在相同样本投入量下获得更高产量的文库。
2.低测序数据量可以满足较高的测序深度。
全基因组中羟甲基化胞嘧啶的平均水平约为胞嘧啶的1％，但基于亚硫酸氢盐的TAB-Seq、OxBS-Seq以及基于APOBEC3A脱氨酶的ACE-seq检测方法虽可达到全基因组5hmC单碱基分辨率要求，却需要极大的测序数据量和测序成本。本发明通过对糖基化的5hmC进行生物素标记后，利用链霉亲和素磁珠进行特异性捕获，仅将含有5hmC的DNA片段pull down，15Gb测序数据便可达到30×，减少80％以上的测序成本。
3.适用于常规双链建库试剂盒。
近年来，评估5hmC水平的检测方法无法同时满足单碱基精确度和低测序数据量的要求，直至2021年，出现的DIP-CAB-Seq检测方法可同时满足这两个指标，但该方法需使用单链建库试剂盒进行文库构建，这无疑降低了其方法的通用性还增加了建库成本。而本发明通过设计随机引物将脱氨后的单链DNA样本在Klenow Fragment作用下转化成双链DNA，后续进行常规双链建库即可，更具有普适性。
4.本发明提供的建库方法提高了数据可信度：
(1)假阳性一直是捕获实验的通病。通过标准品检测发现hMe-Seal捕获假阳性高达20％。根据一系列探索性实验证实，假阳性的产生主要源于无hmC位点的DNA片段缠绕在大分子DBCO-PEG3-S-S-Biotin、捕获的核酸片段以及捕获磁珠上。本发明通过以下操作方法将捕获假阳性率降至1.5％左右。
为了降低捕获的假阳性率，发明人采用如下技术手段：将DNA的打断流程设置到点击化学反应(加DBCO-PEG3-S-S-Biotin)之后、5hmC片段化DNA捕获之前，利用超声波将缠绕在DBCO-PEG3-S-S-Biotin上的非捕获片段震荡游离，并通过磁珠纯化将非捕获片段去除，从而降低非捕获片段产生的假阳性率。
在用链霉亲和素修饰修饰磁珠对含有5hmC片段化DNA进行捕获捕获洗脱时，在用1×B&W Buffer清洗磁珠后，增加一步水洗，尽可能将与磁珠捕获的DNA片段缠绕的非捕获片段洗脱去除，从而进一步降低非捕获片段产生的假阳性率。
在进行文库扩增前先利用还原剂对DBCO-PEG3-S-S-Biotin分子中的二硫键“切割”作用去除磁珠，进一步去除缠绕在磁珠上的非捕获片段。从而进一步降低非捕获片段的假阳性率。
(2)对捕获后的DNA片段进行APOBEC3A脱氨酶处理：
仅对含有hmC位点的片段进行APOBEC3A脱氨酶处理，有助于提升非羟甲基化胞嘧啶位点的转化效率。
(3)本发明提供的建库方法能够有效增加测序深度，能将测序深度提高到60×(30G左右，远低于ACE-seq)，能够有效降低因测序深度导致的数据分析覆盖度不够的情况，且提升了单碱基检测精度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明整体流程图；
图2为Agilent 2100片段检测结果；
图3为不同单碱基精确度检测方法结果比较；
图4为DNA打断流程在前并使用甲基化修饰接头所建文库的hmCG位点一致性结果比较；
图5为不同方法所检测mCG和hmCG位点数统计结果图；
图6为本发明提供的CACE-seq方法与ACE-seq检测方法结果比较图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《当代分子生物学方法(Current Protocolsin Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
试剂配制：
1×B&W Buffer的主要成分包括Tris-HCl(pH 7.5)、EDTA和NaCl，且浓度分别为5mM，0.5mM和1M。
2×B&W Buffer的主要成分包括Tris-HCl(pH 7.5)、EDTA和NaCl，且浓度分别为10mM，1mM和2M。
实施例1
本实施例提供了一种小鼠脑组织样本羟甲基化修饰单碱基精确度捕获文库构建方法(CACE-seq)。流程图参照图1所示。
运用商业化的组织样本提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kits，Qiagen，69504)提取基因组DNA。并使用Nanodrop、Qubit和1％琼脂糖凝胶电泳检测样本的浓度和完整性(260/280>1.8，260/230>1.7，主条带完整)。
1、5hmC标记反应：配制下表反应体系，并置于PCR仪器中37℃孵育2h。用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，24μLddH2O洗脱。
试剂 体积(μL)
DNA(500-1500ng) 34.25
1M HEPES 2.5
1M MgCl2 1.25
1mM UDP-N3-Glu 8
T4-βGT 4
Total volume 50
2、点击化学反应：将1μL 4.5mM DBCO-PEG3-S-S-Biotin加至5hmC标记反应产物中，37℃孵育2h。
3、带biotin产物纯化：向点击化学反应完成后的混合液中加入ddH2O补至50μL，用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，50μL ddH2O洗脱。
4、DNA片段化：使用QSONICA打断仪将DNA打断38min。
5、片段化产物纯化：用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，25μLddH2O洗脱。
6、5hmC片段化DNA捕获：取5μL重悬好的链霉亲和素磁珠于新PCR管中，磁吸，弃上清后，用5μL 1×B&W Buffer清洗磁珠3遍。向清洗后的磁珠中加入25μL 2×B&W Buffer以及25μL纯化后的DNA，混匀，室温孵育30min。
7、捕获产物洗涤：孵育完成后，磁吸，弃上清，并用50μL 1×B&WBuffer清洗磁珠3遍随后用100μL ddH2O清洗磁珠1遍。
8、DTT还原反应：用20μL DTT重悬磁珠，25℃、900rpm孵育70min；磁吸，转移上清液于新PCR管后，再加入30μL ddH2O补至50μL。用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，16μL ddH2O洗脱。
9、APOBEC酶脱氨反应：向每个DNA样本(16μL)中添加4μL甲酰胺，85℃下变性至少10min；再将下表试剂加入变性好的样本中，37℃、孵育3h。
试剂 体积(μL)
Nuclease-free water 67
10×APOBEC Reaction buffer 10
BSA 1.5
APOBEC 1.5
10、脱氨产物纯化：使用Zymo Oligo Clean and Concentrator Kit纯化和浓缩上步反应产物，15μL ddH2O洗脱。
11、双链转化反应：加入下表试剂，95℃孵育5min后，迅速将PCR管置于4℃或冰上冷却5min；再加入1μL Klenow Fragment，37℃反应1h。
试剂 体积(μL)
DNA 12.25
10×Klenow Buffer 2.5
Random Primer 2
Solution I(100×) 0.25
10mM dNTP 2
Total volume 19
12、双链转化反应产物纯化：加ddH2O补至50μL体系。用1.8×Hieff NGS DNASelection beads纯化，25μL ddH2O洗脱。
13、双链DNA片段末端修复和3′端加A反应：使用商业化的双链文库构建试剂盒(Sangon,N608380)进行末修和加A。反应体系如下表，反应温度和时间为30℃、20min，72℃、20min。
试剂 体积(μL)
Converted dsDNA 25
Endprep Buffer 3
Endprep enzyme 2
Total volume 30
14、接头连接：按下表配制接头连接反应体系，反应温度和时间为20℃、30min。反应后，用0.6×Hieff NGS DNA Selection beads纯化，50μL ddH2O洗脱。
试剂 体积(μL)
Suspend DNA 30
Fast Ligation Buffer 15
Fast Ligase 2.5
Short Adaptor 1.2
ddH2O to Total volume 50
接头序列如下：
SEQ ID NO.1：
5′-Phos-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT*C-3′
SEQ ID NO.2：
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
15、接头产物分选：用0.7×和0.2×Hieff NGS DNA Selection beads进行双选，最后用13μL ddH2O洗脱。
16、文库扩增：向分选后的接头产物中加入15μL 2×Hot Start PCR mix和2μLUDI Adaptor，充分混匀后按以下程序进行扩增反应：
Figure BDA0004076322170000161
17、文库纯化：文库PCR后加入ddH2O补至50μL，用0.9×Hieff NGS DNA Selectionbeads纯化，16μL ddH2O洗脱。
18、文库质控及测序：文库构建后，用Qubit检测文库浓度，并通过2％的琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测文库片段范围。质检合格后上Illumina测序仪测序。质检结果参照图2所示，结果显示：文库条带为单一主峰，且范围在250-450bp，可上机进行测序反应。
对比例1
本对比例提供了小鼠脑组织样本羟甲基化修饰单碱基精确度文库的构建方法(ACE-seq)。与实施例1相比，区别在于：本对比例先打断，而后标记、脱氨反应，且不涉及5hmC片段化DNA捕获步骤。
运用商业化的组织样本提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kits,Qiagen，69504)提取基因组DNA。并使用Nanodrop、Qubit和1％琼脂糖凝胶电泳检测样本的浓度和完整性(260/280>1.8，260/230>1.7，主条带完整)。
1、DNA片段化：使用QSONICA打断仪将DNA打断38min。
2、5hmC标记反应：配制下表反应体系，并置于PCR仪器中37℃孵育2h，补水至50μL。用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，16μL ddH2O洗脱。
试剂 体积(μL)
DNA(100ng) 15.6
10×Cutsmart Buffer 2.0
UDP-Glucose(2mM) 0.4
T4-βGT(10U/μL) 2.0
Total volume 20
3、APOBEC酶脱氨反应：向每个DNA样本(16μL)中添加4μL甲酰胺，85℃下变性至少10min；再将下表试剂加入变性好的样本中，37℃、孵育3h。
Figure BDA0004076322170000171
Figure BDA0004076322170000181
4、脱氨产物纯化：使用Zymo Oligo Clean and Concentrator Kit纯化和浓缩上步反应产物，15μL ddH2O洗脱。
5、双链转化反应：加入下表试剂，95℃孵育5min后，迅速将PCR管置于4℃或冰上冷却5min；再加入1μL Klenow Fragment，37℃反应1h。
试剂 体积(μL)
DNA 12.25
10×Klenow Buffer 2.5
Random Primer 2
Solution I(100×) 0.25
10mM dNTP 2
Total volume 19
6、双链转化反应产物纯化：加ddH2O补至50μL体系。用1.8×Hieff NGS DNASelection beads纯化，25μL ddH2O洗脱。
7、双链DNA片段末端修复和3′端加A反应：使用商业化的双链文库构建试剂盒(Sangon,N608380)进行末修和加A。反应体系如下表，反应温度和时间为30℃、20min，72℃、20min。
试剂 体积(μL)
Converted dsDNA 25
Endprep Buffer 3
Endprep enzyme 2
Total volume 30
8、接头连接：按下表配制接头连接反应体系，反应温度和时间为20℃、30min。
试剂 体积(μL)
Suspend DNA 30
Fast Ligation Buffer 15
Fast Ligase 2.5
Short Adaptor 1.5
ddH2O to Total volume 50
接头序列如下：
5′-Phos-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT*C-3′
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
反应后，用0.6×Hieff NGS DNA Selection beads纯化，50μLddH2O洗脱。
9、接头产物分选：用0.7×和0.2×Hieff NGS DNA Selection beads进行双选，最后用13μL ddH2O洗脱。
10、文库扩增：向分选后的接头产物中加入15μL 2×Hot Start PCR mix和2μLUDI Adaptor，充分混匀后按以下程序进行扩增反应：
Figure BDA0004076322170000191
11、文库纯化：文库PCR后加入ddH2O补至50μL，用0.9×Hieff NGS DNA Selectionbeads纯化，16μL ddH2O洗脱。
12、文库质控及测序：文库构建后，用Qubit检测文库浓度，并通过2％的琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测文库片段范围。质检合格后上Illumina测序仪测序。
对比例2
DNA打断在前的小鼠脑组织样本羟甲基化修饰单碱基精确度捕获文库的构建方法(类似于DIP-CAB-Seq)。与实施例1相比，先进行DNA片段化、双链的末端修复、加A和接头(修饰接头)连接，标记、点击化学、捕获和脱氨反应在后。
1、基因组DNA提取、纯化以及检测：使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGENGermantown,MD)试剂盒对小鼠脑组织进行提取与纯化；使用Qubit、Nanodrop(A260/280≥1.8和260/230≥1.7)以及1％琼脂糖凝胶电泳跑胶(单一条带)检测样本DNA浓度和质量。
2、DNA片段化：使用QSONICA打断仪将DNA打断38min。
3、双链DNA片段末端修复、3′端加A：使用试剂盒(NEB#E7120L)进行文库构建，按下表配制反应体系，反应温度和时间为20℃、30min，65℃、30min。
试剂 体积(μL)
Fragmented DNA 50
NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 7
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3
Total volume 60
4、接头连接：按下表配制接头连接反应体系，反应温度和时间为20℃、15min。反应后，用110μL NEBNext Sample Purification Beads纯化，35μL ddH2O洗脱。
试剂 体积(μL)
End repaired/dA-tailing DNA 60
NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30
NEBNext Ligation Enhancer 1
NEBNext EM-seq Adaptor 2.5
Total volume 93.5
5、5hmC标记反应：配制下表反应体系，并置于PCR仪器中37℃孵育2h。用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，24μLddH2O洗脱。
试剂 体积(μL)
DNA(500-1,500ng) 34.25
1M HEPES 2.5
1M MgCl2 1.25
1mM UDP-N3-Glu 8
T4-βGT 4
Total volume 50
6、点击化学反应：将1μL 4.5mM DBCO-PEG3-S-S-Biotin加至5hmC标记反应产物中，37℃孵育2h。
7、带biotin产物纯化：向点击化学反应完成后的混合液中加入ddH2O补至50μL，用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，25μL ddH2O洗脱。
8、5hmC片段化DNA捕获：取5μL重悬好的链霉亲和素磁珠于新PCR管中，磁吸，弃上清后，用5μL 1×B&W Buffer清洗磁珠3遍。向清洗后的磁珠中加入25μL 2×B&W Buffer以及25μL纯化后的DNA，混匀，室温孵育30min。
9、捕获产物洗涤：孵育完成后，磁吸，弃上清，并用50μL 1×B&W Buffer清洗磁珠3遍和100μL ddH2O清洗磁珠1遍。
10、DTT还原反应：用20μL DTT重悬磁珠，25℃、900rpm孵育70min；磁吸，转移上清液于新PCR管后，再加入30μL ddH2O补至50μL。用1.5×Hieff NGS DNA Selection beads磁珠纯化，16μLddH2O洗脱。
11、APOBEC酶脱氨反应：向每个DNA样本(16μL)中添加4μL甲酰胺，85℃下变性至少10min；再将下表试剂加入变性好的样本中，37℃、孵育3h。
试剂 体积(μL)
Nuclease-free water 67
10×APOBEC Reaction buffer 10
BSA 1.5
APOBEC 1.5
12、脱氨产物纯化：用1×NEBNext Sample Purification Beads纯化脱氨产物，并用20μL ddH2O洗脱。
13、文库扩增：按下表反应体系和程序进行扩增反应：
Figure DA00040763221757645822
Figure BDA0004076322170000211
Figure BDA0004076322170000221
14、文库纯化：用0.9×NEBNext Sample Purification Beads纯化扩增产物，并用21μLddH2O洗脱。
15、文库质控及测序：文库构建后，用Qubit检测文库浓度，并通过2％的琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测文库片段范围。质检合格后上Illumina测序仪测序。
实验例1
为验证本发明方法的检测效果，我们将同一DNA样本分别在两家不同的生物检测公司进行WGBS、OxBS、EM-seq、hMe-Seal和ACE-seq检测。根据WGBS、OxBS和EM-seq的测序结果计算得到所检测样本DNA中mCG(CG双核苷酸中的C被甲基化修饰之后形成的mCG)与hmCG(Tet酶蛋白家族成员进一步将甲基化修饰过的胞嘧啶转换成羟甲基胞嘧啶)位点比值约为4:1，分别约有30,650,630个mCG位点和7,662,657个hmCG位点(图5)，这与文献报道结果相符。
但两家不同生物公司使用ACE-seq检测方法检测到的hmCG位点数目均在20,000,000左右，假阳性率超过50％，这种通过标准品转化率无法真实反应的超高假阳性的存在可能源于测序深度低或APOBEC3A脱氨酶位点偏好性。
通过与EM-seq数据进行比较发现，使用ACE-seq方法检测到的hmCG假阳性位点多数为CpG上未脱氨的甲基化胞嘧啶(图3中A所示)。
本发明方法通过使用UDP-N3-Glu糖基化保护、Biotin标记以及链霉亲和素磁珠捕获后将需要APOBEC3A脱氨转化的总CpG位点数减少到51.84％，转化率也由56.82％提高到90.65％(图6)；捕获区域一致性高达82.33％-92.06％(图3中B)，捕获到的hmCG位点数更加接近理论值，假阳性率降至15％甚至更低(图3中C，不能保证非一致性位点为假阳性位点)，有效减少了后续验证实验的试错时间和成本。
DNA打断流程在前并使用甲基化修饰接头所建文库的hmCG位点一致性比较结果参照图4所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，其内容包括如下步骤：
5hmC标记反应；点击化学反应；样本DNA片段化；通过磁珠将片段化产物纯化；5hmC片段化DNA捕获；洗涤捕获产物；还原反应；APOBEC酶脱氨反应；脱氨产物的纯化；双链转化反应；末端修复和3′端加A反应；接头连接；连接产物纯化与双分选；文库扩增；文库纯化；
所述5hmC标记反应是指采用糖基化标记体系对基因组DNA上的5hmC进行标记；
所述点击化学反应是将DBCO-PEG3-S-S-Biotin与5hmC标记的反应产物进行混合反应；
所述样本DNA片段化是采用超声波对样本DNA进行片段化；
所述5hmC片段化DNA捕获是采用链霉亲和素磁珠对片段化了的含有5hmC的DNA进行捕获；
所述洗涤捕获产物包括：采用Buffer清洗磁珠3次后用ddH2O清洗磁珠1-3次；
所述APOBEC酶脱氨反应是将未糖基化标记的C和5mC脱氨为U；
所述双链转化反应是采用Klenow Fragment将纯化后的脱氨产物转化为双链DNA。
2.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述5hmC标记反应的反应体系包括：UDP-N3-Glu、基因组DNA、HEPES、MgCl2、T4-β-葡糖基转移酶(T4 Phageβ-glucosyltransferase，βGT)，所述5hmC标记反应是在35-37℃孵育1-2h。
3.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述点击化学反应中，所述DBCO-PEG3-S-S-Biotin与5hmC标记的反应产物的体积比为1:20-24；所述点击化学反应是在35-37℃孵育1-2h；
优选地，所述DBCO-PEG3-S-S-Biotin的浓度为4-4.5mM。
4.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述样本DNA片段化过程中，DNA样本的片段化时间为15-38min；
优选地，所述片段化时间为35-38min，片段化后的片段范围为200-500bp。
5.根据权利要求4所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述5hmC片段化DNA捕获包括：向片段化的基因组DNA中加入经Buffer清洗并重悬后的链霉亲和素磁珠，混匀后室温孵育20-30min以进行5hmC片段化DNA的捕获。
6.根据权利要求5所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述Buffer中包含Tris-HCl、EDTA和NaCl；优选地，所述Buffer中包含10mMTris-HCl、1mM EDTA和2M NaCl。
7.根据权利要求6所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述还原反应包括：加入还原剂重悬磁珠，25-27℃、900-950rpm振荡孵育；
优选地，所述还原剂为DTT溶液。
8.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述APOBEC酶脱氨反应包括：向待脱氨处理的样本中加入甲酰胺进行变性，然后将变性后的DNA与APOBEC Reaction buffer、BSA、APOBEC以及ddH2O混合孵育；
优选地，所述孵育的条件为：35-37℃，孵育2-3h。
9.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述双链转化反应的反应体系包括：纯化后的脱氨产物、Klenow Buffer、Random Primers、Solution I和dNTPs；优选地，所述双链转化反应的条件包括：95-96℃孵育5min后，加入Klenow Fragment，37℃孵育60min。
10.根据权利要求1所述的全基因组DNA胞嘧啶羟甲基化修饰的单碱基精确度建库方法，其特征在于，所述接头连接的接头序列如SEQ ID NO.1-2所示。
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