CN116144781A - 用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒 - Google Patents

用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒。本发明提供了用于筛查肺腺癌的标记物miR‑4433a‑3p荧光定量PCR引物，单独使用血清miR‑4433a‑3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积AUC为0.9750；单独使用胸腔积液miR‑4433a‑3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积AUC为0.9375；单独使用血清miR‑4433a‑3p评估恶性肺结节患者术后临床效果差异显著。因此，血清miR‑4433a‑3p可以用于制备肺腺癌结节、及评估术后临床效果的诊断试剂盒，胸腔积液miR‑4433a‑3p也可以用于制备肺腺癌结节的诊断试剂盒。

Description

用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒。
背景技术
肺腺癌发病率逐年增长，已经成为NSCLC中最常见的亚型，几乎占全部肺癌的50％，且总体生存率较低。由于肺腺癌早期没有典型的临床表现，仅见孤立的肺结节，或者肺部病灶较小但存在恶性胸腔积液等并发症，此时发现时已是中晚期，难以得到有效治疗。而针对早期肺癌及胸腔积液的诊断及治疗可以明显提高患者的5年生存率。
虽然大部分肺结节为良性病变，仅需随诊，不需进一步治疗，但仍有相当数量的肺结节为早期恶性病变。但肺结节的定性诊断仍较困难，可能与恶性结节缺乏特异性表现有关。另外对于结节大于2cm的T1c期肺腺癌患者切除术后，肺癌复发率明显。如果能够有一种检测手段对肺腺癌患者可以早期诊断，评估手术切除的疗效，判断复发的可能性，可大大提高患者的生命质量。
据病因学，可将胸腔积液大致分为良性胸膜疾病与恶性疾病，肺腺癌胸膜转移在恶性胸腔积液中所占比例较大，患者预期寿命因胸腔积液的出现将显著缩短。胸膜活检是诊断胸膜病变的首选方法，但存在操作难度大，高风险，易产生气胸等并发症的缺点。而许多肿瘤标志物如肺表面活性蛋白A，癌胚抗原等都曾被用于肺腺癌恶性胸腔积液的鉴别诊断，但其敏感性及特异性都较低，难以满足临床的需要。
目前病理检查依旧是诊断肺腺癌的金标准。新版WHO肺肿瘤组织学以形态学为基础，对肺腺癌活检和细胞学小标本的病理诊断要求更加明确。因此，取得合格的病理组织对肺腺癌的早期诊断非常重要。当常规方法不能准确诊断时，应考虑更多侵入性的手术方法如纵隔镜、纵隔切开术、电视辅助胸腔镜手术、纤维支气管镜检查等。然而上述检查创伤大，费用高，检测周期长，部分操作对患者心肺功能要求高，从而限制了适应人群。
因此需要进一步探索一种新的生物标志物可在以提高肺腺癌的早期诊断。该生物标记物需满足：痛苦少，风险小，易操作，无创，快速，低成本，灵敏度、特异性高，可重复的特点。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的是提供一种用于检测肺腺癌的标记物，所述标记物为miR-4433a-3p，人源miR-4433a-3p的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二目的是提供一种用于检测肺腺癌标记物miR-4433a-3p的引物组，所述检测引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID NO：3所示；所述内参引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明的第三目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌结节的试剂盒中的应用。
本发明的第四目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌胸腔积液的试剂盒中的应用。
本发明的第五目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌术后评估的试剂盒中的应用。
本发明的第六目的是提供一种用于非诊断和治疗目的的检测上述的标记物miR-4433a-3p的方法，所述方法包括以下具体步骤：
步骤S1，血液样本或胸腔积液样本收集及处理；
步骤S2，采用trizol法提取总RNA；
步骤S3，RNA定量及逆转录；
步骤S4，miR-4433a-3p定量分析，包括定量实时qRT-PCR反应和数据分析。
进一步的，所述定量实时qRT-PCR法以U6为内参。
进一步的，所述miR-4433a-3p的PCR扩增体系总体积为20μL，包括PCR mix 10μL；引物0.8μL；ddH2O 3μL；已稀释的逆转录产物1μL。
进一步的，所述定量实时qRT-PCR的反应程序为预变性1次，95℃保持5min；循环反应40次，95℃保持10sec，60℃保持30sec；融解1次，95℃保持15sec，60℃保持60sec，95℃保持15sec。
进一步的，所述PCR扩增体系中所述检测引物的终浓度为0.2μM，所述内参引物的终浓度为0.2μM。
与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供了用于筛查肺腺癌的miR-4433a-3p荧光定量PCR引物，得到的引物对肺腺癌结节、肺腺癌胸腔积液的检测具有很好的敏感性和特异性。
(2)本发明提供了用于筛查肺腺癌的的试剂盒，以便于辅助检测肺腺癌的检测。
(3)本发明提供的方法单独使用血清miR-4433a-3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积(AUC)为0.9750；单独使用胸腔积液miR-4433a-3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积(AUC)为0.9375；单独使用血清miR-4433a-3p评估恶性肺结节患者术后临床效果差异显著。本领域技术人员知道，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。因此，血清miR-4433a-3p可以用于制备肺腺癌结节、及评估术后临床效果的诊断试剂盒，胸腔积液miR-4433a-3p也可以用于制备肺腺癌结节的诊断试剂盒。
附图说明
图1为本发明实施例1中的良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节对比血清中升高表达的miR-4433a-3p图；
图2为本发明实施例1中的血清miR-4433a-3p单独用于区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节的ROC曲线；
图3为本发明实施例2中的良性肺腺癌与恶性肺腺癌对比胸腔积液中升高表达的miR-4433a-3p图；
图4为本发明实施例2中的胸腔积液miR-4433a-3p单独用于区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节的ROC曲线；
图5为本发明实施例3中的血清miR-4433a-3p用于评估恶性肺腺癌结节术后临床效果的对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例为肺腺癌结节患者的血清中miR-4433a-3p标记物的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、血液样本收集及处理；
收集肺腺癌结节患者静脉血10mL，待凝血后，4度条件下，5000rpm离心10min，收集上清，之后再离心一次，重新收集上清，收集的上清即为血清样本。10mL静脉血收集血清体积约5mL，置于负20℃冰箱保存。
本实施例采集的患者血清样本来自于江苏省盐城市第一人民医院。
步骤S2、采用trizol法提取总RNA；
取200μL血清；每孔加入0.8μLTrizol(Trizol要预冷，避免降解RNA)，吹打混匀；每个EP管中加入200μL氯仿，剧烈振荡数秒，置于冰上5min，静置到看到明显分层；将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后吸取上层清液，一般可提取500μL；异丙醇1:1加入,上下颠倒混匀，置-20℃冰箱放置过夜。将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后轻柔弃上清，加入1ml 75％乙醇。将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后轻柔弃上清；将EP管倒置于空气中5min，使其干燥(注意不要过渡干燥沉淀，否则难以溶解)；每个EP管中加入20μL无酶水，使RNA溶解，测量其浓度。
步骤S3、茎环法逆转录
根据miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)MR101(Vazyme)试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA，保存在-80℃，具体操作过程如下：
(1)使用“Nanodrop”机器测定血浆外泌体中的RNA浓度：
打开取样臂，无尘纸清洁测量基座→吸取1微升(μL)DEPC水作为空白样品调零，滴加在测量基座表面→在软件中点击“空白”进行调零→调零完成后，使用无尘纸拭去基座和取样臂上的液滴，吸取1μL待测RNA样品，滴加在测量基座表面→在软件中点击“检测”测定样品RNA浓度，记为c(ng/μL)。
(2)逆转录反应体系配置：
每个反应使用100-200ng总RNA进行逆转。例如，使用200ng总RNA进行逆转，RNA模板体积x＝200/c；
(2.1)基因组DNA去除
反应体系为：RNase-free To 10μl
5XgDNA Wiper Mix 2μl
Total RNA 10pg-1μg。
反应程序为45℃，2min。
(2.2)第一链cDNA合成
反应体系为：RNase-free To 20μl
上一步的混合液10μl
Stem-loop primer(2μM)1μl
10X RT Mix 2μl
HiScript II Enzyme Mix 2μl
反应程序为：25℃，5min；50℃，5min；85℃，5min。
(2.3)反应结束后，逆转录产物(cDNA)为20μL，可置于-20℃保存，后用于后续Real-time PCR实验。
步骤S4、miR-4433a-3p定量及分析
使用Real-time PCR方法对血清中的miR-4433a-3p进行定量分析：
(1)引物：血清中miR-4433a-3p定量以U6为内参，目的miR-4433a-3p及U6引物使用，QIAGEN引物套餐，包括序列特异性的上游引物(Forward primer)以及通用的下游引物(Reverse primer)的混合物。
(2)PCR反应体系配置
按照表1所示配制PCR体系。
表1.
Figure BDA0004140033730000071
(3)PCR反应
水平离心机1000rpm离心10秒，将侧壁液体离心至孔底，使用Light CyclerRealTime PCR(Roche)机器进行荧光定量PCR。程序如下表2所示：
表2.
Figure BDA0004140033730000072
步骤S5、数据分析
(1)基于-△△Ct法分析基因模板量：
R＝待检基因模板量/内参基因模板量＝2^((-Ct待检)-(-Ct内参))＝2^(-△Ct)，这里的R值仅仅是每个待检样本与对应内参基因的比值差，实验组和对照组不具有可比性，因此对上面推导得到的所有样本和control组的2^(-△Ct)，均除以control组的2^(-△Ct)，即可得到2^(-△△Ct)。
(2)统计方法
使用GraphPad Prism 5(La Jolla,CA)软件分析实验数据，用“平均数±SEM”显示最终结果，使用未配对t检验对数据的统计学意义进行评估，结果分析中认为P<0.05为差异有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。根据ROC曲线下面积分析其灵敏度和特异性。
如图1所示，扩大样本量进行单独验证，利用实时定量PCR的方法，分别检测了其在20位良性肺结节患者和20位恶性肺结节患者血清中的表达情况，结果表明在恶性肺结节患者中呈现升高表达趋势，且与良性肺结节患者差异显著，故血清中的miR-4433a-3p可以作为区分良性肺结节和恶性肺结节的标记物。
如图2所示，为血清miR-4433a-3p用于区分恶性肺腺癌结节患者与良性肺腺癌结节患者的ROC曲线；AUC值为0.9750。
实施例2
本实施例为肺腺癌患者的胸腔积液中miR-4433a-3p标记物的检测方法，具体包括以下步骤：基本同实施例1，不同之处为：胸腔积液样本收集及处理:胸腔积液通过胸腔闭式引流术采集，且良恶性胸腔积液的确诊通过胸腔镜下胸膜活检或胸腔积液离心的细胞沉渣进行细胞学染色及免疫组化染色，均为本领域常见试验操作，在本发明中不做限定。
本实施例采集的患者胸腔积液样本来自于江苏省盐城市第一人民医院。
如图3所示，大样本量进行单独验证，利用实时定量PCR的方法，分别检测了其在12位良性肺腺癌患者和12位恶性肺腺癌患者的胸腔积液中的表达情况，结果表明在恶性肺结节患者中呈现升高表达趋势，且与良性肺结节患者差异显著，故胸腔积液中的miR-4433a-3p可以作为区分良性肺结节和恶性肺结节的标记物。
图4所示，为胸腔积液miR-4433a-3p用于区分恶性肺腺癌结节患者与良性肺腺癌结节患者的ROC曲线；AUC值为0.9375。
实施例3
本实施例为恶性肺腺癌结节患者术前和术后采集的血清中miR-4433a-3p标记物的检测方法，具体包括以下步骤：基本同实施例1。
本实施例采集的恶性肺腺癌结节患者术前和术后的血清本来自于江苏省盐城市第一人民医院。
数据统计方法为：使用GraphPad Prism 5(La Jolla,CA)软件分析实验数据，用“平均数±SEM”显示最终结果，使用配对t检验对数据的统计学意义进行评估，结果分析中认为P<0.05为差异有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
结果如图5所示，大样本量进行单独验证，利用实时定量PCR的方法，分别检测了12位恶性肺腺癌结节患者术前和术后的血清中的miR-4433a-3p表达情况，恶性肺腺癌结节患者血清miR-4433a-3p含量术前高于术后，差异有统计学意义(p＜0.0195)，故miR-4433a-3p可以用来评估恶性肺腺癌结节患者术后临床效果。
本领域技术人员知道，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。因此，血清miR-4433a-3p可以用于制备肺腺癌结节、肺腺癌胸腔积液及评估术后临床效果的诊断试剂盒。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肺腺癌的标记物，其特征在于，所述标记物为miR-4433a-3p，人源miR-4433a-3p的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种用于检测肺腺癌标记物miR-4433a-3p的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测引物对和内参引物对，所述检测引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述内参引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌结节的试剂盒中的应用。
4.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌胸腔积液的试剂盒中的应用。
5.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌术后评估的试剂盒中的应用。
6.一种用于非诊断和治疗目的的检测如权利要求1中所述的标记物miR-4433a-3p的方法，其特征在于，所述方法包括以下具体步骤：
S1、血液样本或胸腔积液样本收集及处理；
S2、采用trizol法提取总RNA；
S3、RNA定量及逆转录；
S4、miR-4433a-3p定量分析，包括定量实时qRT-PCR反应和数据分析。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定量实时qRT-PCR法以U6为内参。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，miR-4433a-3p的PCR扩增体系总体积为20μL，包括PCR mix 10μL；引物0.4μL；ddH2O 3μL；已稀的逆转录产物1μL。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述定量实时qRT-PCR的反应程序为预变性1次，95℃保持5min；循环反应40次，95℃保持10sec，60℃保持30sec；融解1次，95℃保持15sec，60℃保持60sec，95℃保持15sec。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系中所述检测引物的终浓度为0.2μM，所述内参引物的终浓度为0.2μM。
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