CN116144656A - 金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

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刘卫今
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Abstract

本发明公开了一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，涉及生物技术领域，所述特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了包含LjC3H1基因组织特异性启动子的表达盒、重组载体以及宿主细胞。具有驱动或调控LjC3H1基因表达进一步高产绿原酸的作用。

Description

金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用。
背景技术
金银花(Lonicerajaponica Thunb.)又名忍冬，为忍冬科忍冬属植物，是亚洲国家广泛使用的一种药用植物。金银花具有抑菌、抗病毒、解热、止血、抗氧化、降血脂、免疫调节等作用，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症。目前已从金银花中发现200多种化合物，绿原酸(chlorogenic acids)是金银花的主要药效成分，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。2020版药典规定，金银花为忍冬(L.japonica)的干燥花蕾或带初开的花，绿原酸含量不得少于1.5％。金银花不仅由于品种差异导致绿原酸含量差异较大，而且由于受环境因子影响，同一品种在同一时期不同地域、或是同一地域不同年份其绿原酸含量变化较大，正品金银花常常容易被误判为伪品。因此，有效提高和稳定绿原酸含量是金银花育种和栽培中面临的重大难题。
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，苯丙氨酸解氨酶(PAL)，肉桂酸-4-羟化酶(C4H)与4-羟基桂皮酰辅酶A连接酶(4CL)是最初三步反应的关键酶。在这三种酶的作用下，苯丙氨酸转化为肉桂酸，后者再转化生成香豆酰辅酶A，此后主要途径有两条：第一条是香豆酰奎宁酸途径，香豆酰奎宁酸在香豆酸羟基化酶(C3H)的作用下生成绿原酸；第二条途径是香豆酰莽草酸途径，香豆酰莽草酸在C3H作用下生成咖啡酸莽草酸，继而在羟基化肉桂酰辅酶A/奎宁酸羟化肉桂酰基转移酶(LJC3H1)作用下酯化生成绿原酸，可看出C3H在两条途径中都起着重要的作用。
启动子是调控基因转录与表达的主要组件，其与RNA聚合酶准确结合后决定基因表达起始。启动子包含与转录因子相结合作用元件，与转录因子共同调控基因的表达，在植物适应环境和生长发育中起重要的调控作用。植物中的启动子据其对基因的调控方式与表达部位特点，可以分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种不同类型。不同物种、不同类型的启动子差异性极为明显。随着基因组分析技术的不断完善，人类通过基因工程调控手段提高农作物产量、有效成分含量及提高对逆境的抵抗力已成为了可能。在金银花育种中，虽然在转基因技术方面不断取得了重大突破，但由于发掘的优异基因启动子极少，严重限制了有效成分合成相关基因表达调控的研究与应用。
因此，发掘金银花启动子，并对其功能进行研究，在金银花有效成分合成相关基因表达调控方面具有重要的经济价值和应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种金银花LjC3H1基因上游的启动子，并对其进行功能分析，可为提高金银花绿原酸含量的育种实践提供重要的启动子序列资源。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，所述特异性启动子的核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列；
(3)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
本发明还提供一种表达盒，含有上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
本发明还提供一种重组载体，含有上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
本发明还提供一种含有上述组织特异性启动子或上述表达盒或上述重组载体的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌、藻类和真菌宿主细胞。
本发明还提供一种在金银花中驱动或调控LjC3H1基因表达的方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
本发明还提供一种驱动或调控金银花绿原酸代谢的方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
本发明还提供一种高产绿原酸的转基因金银花生产方法，包括将LjC3H1基因有效连接至上述的组织特异性启动子，或将上述表达盒或上述重组载体导入金银花植株中。
本发明还提供上述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子在金银花育种中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为构建的pLjC3H1::GUS表达载体图谱；
图2为转基因拟南芥抗Basta筛选；
图3为转基因拟南芥GUS检测；
图4为转基因水稻GUS检测；
图5为转基因拟南芥不同组织蛋白浓度；
图6为转基因拟南芥不同组织GUS活性定量测定。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子及其应用，所涉及的试剂或方法，如无特殊提及均为常规试剂或方法，对其不做具体限定。
实施例1
1.金银花LjC3H1基因启动子的获得
染色体步移技术克隆得到金银花LjC3H1基因启动子序列：
(1)构建连有接头序列的GenomeWalker文库
采用CTAB法提取金银花基因组DNA，并进行纯化，DNA分别采用带有接头的GenomeWalkerAdaptorBamHI、EcoRI、NdeI和XhoI四种限制性内切酶酶切。
(2)PCR扩增
采用巢式PCR的方法进行扩增，第一次PCR使用外侧接头引物(AP1:5'-AAATGTAGACCGTGCTGT-3'，SEQ ID NO.2)以及金银花外侧基因特异引物(GSP1：5'-ACCGCCTCCATCAAGCTGCACAC CG-3'，SEQ ID NO.3)，PCR产物经过稀释，并作为第二次PCR的模板。第二次PCR使用(AP2：5'-TAATACGGTAAGGTGTACTAG TTCA-3'，SEQ ID NO.4)和(GSP2：5'-ATACGCTTCTCTAATCG CCGTGACC-3'，SEQ ID NO.5)进行扩增。通过克隆、测序、序列组装，获得LjC3H1启动子序列，最后以金银花基因组DNA为模板，以(P3F：5'-TAATGTATCAATTGTAGAGTATATT-3'，SEQ ID NO.6)和(P3R：5'-TGAGACCATCCCTTGGGAGATTTTG-3'，SEQ IDNO.7)为引物进行PCR扩增。
(3)PCR产物回收测序
PCR产物电泳分析后采用天根生物科技有限公司的试剂盒回收，并按照宝生物工程有限公司的pMD18-T Vector载体连接试剂盒进行连接，将目标DNA片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，通过蓝白斑筛选后，挑选阳性克隆，提取质粒，并进行酶切鉴定后，再将阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得LjC3H1基因启动子序列，共2340bp，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.金银花LjC3H1启动子序列分析
利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析系统对HLjC3H1启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行分析。金银花LjC3H1启动子启动子的顺式作用元件大部分为参与类黄酮合成、花粉发育、花瓣扩张和小孢子释放期等相关的顺式作用元件，结果表明，该启动子上含有丰富的顺式作用元件，可能受到多种转录因子的调控，可能参与植物类黄酮合成及花开放相关的响应。
实施例2、LjC3H1启动子功能分析
1.GUS表达载体构建
采用双酶切法(SpeI和SacI)从修改后的pCAMBIA1301载体上切除35S启动子，回收不含35S启动子的pCAMBIA1301载体片段。根据金银花LjC3H1启动子序列设计分别含有SpeI的酶切位点(ACT AGT)及SacI的酶切位点(GAGCTT)的引物(引物对为5｀－TAATGTATCAATTGTAGAGTATATT－3｀，SEQ ID NO.8和5｀－ACTCA AGTGTTCTACTATGTTTGTA－3｀,SEQID NO.9)，PCR产物回收后限制性内切酶酶切，将酶切产物连接到不含35S启动子的pCAMBIA1301载体片段，即构建成LjC3H1启动子的报告基因GUS表达载体pLjC3H1::GUS(参见附图1)。
2.农杆菌感受态的制备
挑取保存于-80℃的EHA105农杆菌菌种，接种到利福平抗性的YEB(含利福平1mg/ml)琼脂培养基上，28℃，200rpm振荡培养2-3d。挑取单菌落接种到20ml利福平抗性的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养16hr。吸取2ml菌液接种于200ml(按照1:100的比例将活化)利福平(1mg/ml)抗性的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养3-5hr，至OD600约0.5。菌液置冰上10min，4℃5000rpm离心5min收集菌体。轻轻地用10ml预冷的10％的甘油将菌体细胞重悬。冰浴10min，4℃，5000rpm离心5min，去上清，重复一次。再次加入5ml预冷的10％的甘油重悬菌体细胞，分装(每管100μl)，液氮速冻，保存-80℃。
3.表达载体pLjC3H1::GUS转化农杆菌
利用质粒电击转化法将pLjC3H1::GUS载体转入农杆菌EHA105中。从-80℃冰箱取出农杆菌感受态，置于冰上融化，取30μl感受态细胞，向其中加入0.5μl质粒DNA，充分混合，将混合液转移到预冷的清洗干净的电击杯小槽内，采用电击仪进行电击转化。将电击后的混合液迅速转移至装有900μl YEB液体培养基的1.5ml的离心管中，28℃，5000rpm振荡培养2-3hr，8000rpm离心2min,收集菌体，将菌体涂布于同时具有利福平抗性(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)抗性的YEB固体培养基上，采用基因特异引物进行PCR检测，鉴定阳性克隆。
4.表达载体pLjC3H1::GUS转化植物
(1)表达载体pLjC3H1::GUS转化拟南芥
利用花侵染法将制备的农杆菌侵染拟南芥。将检测有表达载体质粒的农杆菌于YEB固体平板上划线培养培养2-3d。然后配制AAM转化液100mL，再用接种针环挑取培养好的农杆菌接种到AAM液体培养基150rpm振荡培养30min。最后，选取生长活力好的始开花的拟南芥植株进行转化，用AAM转化液浸泡待开放的花蕾，其间摇动2-3次，将浸泡后的花蕾用无菌滤纸吸干液体，放于28℃下暗培养培养3d，采用抗Basta方法连续筛选2次，获得转基因拟南芥植株(参见附图2)，收获T0代种子。对收获的T0代种子进行表面消毒，然后均匀撒于含抗生素潮霉素1/2MS平板上，春化处理3天后移入人工气候室生长，萌发8天，子叶深绿色的植株即为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种，每株收取的种子继续抗生素(潮霉素)筛选，将后代分离比为3：1(阳性：阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经抗生素(潮霉素)筛选可以得到纯系T3代转基因种子。
(2)表达载体pLjC3H1::GUS转化水稻
愈伤组织诱导：以NB基本培养基为诱导培养基+2，4-D(2.5mg/L)，培养条件参照Nishimura等[135](2007)采用的条件：32℃高温，持续光照，7d左右就可得到疏松膨大的愈伤组织，此时正适合转化。
转化:首先将检测有表达载体质粒的农杆菌于YEB固体平板上划线培养培养2-3d。然后配制AAM转化液30mL，再用接种针环挑取培养好的农杆菌接种到AAM液体培养基150rpm振荡培养30min。最后，选取生长活力好的愈伤组织进行转化，转化时参照Ozawa等[136](2009)的转化方法：用AAM转化液浸泡愈伤组织10min，其间摇动2-3次，将浸泡后的愈伤组织用无菌滤纸吸干液体，放于25℃下的MS培养基上共培养3d。
脱菌及筛选：愈伤组织与农杆菌共培养后，先用无菌水冲洗4-5次，再用500mg/L的羧苄青霉素灭菌(摇床200rpm，15min)，最后用无菌滤纸吸干愈伤表面的液体，再置于潮霉素(30mg/L)筛选培养基上筛选20d左右，其间每10d更换培养基一次。
分化：将抗性愈伤转移到分化培养基，分化20d左右，每10d更换培养基一次。
生根：将分化出的小苗转移到生根培养基进行生根诱导，7d左右就可长出根系。
炼苗：在室内打开瓶盖，保鲜袋套于小苗上，炼苗7d左右。
移栽至大田：转基因苗转移至大田按常规进管理，抗除草剂筛选。
转基因植株的PCR鉴定，获得T0代种子。
采用CTAB法提取转基因水稻与野生型水稻基因组DNA，以AsRed基因特异引物进行PCR检测。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃后延伸5min。AsRed-F 5'-CCCTTCGCCTTC CACATCCT-3'，SEQ ID NO.10，AsRed-R 5'-TGTAGCACTTGCC CTTCTCCAC-3'，SEQ ID NO.11。
5.转基因植物材料GUS染色
GUS染色液配制：首先用DMSO配制50mg/ml的X-Gluc贮存液，然后配制GUS漂洗液：磷酸钠、亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合液，浓度分别为：50mM磷酸钠缓冲液、0.5mM亚铁氰化钾K4Fe(CN)6(pH7.2)、0.5mM的铁氰化钾K3Fe(CN)6的。最后配制染色液：5ml漂洗液+100μlX-Gluc贮存液。
GUS染色：
将叶片、花丝、子房、花瓣、顶芽及腋芽等组织剪成小片，置于1.5ml离心管中，加入预冷的90％丙酮漂洗10分钟，冰上放置25min去除部分叶绿素，然后用配制好的GUS染色工作液完全覆盖植物组织，用真空泵抽气直到材料沉于离心管底部，锡箔纸遮光过夜。分别用50％,75％和95％乙醇进行梯度洗脱，每次轻摇5分钟。显微镜下观察拍照(参见附图3和附图4)。
将不同的pLjC3H1::GUS拟南芥纯系进行GUS染色分析表明，转基因拟南芥T3代不同株系间GUS组织特异性表达部位基本一致，且T3-6表达量最高。因此，以T3-6作为后续实验材料。将转基因拟南芥T3-6种植于1/2MS培养基上，取幼苗期和开花期的拟南芥做GUS染色，观察其组织特异性表达，表明LJC3H1启动子驱动的GUS在拟南芥花瓣、花柱、花丝、顶芽及腋芽中特异的高表达；在转基因水稻中顶芽有表达，但根中没有表达。
6.转基因植物材料GUS活性检测
(1)GUS定量检测溶液配制
0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)：1mol/LNa2HPO4取5.77ml，1mol/LNaH2PO4取4.23ml，定容至100ml(1mol/LNa2HPO4溶液：35.814gNa2HPO4溶于100ml水；1mol/LNaH2PO4溶液：15.601gNaH2PO4溶于100ml水)。
10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。
0.5MEDTA(PH8.0)：在80ml水中加入18.61gNa2EDTA·2H2O，用NaOH调PH至8.0(约需2g左右的固体NaOH)，溶解后定容至100ml。
GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)取50ml；10％SDS取1ml；0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；TritonX-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。
MUG底物：称8.8mgMUG，溶于10mlGUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
反应终止液(0.2mol/LNa2CO3)：称2.12Na2CO3，用水定容到100ml。
考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G25010mg,95％乙醇5m1,H3PO410ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。
1mg/mlBSA：20mgBSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。
(2)蛋白的提取及浓度测定
取拟南芥不同组织样品各100mg左右，于液氮中充分研磨成粉末，将粉末转到1.5毫升离心管，速度加入0.5ml的GUS提取缓冲液，旋涡混匀。4℃下11000rpm离心8min，上清于4℃下保存。
蛋白浓度的测定：分别吸取0μl、1μl、3μl、5μl、10μl、15μl的BSA标准液于1.5毫升离心管，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰浴10min，分别测定595nm处的吸收值。制作蛋白浓度与ABS595吸光值的标准曲线。分别取待测蛋白样品15μl，加水补至20μl，加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液，旋涡混匀，冰浴10min。用分光光度计测定595nm下的吸收值。求得蛋白样品的浓度，结果参见附图5，可知，拟南芥花和顶芽中表高，叶和根中表达低，且差异达到显著水平。
(3)GUS定量检测步骤
标准曲线的制备：用反应终止液将MU配置成浓度范围在0-10uM范围内的标准液，测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
取不同组织待测样品蛋白100μl加入700μl GUS酶提取液，37℃恒温培养箱保温10min，加入200μl 5Mm的MUG，混匀后取200uL，迅速加800uL终止液终止反应，记录酶促反应0点。分别于37℃反应10min、15min、20min、35min、30min和45min分别取出200uL反应液，加入800uL终止液终步反应，锡泊纸避光保存。采用荧光分光光度法，分别于激发波长365nm、发射波长455nm下测定不同反应时间段的荧光值。结果如附图6所示，不同组织GUS活性均有显著性差异，这和组强化学染色结果基本吻合，花瓣和花丝中GUS活性高，顶芽和叶中GUS活性降低，茎和根中GUS活性极低。从结果可知，LjC3H1启动子是一个在花中高量表过的特异性表达启动子。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种金银花LjC3H1基因组织特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子的核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列；
(3)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，含有权利要求1所述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子。
4.一种含有权利要求1所述组织特异性启动子或权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自细菌、藻类和真菌宿主细胞。
5.一种在金银花中驱动或调控LjC3H1基因表达的方法，其特征在于，包括将LjC3H1基因有效连接至权利要求1所述的组织特异性启动子，或将权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体导入金银花植株中。
6.一种驱动或调控金银花绿原酸代谢的方法，其特征在于，包括将LjC3H1基因有效连接至权利要求1所述的组织特异性启动子，或将权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体导入金银花植株中。
7.一种高产绿原酸的转基因金银花生产方法，其特征在于，包括将LjC3H1基因有效连接至权利要求1所述的组织特异性启动子，或将权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体导入金银花植株中。
8.权利要求1所述金银花LjC3H1基因组织特异性启动子在金银花育种中的应用。
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