CN116144557A - 一种耐冷型反硝化硫单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种耐冷型反硝化硫单胞菌(Sulfurimonasdenitrificans)，命名为反硝化硫单胞菌LY‑2，已于2022年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24293。所述反硝化硫单胞菌LY‑2在低温环境中有较强的生长能力和高效的降解废水硝酸盐氮的能力，并且能适应很宽的温度区间，在5‑35℃内均表现出不俗的反硝化除氮微生物活性，因此该菌株是对现有反硝化菌的良好补充。本发明提供的菌株可有效缓解硫自养反硝化工艺低温下脱氮速率受限的问题，适合在秋冬季接种到反硝化反应池中维持出水总氮稳定。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别是一种耐冷型反硝化硫单胞菌及其应用。
背景技术
生活污水和工业废水的排放是导致水体中氮元素含量高的还原，而氮元素含量过高会造成水体富营养化。此外，当人们饮用的水中硝酸盐(NO3 -)含量超标时，NO3 -可在肠胃等器官的作用下转变为亚硝酸盐(NO2 -)，NO2 -会引起人体细胞突变，增加患癌症的风险。因此近年来城镇污水排放标准日益严格，要求总氮(TN)浓度不超过15mg·L-1。而针对低C/N比废水，采用传统异养反硝化工艺往往存在脱氮不彻底，出水含氮易超标的问题。为提高NO3 -去除率，污水厂通常选择向反硝化池内投加可生化性好的有机碳源，如乙酸钠、葡萄糖等，但有机碳源的大量消耗势必会增加水厂运行成本，且投加量不宜把控，会增加COD二次污染的风险。
硫自养反硝化因无需有机碳源、运行成本低、污泥产量少等优势而备受关注。硫自反硝化是在缺氧或厌氧条件下，微生物以还原性无机物(SO、S2-、S2O3 2-等)为电子供体，HCO3 -、CO2等为碳源，将NO3 -还原为N2的过程，是一种高效的生物脱氮工艺。但自养反硝化菌具有增值缓慢，对环境变化敏感的特点。有研究报道，硫自养反硝化菌大多属于适中温菌，最适宜生长温度为30℃左右；它们在秋冬季水温较低的情况下，自养反硝化效果受限明显，导致现有反硝化菌的生化池秋冬季除氮效果不佳。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种耐冷型反硝化硫单胞菌，其具有很高的低温耐受性，在5℃左右的低温时仍然能保持正常生长，且适宜生长温度范围较广，可在10-35℃的水中保持高微生物活性，向硫自养反硝化反应池中适量接种该菌株，即便在秋冬季水温较低的情况下也可显著提升废水中硝态氮的降解效果。本发明还涉及该反硝化硫单胞菌在对污水反硝化除氮工艺中的应用。
(二)技术方案
第一方面，本发明涉及一种耐冷型反硝化硫单胞菌(Sulfurimonasdenitrificans)，命名为反硝化硫单胞菌LY-2，已于2022年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24293。
相对于已知反硝化硫单胞菌，本发明提供的反硝化硫单胞菌LY-2具有优异的低温耐受性，可在5℃左右的低温水体中保持正常生长，且其适宜生长温度范围较广，可在10-35℃的水中保持较高微生物活性，向硫自养反硝化反应池中适量接种反硝化硫单胞菌LY-2，即便在低温环境中也能显著提升废水中硝态氮的降解效果，解决现有自养反硝化菌的生化池秋冬季除氮效果不佳的问题。
第二方面，本发明提供一种耐冷型反硝化硫单胞菌LY-2的应用，其包括：将所述耐冷型反硝化硫单胞菌LY-2接种到自养反硝化反应池，用于对废水中的硝态氮进行反硝化降解除氮。
根据本发明的较佳实施例，所述自养反硝化反应池的水温环境为5-35℃，优选为10-15℃。
根据本发明的较佳实施例，所述应用包括：
步骤1：菌株放大培养，得到放大培养的接种菌液；
步骤2：将菌液以2.8-3.5％(优选为3％)体积百分比接种到硫自养反硝化反应池对硝态氮进行低温反硝化降解。
根据本发明的较佳实施例，步骤1包括：取出-80℃保藏的反硝化硫单胞菌LY-2菌株的甘油冻存管，以1-2％体积百分比接种到液体培养基中，于28℃-32℃(优选为30℃)，静置培养2-4d，见培养基产生大量气泡、培养基浑浊后得到培养液；然后以3-7％体积百分比再转接到液体培养基中，于10-15℃(优选为12℃)静置放大培养得到接种菌液；
所述液体培养基含有：氯化铵0.4-0.6g/L(优选为0.5g/L)、氯化镁0.18-0.28g/L(优选为0.25g/L)、硫代硫酸钠2.55-3.85g/L(优选为3g/L)、硝酸钾3-5g/L(优选为4g/L)、碳酸氢钠1-3g/L(优选为2g/L)、磷酸二氢钾1-3g/L(优选为2g/L)、硫酸亚铁0.005-0.015g/L(优选为0.01g/L)、氯化钙0.004-0.006g/L(优选为0.005g/L)，经灭菌后制得。
优选地，所述废水硝态氮在30-150mg/L；所述废水温度为10-15℃。
经实验证实，所述耐冷型反硝化硫单胞菌LY-2在低温下对硝态氮的去除率最高可达93.09％。
本申请中，接种浓度或接种百分比均指接种菌液量(或接种固体培养基体积)占被接种液体培养基或反应器有效容积的体积百分比。
(三)有益效果
通过对城镇污水厂二沉池中的活性污泥进行驯化，平板划线纯化、低温筛选，获得一株反硝化硫单胞菌(Sulfurimonas denitrificans)LY-2，该菌株具有很高的低温耐受性，可在5℃左右的低温时保持正常生长，且其适宜生长温度范围较广，可在10-35℃的水中保持较高生物活性。实验证明，将该菌株LY-2接种到10-15℃冷水的硫自养反硝化反应池中，废水硝态氮在5-150mg/L时，对硝态氮的去除率最高可达93.09％。因此，该菌株尤其适合在秋冬季接到硫自养反硝化反应池中以提高反硝化除氮效率，维持出水总氮稳定。
经实验证实，该菌株在低温环境中有较强的生长能力和高效的降解废水硝态氮的能力。将菌株扩大培养后应用于水厂生化反应器，硝态氮去除率较接种前有明显提高，在15℃以上的温度(15-35℃)下最高除氮率可达92.42％，出水达到《城镇污水厂污染物排放标准(GB18918-2002)》中一级A排放标准。
综上所述，本发明提供的菌株可有效缓解硫自养反硝化工艺低温下脱氮速率受限的问题，为污水厂提供了高效的低温脱氮菌源，拓宽了反硝化硫单胞菌的功能应用，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1筛选到的反硝化硫单胞菌LY-2的TEM图。
图2为反硝化硫单胞菌LY-2经16S rDNA序列测定和其他几个相似度高的同源菌所构建的系统发育树。
图3为本发明提供的反硝化硫单胞菌LY-2在5-35℃温度区间内对进水中硝态氮的脱除效果曲线。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例为菌株驯化和筛选，其方法如下：
第一步：自养反硝化菌的定向驯化
(1)从石家庄某城镇污水厂二沉池中，取得活性污泥，用清水反复清洗2-3次，去除杂质。以2L锥形瓶为反应器进行污泥驯化，添加活性污泥1.2L和液体培养基0.8L，于30℃下静置培养。液体培养基组分为：氯化铵0.5g/L、六水合氯化镁0.5g/L、五水硫代硫酸钠5g/L、硝酸钾4g/L、碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钙0.005g/L。反应器内初始以硝酸盐存在的氮元素(简称硝态氮)浓度为227.4mg/L。
(2)定期取反应器内上清液测量硝态氮的浓度，当硝态氮去除率大于90％时，更换培养基。
(3)经过为期近40天的富集培养，随着反应时间的增加，硝态氮达到90.0％以上去除率的时间由5天缩短至2天左右，反应过程中无明显NO2 —N(亚硝态氮)的积累，此时可判断自养菌驯化完成。
第二步：纯化单菌落
从锥形瓶反应器内取得驯化结束后的新鲜污泥混合物20mL置于250mL锥形瓶内，加无菌缺氧水180mL置于恒温震荡培养箱内充分振荡30min。
取振荡结束后的菌悬液1.0mL进行梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍，取不同梯度的菌悬液分别涂布在盛有固体培养基的平板上，置于厌氧恒温培养箱中倒置培养，温度设定为30℃，直至有明显的菌落产生，固体培养基组分为氯化铵0.5g/L、六水合氯化镁0.5g/L、五水硫代硫酸钠5g/L、硝酸钾4g/L、碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钙0.005g/L、琼脂20g/L；pH 6.8-7.5，经灭菌后制得；在适宜梯度的平板上挑取形态、大小、颜色不同的单菌落，多次划线培养，直至得到纯化的单菌落。记录菌落形态和细菌颜色结果并记录。
第三步：耐冷型硫自养反硝化菌的筛选
将纯化后的单菌落制成菌悬液，配制相同的无菌缺氧培养基三瓶，瓶内均盛有100mL培养基，各接种菌悬液5mL，通过设置温度梯度进行30℃→25℃→20℃→15℃→10℃对上述菌样进行降温筛选，每个温度梯度下静置培养2-5d，待培养基有气泡产生并出现浑独，选取产气量大的接种于下一温度梯度的新鲜培养基中继续培养，筛选出了10℃条件下生长良好的菌种。
第四步：耐冷型硫自养反硝化菌的鉴定
将筛选出的耐冷型硫自养反硝化菌，接种到固体基础培养基上，倒置于厌氧恒温培养箱中，10℃培养72h得到单菌落。
如图1所示，对上述筛出的单菌落进行形态学特征观察，菌落呈无色透明、表面光滑、边缘规则，透射显微镜观察菌体呈短杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阴性，最适宜pH为6.8-7.5；进一步提取所筛选菌株的基因组DNA。使用16SrDNA用引物进行PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。送样进行16S rDNA序列测定。测定结果如下(SEQ IDNO.1)：
CATGCAGTCGAACGATGATTAATAGAGCTTGCTCTATTATGATTAGTGGCGCACGGGTGAGTAATATATAGATAATGTGCCTCTTAGTCTGGGATAGCCACTGGAAACGGTGATTAATACTAGATACTCCTTTATAGCTCAAGTTATATCGGGAAAGTTTTTCGCTAAGAGATCAGTCTATATCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAATAGCTCACCAAGGCTATGACAGGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACGCATCTCGGTGTGTAAACTCCTTTTATGAGTCAAGAAAATGACGGTAGCTCATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGTCTAGCAAGTCAGGTGTGAAAGCCTATGGCTCAACCATAGAATTGCACTTGAAACTGTTAGACTAGAGTATGGGAGGGGCAGATGGAATTAGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGATATCACTAGGAATACCAAAAGCGAAGGCGATCTGCTGGAACATTACTGACGCTAAGGCGTGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGAACACTAGTCGTCGGAAGGCTTGTCCTTTCGGTGATGCACTTAACAGATTAAGTGTTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATAGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGATACGCGAAAAACCTTACCTGGCCTTGACATTGATAGAATCCTATAGAGATATGGGAGTGCCCTTTTGGGAGCTTGAAAACAGGTGCTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTTAGTTGCTAACAGTTTAGCTGAGCACTCTAGGGAGACTGCCTACGCAAGTAGGAGGA AGGTGAGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGGGCATACAGAGTGTTGCAATACCGCGAGGTGGAGCCAATCACTAAAATGCCTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGCTGGAATCACTAGTAATCGTGGATCAGCATTGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACTCACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGATTTCACCCGAAATCGGGAAGCCAACCTTTATGGGGGCTACCGCTACGG。
上述测定结果与Sulfurimonas denitrificans的同源性为93.53％，将菌株和其他几个相似度高的同源菌用MEGA7.0软件构建系统发育树(如图2)，确定该菌株为Sulfurimonas denitrificans种属的新菌株，故命名为Sulfurimonas denitrificans LY-2，已于2022年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24293。查阅有关资料，尚无有关反硝化硫单胞菌在低温下仍能高效降解硝酸盐氮的的文章和报道。将Sulfurimonas denitrificans LY-2制作成甘油冻存管，于-80℃下保藏。
实施例2
本实施例为Sulfurimonas denitrificans LY-2的放大培养方法，培养方法如下：
步骤1：将-80℃保藏的菌株甘油冻存管取出，以1.5％体积百分比接入液体培养基中，30℃静置培养4d，见培养基，产生大量气泡、培养基浑浊后得到培养液；
步骤2：然后以5％体积百分比二次转接到液体培养基中，于12℃静置放大培养得到接种菌液。
上文的液体培养基组分为：氯化铵0.5g/L、六水合氯化镁0.5g/L、五水硫代硫酸钠、5g/L硝酸钾4g/L、碳酸氢钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钙0.005g/L、pH6.8-7.5，经灭菌后制得。
实施例3
本实施例为测试Sulfurimonas denitrificans LY-2在不同温度下的硝酸盐降解特性。
向实验室稳定运行的硫自养反应器内接种Sulfurimonas denitrificans LY-2，接种浓度为3％(接种菌液量和反应器有效容积的体积百分比)，反应器是材质为有机玻璃的升流式反应器，柱体设计尺寸：高100cm、外径10cm、内径9cm，有效容积2.3L，填料为硫磺颗粒和麦饭石，粒径为3-8mm，填料表面挂有一层棕黄色生物膜。进水采用实验室模拟废水，模拟废水组分为硝酸钾0.2166g/L、磷酸二氢钾0.2166g/L和碳酸氢钠0.2599g/L，HRT为2.5h。运行结果如图3，所述菌株Sulfurimonas denitrificans LY-2可在10-15℃的冷水中维持较高的脱氮效率，去除率最高达到93.09％。此外，虽然在5℃的温度下，所述菌株Sulfurimonas denitrificans LY-2对进水中硝态氮的降解能力不及10-15℃下的反硝化脱氮效率，但脱氮效率也在63-77％之间；而在30-35℃的温度区间内，菌株Sulfurimonasdenitrificans LY-2对废水硝态氮的降解能力与该菌株在10-15℃温区内的表现基本一致，去除率可达到92.42％。
由此可见，本发明筛选的Sulfurimonas denitrificans LY-2在低温环境中有较强的生长能力和高效的降解废水硝酸盐氮的能力，并且能适应很宽的温度区间，在5-35℃内均表现出不俗的反硝化除氮微生物活性，因此，该菌株是对现有反硝化菌的良好补充。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种耐冷型反硝化硫单胞菌(Sulfurimonasdenitrificans)，命名为反硝化硫单胞菌LY-2，已于2022年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24293。
2.一种权利要求1所述的耐冷型反硝化硫单胞菌LY-2的应用，其特征在于，其包括：将所述耐冷型反硝化硫单胞菌LY-2接种到自养反硝化反应池，用于对废水中的硝态氮进行反硝化降解除氮。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述自养反硝化反应池的水温环境为5-35℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述自养反硝化反应池的水温环境为10-15℃。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
步骤1：菌株放大培养，得到放大培养的接种菌液；
步骤2：将菌液以2.8-3.5％的体积百分比接种到硫自养反硝化反应池对硝态氮进行低温反硝化降解。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1包括：取出-80℃保藏的反硝化硫单胞菌LY-2菌株的甘油冻存管，以1-2％的体积百分比接种到液体培养基中，于28℃-32℃，静置培养2-4d，见培养基产生大量气泡、培养基浑浊后得到培养液；然后以3-7％体积百分比再转接到液体培养基中，于10-15℃静置放大培养得到接种菌液；
所述液体培养基含有：氯化铵0.4-0.6g/L、氯化镁0.18-0.28g/L、硫代硫酸钠2.55-3.85g/L、硝酸钾3-5g/L、碳酸氢钠1-3g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、硫酸亚铁0.005-0.015g/L、氯化钙0.004-0.006g/L，经灭菌后制得。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述废水硝态氮在30-150mg/L；所述废水温度为10-15℃。
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