CN116143947A - 一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。本发明就如何提高yCD催化活性开展相关研究，以筛选到高催化活性的yCD突变体，有利于填补提高yCD催化活性的数据断层，为5‑FC/yCD系统在癌症治疗领域的全面应用提供相关的研究基础，为5‑FC/yCD系统的临床应用提供更优良的备选，加速癌症靶向治疗的临床应用进程。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
世界卫生组织公布的数据显示，目前，癌症已经成为危害人类健康的重要原因，2019年，美国用于癌症治疗方面的花费就高达210亿美元。随着人口老龄化的加剧，癌症发病率已经呈逐年上升的趋势，巨额的癌症治疗费用必将加剧国家财政支出和个人经济负担，因此，开展癌症治疗领域的相关研究显得尤为重要。
酵母胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(yCD/5-FC)策略是一种基因导向酶促前药治疗策略，在癌症治疗方面发挥着巨大的潜力，它能够催化无毒前药5-FC生成化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)，其反应式如图1所示。目前，该策略已经在多种癌症模型以及细胞水平实验中取得了令人鼓舞的实验结果。Korkegian等人通过计算机设计的方法获得了一株yCD的突变体，该突变体既保留了yCD的催化活性，又提高了yCD的热稳定性，目前已经处于三期临床阶段；刘福生等人将yCD/5-FC策略和溶瘤病毒策略相结合，提出了一种用于治疗和减缓葡萄膜黑色素瘤的制剂，结果表明，两种策略联合使用能够显著地减少葡萄膜黑色素瘤的体积并改善受试者生存期。在户田正博等人申请的国际专利中，该系统也因其小分子药物易于浸入癌症组织的特点，而被用于脑肿瘤的治疗。yCD/5-FC策略除了优良的实验表现外，还有着区别于传统的癌症治疗方法明显的优势：首先，该策略以无毒的5-FC作为前药，只在局部才转化为5-FU，从而极大地减少了治疗过程中正常身体组织的毒副作用；其次，当药物输送至病灶时，其催化产生的小分子5-FU也能够借助旁观者效应，高效地渗透至患处其他细胞中参与治疗过程，从而极大地降低了药物治疗的剂量，节约了治疗成本。
虽然，yCD/5-FC策略在基础研究阶段表现出了明显的优势和巨大的潜力，但是，目前仍无法有效的应用于临床治疗，其中一个较为重要的原因是yCD本身催化效率不理想。为了加速其临床应用进程，科学家也尝试运用不同的方法提高其催化效率，如Warren通过定点饱和突变的方法，将yCD全部氨基酸位点进行饱和突变，但未筛选到活性明显提高的突变体。究其原因，可能是因为yCD已经处于胞嘧啶脱氨酶的进化序列前端，其表现出来的催化活性和底物亲和能力已经明显优于其他来源的胞嘧啶脱氨酶，因此，如何进一步提高yCD催化活性，以突破催化反应速度壁垒，是现阶段亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。本发明就如何提高yCD催化活性开展相关研究，以筛选到高催化活性的yCD突变体，有利于填补提高yCD催化活性的数据断层，为5-FC/yCD系统在癌症治疗领域的全面应用提供相关的研究基础，为5-FC/yCD系统的临床应用提供更优良的备选，加速癌症靶向治疗的临床应用进程。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，通过将酵母胞嘧啶脱氨酶和高电荷α-螺旋结构域(Highly charged singleα-helix，SAH)直接连接或通过一个或多个氨基酸连接获得，所述酵母胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述高电荷α-螺旋结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶源于包括但不限于酿酒酵母或大肠杆菌的其他蛋白体系，所述高电荷α-螺旋结构域源于包括但不限于肌球蛋白、肌凝蛋白、蛋白激酶或高尔基体复合结构的其他α-螺旋结构。
进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括将酵母胞嘧啶脱氨酶的C末端通过直接或通过一个或多个氨基酸连接的方式与不同长度的高电荷α-螺旋结构域相连所获得的融合蛋白。
进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括SEQ ID NO.3所示的yCD-SAH、SEQID NO.5所示的yCD-RIELQ-SAH、SEQ ID NO.6所示的yCD-RIELQ、SEQ ID NO.7所示的yCD-RIELQ-1/8SAH、SEQ ID NO.8所示的yCD-RIELQ-1/4SAH、SEQ ID NO.9所示的yCD-RIELQ-1/2SAH和SEQ ID NO.10所示的yCD-RIELQ-3/4SAH。
进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白还包括与yCD-RIELQ-SAH相比具有至少50％同一性的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体，与第一方面所述的yCD-RIELQ-SAH相比突变位点位于R159、I160、E161、L162、Q163中的一个或几个氨基酸位点。
进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体的突变形式包括保守取代形式、增加和缺失一个和几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式中的一种或多种。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，包括至少一种第一方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或至少一种第二方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和至少一种药学可接受的载剂或赋形剂。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或第二方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和/或第三方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述药物还包括5-氟尿嘧啶的前药，所述5-氟尿嘧啶的前药选自由5-氟胞嘧啶、Toca FC、5-FC类似物、以及5-氟胞嘧啶、Toca FC、5-FC类似物的光活化性化合物、盐或酯组成的组。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
本发明区别于传统的酶定向进化，以融合蛋白的方式，针对酵母胞嘧啶脱氨酶C末端结构动态性开展相关研究，突破了现有的yCD催化活性长期难以突破的壁垒，所筛选到的融合蛋白及突变体在催化5-FC生成5-FU的过程中，表观催化效率突破性的提高至野生型的3倍。所获得的融合蛋白及突变体可以被用于涉及高效催化5-FC脱氨生成5-FU的相关体系。同时，本发明中使用的方法和策略也可以被应用到其他酶体系。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)催化5-FC生成5-FU反应式；
图2为酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)融合蛋白质粒图谱；
图3为酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)(左)、高电荷α-螺旋结构域(SAH)(中)和yCD-SAH融合蛋白(右)3D结构示意图；
图4为实施例4中酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)融合不同长度高电荷α-螺旋结构域(SAH)所获得的融合蛋白SDS-PAGE结果，其中1为标志物，2为yCD(17.5kDa)，3为yCD-RIELQ(18.1kDa)，4为yCD-RIELQ-1/8SAH(19.1kDa)，5为yCD-RIELQ-1/4SAH(20.2kDa)，6为yCD-RIELQ-1/2SAH(22.6kDa)，7为yCD-RIELQ-3/4SAH(25.0kDa)，8为yCD-RIELQ-SAH(27.1kDa)；
图5为实施例6中酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)和不同长度高电荷α-螺旋结构域(SAH)融合酵母胞嘧啶脱氨酶突变体催化5-FC生成5-FU活反应进程比较。
具体实施方式
本发明通过从yCD晶体结构(PDB：1UAQ)出发，将上述蛋白与SAH(PDB：6OBI)通过不同的连接方式连接，同时，进行融合表达，其结构如图2所示。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白出发菌株的构建
以yCD-SAH(氨基酸序列为SED ID NO.3所示)为模板，以表1所示引物构建yCD-GGGGS-SAH突变体(氨基酸序列为SED ID NO.4所示)。50μL PCR反应体系：25μL 2×PrimerSTAR Max，1μL P1(50μM)，1μL P2(50μM)，1μL(100-200ng)质粒模板，22μL去离子水。PCR程序：98℃预变性3min，30个循环：98℃变性15s，以62℃的温度为退火温度保持15s，72℃延伸1min 30s，最后在72℃彻底延伸10min。PCR产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCRclean-up Kit对产物进行纯化，经磷酸化，T4连接酶连接过夜后，转化感受态细胞E.coliBL21(DE3)pLysS，涂布于含氨苄抗性(50mg/L)的LB固体平板于37℃培养过夜。
表1.酵母胞嘧啶脱氨酶不同出发菌株构建引物
| P1 | GGTGGCGGTGGCAGTAAACAGCAGGAAGA | Seq ID No.19 |
| P2 | TTCACCAATATCTTCAAA | Seq ID No.20 |
实施例2
酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体文库的构建及筛选
1)酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体文库的构建
以表2所示简并引物对编码yCD-GGGGS-SAH氨基酸(氨基酸序列为SED ID NO.4所示)的基因进行突变文库的构建。50μL PCR反应体系：25μL 2×PrimerSTAR Max，1μL P1(50μM)，1μL P2(50μM)，1μL(100-200ng)质粒模板，22μL去离子水。PCR程序：98℃预变性3min，30个循环：98℃变性15s，以62℃的温度为退火温度保持15s，72℃延伸1min 30s，最后在72℃彻底延伸10min。PCR产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCR clean-up Kit对产物进行纯化，经磷酸化，T4连接酶连接过夜后，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)pLysS，涂布于含氨苄抗性(50mg/L)的LB固体平板于37℃培养过夜。
表2.突变体文库构建所用简并引物
2)酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体文库的筛选
挑取文库构建的单菌落克隆子在2mL的深96孔板中培养，含有1mL的LB液体培养基和50mg/L氨苄抗性。同时挑取三个亲本作为对照。2mL的深96孔板置于37℃条件培养5h，然后取500μL菌液到另外一个无菌的2mL的96孔板，并向其中加入500μL、30％(vol/vol)的灭菌甘油，于-80℃进行保菌。向剩余的500μL菌液中加入500μL含50mg/L氨苄抗性、1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和1mM醋酸锌LB液体培养基，置于16℃诱导12-14h，诱导后的菌株在3,000×g，4℃条件下离心30min，弃上清，收集菌体。
分别将1mL反应体系(20mM Tris-HCl缓冲液，100mM NaCl，pH 7.4)加入每个孔，将菌体进行重悬，加入溶菌酶，于37℃孵育30min，根据BCA试剂盒说明书要求，测定粗酶液浓度，添加5-FC后置于室温条件下反应。取50μL反应液加入1mL的0.1N HCl中终止反应。终止反应后的混合液，于酶标仪检测255nm下吸收。确定活性提高突变体。
对筛选得到的高活性突变体，进行活性复筛，筛选方法同前，进一步确定筛选得到的活性提高的突变体。经测序分析确定活性提高突变体为yCD-RIELQ-SAH(氨基酸序列为SED ID NO.5所示)。
实施例3
酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及突变体催化5-FC生成5-FU活性比较
分别挑取yCD、yCD-SAH和yCD-RIELQ-SAH单菌落克隆子接种于5mL含50mg/L氨苄抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜，作为种子液。按照2％的接种量，将种子液接种于含氨苄抗性的LB液体培养基中，扩大培养至OD600约为0.6，加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和1mM醋酸锌，置于16℃诱导12-14h，诱导后的菌株在3,000×g，4℃条件下离心30min，弃上清，收集菌体。
分别取yCD、yCD-SAH和yCD-RIELQ-SAH湿菌体1g，用10mL的缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃，15000rpm，离心10min，上清为制备的粗酶液，经镍离子亲和柱纯化后制备纯酶液。采用纯酶液催化5-FC生成5-FU，并比较它们的催化活性。该反应在30℃环境下进行。通过向反应体系中加入5-FC，进行反应。反应结束后，取50μL反应液，加入1mL的0.1N HCl终止反应。测定不同反应过程在255nm下的吸收。几种酶的反应活性比较如表3所示。
表3.不同酵母胞嘧啶脱氨酶反应活性比较
| 酵母胞嘧啶脱氨酶 | 对应氨基酸序列号 | 相对活性/％ |
| yCD | SEQ ID NO.1 | 100 |
| yCD-SAH | SEQ ID NO.3 | 160 |
| yCD-RIELQ-SAH | SEQ ID NO.5 | 289 |
实施例4
yCD和不同长度SAH融合酵母胞嘧啶脱氨酶突变体催化5-FC生成5-FU活性比较
1)不同长度SAH融合酵母胞嘧啶脱氨酶突变体的构建
以实施例2中获得的yCD-RIELQ-SAH的基因(氨基酸序列为SED ID NO.5所示)为模板和表4所示的引物构建yCD-RIELQ(氨基酸序列为SED ID NO.6所示)、yCD-RIELQ-1/8SAH(氨基酸序列为SED ID NO.7所示)、yCD-RIELQ-1/4SAH(氨基酸序列为SED ID NO.8所示)、yCD-RIELQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.9所示)、yCD-RIELQ-3/4SAH(氨基酸序列为SED ID NO.10所示)质粒，具体PCR方法参考实施例1。
表4.构建yCD融合不同长度SAH融合蛋白所需引物
| 0-SAH-R | CTGCAACTCGATCCTTTCA | Seq ID No.23 |
| 1/8-SAH-R | TTCGGCTTCTTCTTCCTGCTG | Seq ID No.24 |
| 1/4-SAH-R | TTCTTCCTGAATACGACGCAG | Seq ID No.25 |
| 1/2-SAH-R | TTCTTTACGGCGACGCTGTTC | Seq ID No.26 |
| 3/4-SAH-R | TTCTTCCTGTTTACGTTTGGC | Seq ID No.27 |
| SAH-F | TAAGAATTCTGCAGATATCCAT | Seq ID No.28 |
2)不同长度SAH融合酵母胞嘧啶脱氨酶突变体催化5-FC生成5-FU活性比较
参考实施例3中的诱导表达及纯化方法，获得yCD、yCD-RIELQ、yCD-RIELQ-1/8SAH、yCD-RIELQ-1/4SAH、yCD-RIELQ-1/2SAH、yCD-RIELQ-3/4SAH、yCD-RIELQ-SAH蛋白。
参考实施例3对不同蛋白的催化活性进行表征。几种酶的反应活性比较如表5所示。综合考虑催化活性和制备成本，优选yCD-RIELQ-1/2SAH。
表5.不同酵母胞嘧啶脱氨酶反应活性比较
实施例5
针对yCD-RIELQ-1/2SAH连接处(RIELQ)氨基酸迭代饱和突变文库构建及活性筛选
1)针对yCD-RIELQ-1/2SAH连接处(RIELQ)氨基酸迭代饱和突变文库构建
以表6所示简并引物对编码yCD-RIELQ-1/2SAH氨基酸(氨基酸序列为SED ID NO：9所示)的基因进行突变文库的构建。具体方法参照实施例2，不同于实施例2的是，当针对yCD-RIELQ-1/2SAH中连接处R159位完成文库筛选后，取该位点活性最高突变体所对应的核苷酸序列为模板进行下一个位点的突变体文库的构建，第160位、第161号位、第162号位、第163号位文库构建参考此方法。
表6.构建yCD-RIELQ-1/2SAH连接处氨基酸迭代饱和突变文库需引物
2)针对yCD-RIELQ-1/2SAH连接处(RIELQ)氨基酸迭代饱和突变文库活性筛选及活性表征
突变体文库的筛选参考实施例2。对筛选得到的高活性突变体进行测序分析。测序结果分别高活性突变体分别为yCD-LIELQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.11所示)、yCD-LLELQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.12所示)、yCD-LMELQ-1/2SAH(氨基酸序列为SEDID NO.13所示)、yCD-LLRLQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.14所示)、yCD-LLSLQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.15所示)、yCD-LLSFQ-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.16所示)、yCD-LLSFI-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.17所示)、yCD-LLSFM-1/2SAH(氨基酸序列为SED ID NO.18所示)。
参考实施例3中的诱导表达及纯化方法，获得yCD-LIELQ-1/2SAH、yCD-LLELQ-1/2SAH、yCD-LMELQ-1/2SAH、yCD-LLRLQ-1/2SAH、yCD-LLSLQ-1/2SAH、yCD-LLSFQ-1/2SAH、yCD-LLSFI-1/2SAH、yCD-LLSFM-1/2SAH蛋白。
参考实施例3对不同蛋白的催化活性进行表征。几种酶的反应活性比较见表7。优选yCD-RIELQ-1/2SAH。
表7.不同酵母胞嘧啶脱氨酶反应活性比较
| 酵母胞嘧啶脱氨酶 | 对应氨基酸序列号 | 相对活性/％ |
| yCD | SEQ ID NO.1 | 100 |
| yCD-RIELQ-1/2SAH | SEQ ID NO.9 | 281 |
| yCD-LIELQ-1/2SAH | SEQ ID NO.11 | 266 |
| yCD-LLELQ-1/2SAH | SEQ ID NO.12 | 266 |
| yCD-LMELQ-1/2SAH | SEQ ID NO.13 | 258 |
| yCD-LLRLQ-1/2SAH | SEQ ID NO.14 | 307 |
| yCD-LLSLQ-1/2SAH | SEQ ID NO.15 | 313 |
| yCD-LLSFQ-1/2SAH | SEQ ID NO.16 | 248 |
| yCD-LLSFI-1/2SAH | SEQ ID NO.17 | 243 |
| yCD-LLSFM-1/2SAH | SEQ ID NO.18 | 248 |
实施例6
yCD和不同长度SAH融合酵母胞嘧啶脱氨酶突变体催化5-FC生成5-FU活反应进程比较
参考实施例3中的诱导表达及纯化方法，获得yCD、yCD-RIELQ、yCD-RIELQ-1/8SAH、yCD-RIELQ-1/4SAH、yCD-RIELQ-1/2SAH蛋白。
参考实施例3对不同蛋白的催化活性进行表征，不同于实施例3，针对不同反应进程，分别选取不同时间点反应体系进行几种酶的反应进程检测，测定不同反应过程在255nm下的吸收。几种酶的反应进程比较如图5所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，通过将酵母胞嘧啶脱氨酶和高电荷α-螺旋结构域直接连接或通过一个或多个氨基酸连接获得，所述酵母胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述高电荷α-螺旋结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶源于包括但不限于酿酒酵母或大肠杆菌的其他蛋白体系，所述高电荷α-螺旋结构域源于包括但不限于肌球蛋白、肌凝蛋白、蛋白激酶或高尔基体复合结构的其他α-螺旋结构。
3.如权利要求1所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括将酵母胞嘧啶脱氨酶的C末端通过直接或通过一个或多个氨基酸连接的方式与不同长度的高电荷α-螺旋结构域相连所获得的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括SEQ ID NO.3所示的yCD-SAH、SEQ ID NO.5所示的yCD-RIELQ-SAH、SEQ IDNO.6所示的yCD-RIELQ、SEQ ID NO.7所示的yCD-RIELQ-1/8SAH、SEQ IDNO.8所示的yCD-RIELQ-1/4SAH、SEQ ID NO.9所示的yCD-RIELQ-1/2SAH和SEQ ID NO.10所示的yCD-RIELQ-3/4SAH。
5.如权利要求4所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白还包括与yCD-RIELQ-SAH相比具有至少50％同一性的氨基酸序列。
6.一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体，其特征在于，与权利要求4所述的yCD-RIELQ-SAH相比突变位点位于R159、I160、E161、L162、Q163中的一个或几个氨基酸位点。
7.如权利要求6所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体的突变形式包括保守取代形式、增加和缺失一个和几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式中的一种或多种。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括至少一种权利要求1-5任一项所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或至少一种权利要求6-7任一项所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和至少一种药学可接受的载剂或赋形剂。
9.权利要求1-5任一项所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或权利要求6-7任一项所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和/或权利要求8所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物还包括5-氟尿嘧啶的前药，所述5-氟尿嘧啶的前药选自由5-氟胞嘧啶、Toca FC、5-FC类似物、以及5-氟胞嘧啶、Toca FC、5-FC类似物的光活化性化合物、盐或酯组成的组。
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