CN116143907A - 非磷酸化及非泛素化的crept蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白及其应用。具体而言，本发明涉及一种蛋白，其通过修饰CREPT或其同源蛋白而得到，所述修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，经修饰的蛋白保持非磷酸化及非泛素化状态以使其不被降解，导致双MCM六聚体不能分离，从而使细胞周期停止，产生基因组应激反应，最终导致细胞死亡。本发明还涉及筛选CREPT的非磷酸化及非泛素化修饰剂的方法和鉴别物质是否为CREPT的磷酸化抑制剂的方法，以及利用CREPT来鉴别G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，以及基于非磷酸化及非泛素化的CREPT使癌细胞凋亡来治疗癌症的方法。

Description

非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体而言，涉及一种能够保持非磷酸化及非泛素化状态的CREPT蛋白及其应用。
背景技术
DNA在细胞周期的S期进行复制，错误的DNA复制会在生物体内的干细胞中积累，并与细胞死亡和个体衰老密切相关。因此，决定细胞命运的DNA复制需要受到严格的控制。真核细胞的DNA复制机制十分复杂，DNA复制的起始点位于细胞周期的G1期，pre-RC(pre-replication complex)蛋白加载在基因组所有潜在起始点上。首先，具有ATPase活性的ORC复合体(origin recognition complex，ORC1-6)被募集到复制起点。进一步的，CDC6、CDT1(CDC10-dependent transcript 1)和MCM2-7(mini-chromosome maintenance)的六聚体复合体加载到OCR复合体上形成MCM解旋酶复合体。这一步被称为复制起始许可(originlicensing)。复制起始的激活涉及pre-IC(pre-initiation complex)复合体的形成和MCM解旋酶复合体的激活。Pre-IC的组装由DDK(DBF4-dependent kinase)和CDK(Cyclin-dependent kinase)在G1/S转换时期触发。DDK和CDK使几种参与DNA复制的蛋白例如MCM10、CDC45、RECQL4(ATP-dependent DNA helicase Q4)、treslin、GINS和TOPBP1(DNAtopoisomerase2-binding protein 1)磷酸化。此外，DDK和CDK也可以磷酸化MCM2-7复合体中的几个碱基，导致解旋酶激活并解旋DNA。在解旋酶激活期间，加载在DNA上的MCM2-7双六聚体分成两个单独的六聚体，在从复制起始点开始的两个复制叉上持续解旋。
细胞周期受到泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导的Cyclin相关蛋白和CDK抑制剂降解的精确调控。UPS通过将泛素添加到底物蛋白的赖氨酸(K)残基供蛋白酶体识别来实现高效的蛋白降解。有三种主要类型的酶控UPS：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶酶(E2)和泛素连接酶(E3)。连接酶E3是最多样化的酶，其可提供针对靶标的特异性。在G1/S期，由SKP1、CUL1和F-box蛋白(FBP)组成的RING-finger亚家族E3连接酶的SCF复合物识别待降解的底物。FBP主要决定SCF复合物的靶标特异性。SCF复合物更倾向于与磷酸化降解决定子(phosphodegron)结合，磷酸化降解决定子是产生供E3连接酶识别的表面的磷酸化底物基序。FBP家族成员SKP2(S期激酶相关蛋白2)是调节G1/S转换的E3连接酶之一。SKP2-CKS1-p27复合物介导CDK抑制剂p27的蛋白酶体降解并释放Cyclin E/CDK2以促进G1/S转换。
细胞周期的调控与肿瘤的发生发展有着紧密的关系，本实验室在前期研究中在人细胞中发现并克隆了一个与细胞周期调控和肿瘤形成相关的基因CREPT(Cell-cycleRelated and Expression-elevated Protein in Tumor，中国专利号200510135513.4，其相应的蛋白序列见SEQ ID NO:4)。进而发现该基因在多种真核生物中存在十分保守的同源基因，例如在酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫和拟南芥的细胞中。已知CREPT蛋白通过调控Cyclin D1和B1的表达来促进细胞增殖。
然而，CREPT具体如何调控细胞周期的机理尚不清楚。
发明内容
本发明人经大量研究发现，人细胞中的CREPT蛋白通过在G1/S转换期发生降解来推动细胞进入S1期，由此发挥细胞周期调控作用。
具体而言，本发明人发现，在同一培养物中的多个细胞中，CREPT在部分细胞中表达量很低，而在其他细胞中保持较高表达，进而发现这种低表达现象是由于在G1/S转换期CREPT的降解所致，而CREPT的降解对于细胞由G1期进入S期至关重要。CREPT的降解由泛素化修饰来介导，而该泛素化修饰依赖于CREPT的两个位点S134和S166的磷酸化。发明人进一步发现，如果使CREPT蛋白的134和166位点在G1/S转换期保持非磷酸化状态且使该蛋白保持非泛素化状态，则CREPT蛋白不能被降解，这种不能被降解的CREPT蛋白不能与MCM复合体分离，由此会导致细胞死亡。
此外，发明人还发现，非人真核细胞中的同源蛋白具有与人CREPT相同或相似的细胞周期调控作用和调控机理，而且人CREPT蛋白在表达于非人真核细胞中时，这种细胞周期调控作用依然存在。
基于上述发现，发明人完成了本发明。
在第一方面，本发明提供一种通过对SEQ ID No:4的134和166位点进行磷酸化失活修饰而得到的蛋白，所述磷酸化失活修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，从而使所述蛋白在所述真核细胞中不被降解。
在第一方面中，所述真核细胞可以是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
在第一方面中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是氨基酸突变和/或化学修饰。
在第一方面中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
在第一方面中，本发明还提供一种蛋白，其与上述每种蛋白具有(i)90％以上的序列同一性和(ii)相同的134和166位点上的磷酸化失活修饰。在第二方面，本发明提供一种蛋白，其在第一方面的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列。
在第三方面，本发明提供编码第一和第二方面所述的蛋白的核酸。
在第四方面，本发明提供包含第三方面所述的核酸的载体。
在第五方面，本发明提供包含第四方面所述的载体的细胞。
在第六方面，本发明提供第一至第五方面所述的蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞的细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。
在第七方面，本发明提供第一至第五方面所述的蛋白、核酸或载体在制备抗癌药中的应用。
在第八方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的第一至第五方面所述的蛋白、核酸或载体；或者，所述方法包括利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术编辑受试者癌细胞基因组中的CRPET基因，以使所述癌细胞表达SEQ IDNO:2的蛋白。其中，所述受试者可以是哺乳动物，优选是人。其中，在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，可以降低或消除受试者的癌细胞中的野生型CREPT的表达。
在第八方面，本发明提供一种筛选CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂的方法，其中，所述修饰剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo:4，所述方法包括：
i)将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；
或者
ii)在体外将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂与CREPT蛋白温育，并在Cyclin E/CDK2激酶的催化条件下检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平，
如果经步骤i)或ii)处理的CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平相对于未经处理的对照下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述候选修饰剂筛选为CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂。
本发明还提供一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：
i)将待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；或者
ii)在体外将待鉴定的物质与CREPT蛋白温育，并在Cyclin E/CDK2激酶的催化条件下检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；
如果经步骤i)或ii)处理的CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平相对于未经处理的对照下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂，否则所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。
在上述方法中，可以采用质谱法或免疫沉淀法来检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；优选地，所述免疫沉淀法可以包括：使用识别CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化的抗磷酸化抗体来进行免疫沉淀。
本发明还提供一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：i)将待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的真核细胞中并培养所述真核细胞，和ii)使用免疫沉淀法检查所述真核细胞的CREPT蛋白的泛素化水平；与未经所述物质处理的对照细胞中CREPT蛋白的泛素化水平相比，如果经处理的细胞中的CREPT蛋白的泛素化水平下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂，否则所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。在步骤i)之前，所述方法还可以包括：使用预测工具SwissTargetPrediction和SEA针对CREPT来设计所述待鉴定的物质。此外，步骤ii)可以包括用识别CREPT蛋白的抗CREPT抗体和识别泛素的泛素抗体对CREPT蛋白的泛素化水平进行定量。
在第九方面，本发明提供源自非人真核生物的人CREPT的同源蛋白，其在对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点处具有磷酸化失活修饰，所述磷酸化失活修饰使得当所述同源蛋白位于所述真核生物的G1末期或G1/S转换期细胞中时，所述对应于SEQID No:4的134和166位点的同源性位点保持非磷酸化状态且所述同源蛋白保持非泛素化状态，从而使所述同源蛋白在所述细胞中不会被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。
在第九方面中，所述真核生物可以是酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥。
在第九方面中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰可以是氨基酸突变和/或化学修饰。
在第九方面中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰可以是将丝氨酸突变为丙氨酸。
在第九方面中，所述同源蛋白的氨基酸序列可以为SEQ ID No:6。
在第十方面，本发明提供一种蛋白，其选自：
i)在第九方面所述的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列的蛋白；或
ii)与第九方面所述的蛋白具有90％以上的序列同一性且在所述同源性位点上具有相同的修饰的蛋白。
在第十一方面，本发明提供编码第九和第十方面所述的蛋白的核酸。
在第十二方面，本发明提供包含第十一方面所述的核酸的载体。
在第十三方面，本发明提供包含第十二方面所述的载体的细胞。
在第十四方面，本发明提供一种鉴别处于G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，所述方法包括：
1)制备能够内源性表达带可检测标记的人CREPT蛋白或其在非人真核生物中的同源蛋白的真核细胞，并在允许细胞周期进行的条件下培养该真核细胞；
2)利用所述可检测标记观察或测量所述真核细胞中的所述人CREPT蛋白或其同源蛋白的表达水平；
3)将所述人CREPT蛋白或其同源蛋白的表达水平最低的细胞鉴别为处于G1末期或G1/S转换期的细胞；
其中，所述人CREPT蛋白的序列为SEQ ID No:4。
在第十四方面中，所述可检测标记可以是同位素标记、荧光标记或量子点标记或者是能够进一步与同位素标记、荧光标记或量子点标记结合的标记，优选为GFP。
在第十四方面中，所述真核细胞可以是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞。
在第十五方面，本发明提供一种抑制CREPT蛋白在真核细胞中的降解的方法，所述方法包括：
1)使选自SKP2抑制剂、CUL1抑制剂、neddylation抑制剂和CDK2抑制剂的抑制剂进入表达CREPT的真核细胞中；和/或
2)对CREPT蛋白的第134和166位点进行磷酸化失活修饰，使得当经修饰的蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述经修饰的蛋白保持非泛素化状态，从而使所述经修饰的蛋白不被降解。
在该方法中，所述真核细胞可以是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
在该方法中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是氨基酸突变和/或化学修饰，优选地，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
在该方法中，所述SKP2抑制剂可以是针对SKP2的双链siRNA，其序列为AAUCUAAGCCUGGAAGGCCUGdTdT；所述CUL1抑制剂可以是针对CUL1的双链siRNA，其序列为UAGACAUUGGGUUCGCCGUdTdT；所述neddylation抑制剂可以是MLN4924。
在第十六方面，本发明还提供一种蛋白，其选自：1)通过将SEQ ID No:4的166位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；2)通过将SEQ ID No:8的136位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；3)通过将SEQ ID No:8的174位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；和4)与1)至3)中的任一种蛋白具有90％以上的序列同一性且具有相同的丙氨酸突变的蛋白。本发明还提供编码所述蛋白的核酸和包含所述核酸的载体。
附图说明
现将结合附图来描述本发明的具体实施方式，但附图和下文的具体实施方式都不应解读为对本发明的范围的限制，在附图中：
图1A-图1E显示了CREPT的表达水平在细胞周期中振荡；(图1A)肿瘤细胞中CREPT的代表性荧光图像。白色圆圈表示没有CREPT表达的细胞。比例尺，10μm。(图1B)敲入了GFP-CREPT的细胞的延时显微镜活细胞图像。比例尺，10μm。(图1C)细胞周期中的CREPT表达；用2mM双胸苷阻滞(DTB)将DLD1细胞同步至G1/S期并释放。在所示的时间点收集并通过免疫印迹分析细胞裂解物。检测Cyclin A/B1/E、SKP2以确认细胞周期进展。CREPT蛋白水平在G1/S转换期达到最低。(图1D)DTB同步的DLD1 Fucci细胞中CREPT的代表性荧光图像。比例尺，10μm。(图1E)荧光图像(图1D)中的CREPT、EdU和CDT1表达水平的量化结果。统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，****P<0.0001)；P>0.05，不显著[n.s.]，由t检验产生。
图2A-图2K显示出CREPT在G1/S转换期的降解依赖于泛素修饰；(图2A)放线菌酮(CHX)处理的细胞中的CREPT表达。CREPT降解从CHX处理后10小时开始。(图2B)MG132处理后CREPT表达水平保持稳定。在第二次胸苷释放之前，用或不用25μg/ml MG132处理DLD1细胞4小时。(图2C)图2B中CREPT的定量免疫印迹结果。(图2D)CREPT可以被泛素化。在转染有指定质粒的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图2E)K11-聚泛素化介导的CREPT降解。在转染有指定构建体的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图2F)K11型泛素化加速了CREPT降解。HeLa细胞用HA-Ub-K11质粒转染并用CHX处理。(图2G)图2F中的CREPT免疫印迹定量结果。(图2H)K48型泛素化对CREPT降解没有影响。HeLa细胞用CHX处理并转染了HA-Ub-K48质粒。(图2I)图2H中的CREPT免疫印迹定量结果。(图2J)K63型泛素化对CREPT降解没有影响。HeLa细胞用CHX处理并转染了HA-Ub-K63质粒。(图2K)图2J中的CREPT免疫印迹定量结果。通过t检验计算统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001)。
图3A-图3M显示出CRL1SKP2在G1/S转换期直接将CREPT泛素化；(图3A)SKP2与CREPT的结合亲和力最高。通过质谱分析了同步细胞中的CREPT下拉蛋白。这些蛋白根据独特的肽和log10覆盖率来排名。显示了具有已知E3连接酶活性的前10位蛋白。圆点的面积代表相对覆盖率值。(图3B)外源CREPT和外源SKP2之间的相互作用。用抗HA珠子免疫沉淀来自表达HA-CREPT和Flag-SKP2的HEK293T细胞的细胞提取物，并用所示抗体进行免疫印迹分析。(图3C)内源CREPT和内源SKP2之间的相互作用。用抗CREPT珠子免疫沉淀DLD1细胞的细胞提取物，并用所示抗体进行免疫印迹分析。(图3D)纯化的原核生物表达SKP2和CREPT用于体外co-IP测定，然后进行免疫印迹分析。(图3E)SKP2介导CREPT的泛素化。在转染了所示质粒的293T细胞中进行体内泛素化测定，细胞用或不用MG132处理。(图3F)和(图3G)SKP2的过表达对CREPT降解的影响。(图3H)和(图3I)SKP2的敲低对CREPT降解的影响。(图3J)和(图3K)将细胞同步至G1/S期并释放后SKP2和CREPT的水平。(图3L)和(图3M)将细胞同步至M期并释放后SKP2和CREPT的水平。
图4A-图4G显示出CREPT的S134A和S166A突变不能与Ub相互作用；(图4A)CREPT在CID结构域被泛素化。在转染了指定质粒并用MG132处理的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图4B)通过质谱分析鉴定了CREPT修饰。在同步至G1/S期的293T细胞中进行改良质谱分析，CREPT蛋白上丝氨酸(S)位点的磷酸化水平根据#PSMs排序。(图4C)CREPT 135-170区域中CREPT和RTT103的氨基酸示意图。(图4D)CREPT S134A/S166A突变体不能被泛素化。对293T细胞中过表达的泛素化CREPT和CREPT突变体的免疫测定。(图4E)SKP2识别CREPT的磷酸化形式。用指定的质粒转染293T细胞并收获用于co-IP测定，然后进行免疫印迹分析。(图4F)内源CREPT和内源CDK2/Cyclin E之间的相互作用。用抗CREPT珠子免疫沉淀DLD1细胞的细胞提取物，并用所示抗体进行免疫印迹分析。(图4G)CREPT在S134/S166被CDK2/CyclinE1磷酸化。从转染了Flag-CDK2和Flag-Cyclin E1的表达载体的HEK293T细胞中用抗Flag抗体通过Co-IP纯化出Flag-CDK2和Flag-Cyclin E1。GST、GST-CREPT和GST-CREPT(S134A/S166A)用GST珠从原核生物表达系统中纯化。GST或GST标记的CREPT及其突变体的磷酸化通过通用抗磷酸化抗体来检测(顶部)。CREPT(SA)：CREPT(S134A/S166A)。
图5A-图5G显示出CREPT(S134A/S166A)突变导致细胞凋亡；(图5A)CREPT(S134A/S166A)突变体导致细胞死亡。HeLa野生型(Mock)和CREPT敲除(KO)细胞用所示的质粒转染48小时，然后用Annexin V和PI染色以进行FACS分析。(图5B)图5A中的流式细胞数据的统计分析。(图5C)细胞死亡由细胞凋亡触发。HeLa野生型(Mock)和CREPT敲除(KO)细胞用所示的质粒转染48小时，然后进行蛋白质印迹。(图5D)细胞生长抑制是由CREPT(S134A/S166A)过表达引起的。在用所示的质粒转染HeLa野生型(Mock)和CREPT敲除(KO)细胞48小时后，通过CCK-8测定来确定细胞活力。(图5E)CREPT(S134A/S166A)抑制肿瘤生长。将1×106个过表达所示质粒的B16细胞注射到C57BL/6小鼠中(n＝3)。在第10天处死小鼠并测量肿瘤大小。(图5F)CREPT(S134A/S166A)突变体对酿酒酵母是致命的。在By4741 RTT103-KO细胞中比较WT、RTT103KO(Rtt103Δ)和人CREPT WT或突变质粒对温度的生长敏感性。(图5G)Rtt103(S136A/S174A)突变体对酿酒酵母是致命的。在By4741RTT103-KO细胞中比较WT、Rtt103Δ和酵母RTT103 WT或突变质粒对温度的生长敏感性。CREPT(SA)代表CREPT(S134A/S166A)突变体，CREPT(SE)代表CREPT(S134E/S166E)突变体。
图6A-图6G显示出未降解的突变CREPT阻止细胞进入S期；(图6A)CREPT在G1/S转换期未与MCM复合物结合。在DLD1细胞中进行了ChIP-MS分析，根据#PSMs对蛋白进行排序。细胞周期用DTB同步。(图6B)外源CREPT和外源MCM5之间的相互作用。用抗Myc珠子免疫沉淀来自表达Myc-CREPT和Flag-MCM5的HEK293T细胞的细胞提取物，并用指定的抗体进行免疫印迹分析。(图6C)内源CREPT和内源MCM5之间的相互作用。DLD1细胞的细胞提取物与1％多聚甲醛交联10分钟。然后，用抗CREPT珠子进行免疫沉淀，并用指定的抗体进行免疫印迹分析。(图6D)细胞周期中CREPT和MCM5之间的相互作用。DLD1细胞同步至G2/M期。在所示时间收集细胞裂解液用于内源性co-IP测定。(图6E)CREPT(S134A/S166A)突变体下拉了更多的MCM蛋白。用指定的质粒转染293T细胞并收获用于co-IP。(图6F)-(图6G)未降解的CREPT突变体阻止细胞进入S期。HeLa细胞中MCM5和EdU的代表性荧光图像，细胞过表达CREPT(S134A/S166A)突变体16小时，然后用预提取方法染色。比例尺，10μm。CREPT(WT)代表CREPT野生型质粒，CREPT(SA)代表CREPT(S134A/S166A)突变体，CREPT(SE)代表CREPT(S134E/S166E)突变体。
图7A-图7D显示出未降解的CREPT使复制叉中止；(图7A)HeLa细胞中CREPT的代表性荧光图像。用指定的质粒转染细胞12小时。免疫荧光测定RPA2定量结果(右图)。比例尺，10μm。(图7B)HeLa细胞中CREPT的代表性荧光图像。免疫荧光测定的p-RPA2定量结果(右图)。比例尺，10μm。(图7C)用HU处理的WT和S134A/S166A突变体中的DNA复制速率。首先用4mM HU处理不同步的HeLa CREPT KO细胞4小时。然后将CIdU添加到培养物中0.5小时，然后收获细胞用于DNA纤维分析，以测量CIdU纤维的长度和分布。比例尺，10μm。(图7D)在HU阻断和释放期间，WT和S134A/S166A突变体中中止的复制叉的百分比。在HeLa CREPT KO细胞中进行了DNA纤维测定以测量中止的复制叉。统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001)通过t检验计算。CREPT(WT)代表CREPT野生型质粒，CREPT(SA)代表CREPT(S134A/S166A)突变体。
图8显示了CREPT调控细胞周期的作用机制的示意图。
图9A-图9G显示了CREPT的表达水平在细胞周期中振荡，其中，(图9A)GFP-CREPT融合蛋白敲入Hela细胞系的示意图。GFP融合在CREPT的EXON1中的ATG序列之后。(图9B)通过蛋白质印迹验证了GFP-CREPT表达敲入了细胞中。(图9C)在所示的释放时间点通过PI染色对同步的DLD1细胞进行FACS分析。(图9D)细胞周期中的CREPT表达。HeLa细胞通过DTB同步至G1/S期并释放。(图9E)在DTB处理后的所示释放时间点对CREPT mRNA表达进行实时定量PCR分析。(图9F)DTB同步的DLD1 Fucci细胞中CREPT的代表性荧光图像。比例尺10μm。(图9G)荧光图像(图9F)中CREPT和CDT1表达水平的量化结果。统计学显著(****P<0.0001)；P>0.05，不显著[n.s.])，通过t检验计算。
图10A-图10D显示出CREPT在G1/S转换期通过泛素途径降解；(图10A)图2A中CREPT的定量免疫印迹结果。(图10B)有或没有MG132处理时同步化的DLD1细胞的FACS分析。(图10C)CREPT降解不是由自噬介导的。在第二次胸苷释放前6小时用溶酶体抑制剂氯喹或亮肽素处理DLD1细胞。(图10D)在第二次胸苷释放前6小时，用溶酶体抑制剂氯喹或亮肽素处理HeLa细胞。
图11A-图11I显示出CRL1SKP2在G1/S转换期直接将CREPT泛素化。(图11A)验证了GST-CREPT表达。对带有纯化的GST-CERPT蛋白的凝胶进行考马斯蓝染色。(图11B)验证了His-SKP1和His-SKP2的表达。对带有纯化的His-SKP1和His-SKP2蛋白的凝胶进行考马斯蓝染色。(图11C)验证了His-SKP2的表达。在不同纯化步骤中对纯化的SKP2蛋白进行免疫测定。(图11D)在所示的释放时间点通过PI染色对同步的DLD1细胞进行FACS分析。(图11E)cullin连接酶的激活对于CREPT积累至关重要。用1μM neddylation抑制剂MLN4924处理了0-8小时的DLD1细胞中的CREPT的免疫测定。其中si Ctrl为对照细胞，si SKP2为用针对SKP2的siRNA调低了SKP2的细胞(图11F)CUL1与CREPT相互作用。用所示的质粒转染293T细胞并收获用于免疫共沉淀(co-IP)测定，然后进行免疫印迹分析。(图11G)CUL1介导CREPT的泛素化。在用所示质粒转染的293T细胞中进行体内泛素化测定，细胞经或未经MG132处理。(图11H)过表达的CUL1加速CREPT降解。在所示的时间向Hela细胞添加CHX，用或不用MG132处理。(图11I)敲低的CUL1延长了CREPT半衰期。Hela细胞用CHX处理，通过siRNA敲低CUL1或N/C。
图12A-图12E显示出CREPT的S134A和S166A突变不能与Ub相互作用；(图12A)CREPT泛素化不依赖于CID结构域的单个赖氨酸(K)突变。在用所示质粒转染的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图12B)CREPT泛素化不依赖于连接区的单个K突变。在用所示质粒转染的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图12C)CREPT泛素化不依赖于K。在用所示质粒转染并收获用于co-IP测定的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图12D)CREPT泛素化不依赖于苏氨酸(T)或半胱氨酸(C)。在用所示质粒转染的293T细胞中进行体内泛素化测定。(图12E)CREPT在真核细胞中被磷酸化。通过蛋白质印迹使用通用抗磷酸化抗体检查原核细胞(大肠杆菌)和真核细胞(哺乳动物)中的纯化GST-CREPT。p-CREPT(S/T/Y)代表泛磷酸化抗体。
图13A-图13F显示出CREPT(S134A/S166A)突变导致细胞凋亡；(图13A)由未降解的CREPT突变蛋白引起的细胞生长抑制和细胞死亡。HeLa野生型(Mock)和CREPT敲除(KO)细胞用所示质粒转染48小时。(图13B)CREPT(S134A/S166A)的过表达导致细胞生长抑制。在用所示质粒转染293T和NCM460细胞48小时后，通过CCK-8测定来确定细胞活力。(图13C)和(图13D)CREPT(S134A/S166A)突变导致克隆形成性降低。用所示质粒转染HeLa野生型和CREPT敲除细胞6小时，然后计数1000个细胞用于克隆形成测定。(图13E)CREPT(S134A/S166A)抑制肿瘤生长。将1×106个过表达所示质粒的B16细胞注射到C57BL/6小鼠中(n＝3)。在第10天处死小鼠并测量肿瘤大小。(图13F)比较By4741 RTT103 WT细胞中WT、RTT103KO(Rtt103Δ)和酵母RTT103 WT或突变质粒对温度的生长敏感性。CREPT(SA)：CREPT(S134A/S166A)突变；CREPT(SE)：CREPT(S134E/S166E)突变。
图14A-图14G显示出未降解的CREPT阻止细胞进入S期；(图14A)CREPT与MCM2相互作用。293T细胞用所示的质粒转染并收获用于co-IP。(图14B)CREPT与MCM7相互作用。293T细胞用所示的质粒转染。(图14C)在交联的情况下，CREPT与内源性MCM5结合。在DLD1细胞中的内源性co-IP测定，细胞用1％多聚甲醛固定。(图14D)CREPT不直接与染色质结合。HeLa细胞中MCM5和EdU的代表性荧光图像，细胞用直接固定和预提取方法染色。比例尺，10μm。(图14E)用所示质粒转染12小时的CREPT KO HeLa细胞的FACS分析。(图14F)图6G中免疫荧光测定的MCM5定量结果。(图14G)图6G中的细胞核直径。WT：CREPT(WT)；SA：CREPT(S134A/S166A)。
图15A-图15D显示出未降解的CREPT使复制叉中止；(图15A)HeLa细胞中TUNEL信号的代表性荧光图像。过表达所示质粒时对HeLa野生型(Mock)和CREPT敲除(KO)细胞进行Tunel染色，CREPT(SA)：CREPT(S134A/S166A)突变，CREPT(SE)：CREPT(S134E/S166E)突变。比例尺，10μm。(图15B)HeLa细胞中γH2AX的代表性荧光图像。过表达所示质粒12小时时的HeLa CREPT敲除细胞，CREPT(SA)：CREPT(S134A/S166A)突变，CREPT(SE)：CREPT(S134E/S166E)突变。比例尺，10μm。(图15C)免疫荧光染色的细胞的γH2AX intden定量值。(图15D)免疫荧光染色的细胞的γH2AX焦点数。统计学显著性(****P<0.0001)通过t检验计算。
图16是CREPT磷酸化泛素化的小分子抑制剂的筛选结果。上方的#1至#5表示细胞经候选化合物#1至#5处理，中间的数字(0.1至1.1)是各样品的相对泛素化水平。SA：CREPT(S134A/S166A)。
图17显示了候选化合物#1至#5对DLD1细胞(A)和MGC803细胞(B)的增殖的影响。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语“人CREPT蛋白”或“CREPT蛋白”在没有特别说明的情况下指人野生型CREPT蛋白。
本文中使用的术语“CREPT蛋白变体”、“经修饰的CREPT蛋白”是指在野生型CREPT蛋白的基础上进行了氨基酸突变和/或化学修饰而得到的蛋白变体。
本文中使用的术语“同源蛋白”是指氨基酸序列具有同源性、在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白。
本文中使用的术语“磷酸化失活修饰”是指蛋白中的被修饰的氨基酸残基在真核细胞中能够持续保持或模拟非磷酸化状态，经磷酸化失活修饰的残基不能被真核细胞中的激酶磷酸化。
下文将详细说明及本发明的具体实施方式。
发明人经过大量研究工作，发现了CREPT蛋白在调控细胞周期方面的作用机理，并由此完成了本发明。
首先，发明人发现，在细胞周期中CREPT蛋白的表达水平呈振荡状态(图1A)，这是由于CREPT蛋白在G1/S转换期的降解所致，这种降解导致其与MCM复合体分离，由此驱动细胞进入S期并开始进行DNA复制。因此，CREPT蛋白在细胞的G1/S转换期处在最低水平，而随着细胞进入S期，CREPT蛋白的表达水平逐渐恢复(图1B和图1D)。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种鉴别处于G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，所述方法包括：
1)制备能够内源性表达带可检测标记的人CREPT蛋白或其在非人真核生物中的同源蛋白的真核细胞，并在允许细胞周期进行的条件下培养该真核细胞；
2)利用所述可检测标记观察或测量所述真核细胞中的所述人CREPT蛋白或其同源蛋白的表达水平；
3)将所述人CREPT蛋白或其同源蛋白的表达水平最低的细胞鉴别为处于G1末期或G1/S转换期的细胞；
其中，所述人CREPT蛋白的序列为SEQ ID No:4。
在一个实施方式中，所述可检测标记是同位素标记、荧光标记或量子点标记或者是能够进一步与同位素标记、荧光标记或量子点标记结合的标记，优选为GFP。
在一个实施方式中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞或酵母细胞。
发明人进一步发现，CREPT蛋白在细胞的G1/S转换期的这种降解依赖于泛素化介导的蛋白酶体降解，该泛素化由E3连接酶CRL1SKP2催化，而SKP2的识别和催化作用依赖于CREPT蛋白在S134和S166这两个位点的磷酸化。发明人通过对这两个位点进行突变模拟了CREPT的134和166位点的磷酸化和非磷酸化状态，结果发现，这两个位点保持非磷酸化的CREPT蛋白保持非泛素化状态，非磷酸化及非泛素化状态的S134A/S166A双突变蛋白在G1末期或G1/S转换期不会降解，这种不降解的CREPT蛋白变体不会与MCM复合体分离，从而导致细胞阻滞于MCM复合体表达量较高的G1末期或G1/S转换期，导致细胞周期无法进入S期，并停滞DNA复制叉的行进，最终导致细胞死亡(图5A-图5G)。单独的S134A突变或S166A突变蛋白能够在一定程度上影响泛素化(图4D)。另一方面，模拟磷酸化状态的S134E/S166E双突变蛋白对细胞的泛素化和生存均没有影响(图4D，图5A-图5B)，说明它和野生型CREPT蛋白一样在G1/S转换期正常降解。以上证明，保持134和166位点非磷酸化且保持蛋白非泛素化的CREPT蛋白变体在G1末期或G1/S转换期不能发生降解，进而导致细胞死亡。
本领域已知负责蛋白泛素化的连接酶对底物的识别依赖于底物上特定位点(通常为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)的磷酸化，而磷酸化的实质在于蛋白质的电荷发生了改变。因此，通过模拟相应位点的磷酸化状态(即，带负电荷)，往往能够达到使底物蛋白模拟磷酸化的状态。在本案中，磷酸化的蛋白可以被泛素化连接酶识别，进而促使了蛋白的降解。磷酸化/非磷酸化的模拟通常采用突变或化学修饰来实现。例如，持续激活性突变(即模拟磷酸化状态的突变)包括将残基突变成天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，因为这两个氨基酸是唯二的带负电荷的氨基酸；而持续抑制性突变(即模拟非磷酸化的突变)最常见的是将丝氨酸突变成丙氨酸(A)，因为丙氨酸带正电荷，能够持续抑制该残基位点的活性另一方面，激活性化学修饰剂(即模拟磷酸化状态的化学修饰剂)可以包括乙酰磷酸酯、磷酰胺盐、氨基甲酰磷酸酯和焦磷酸钠等磷酸供体以及三氟化铍。此外，一些CDK4/6特异性小分子抑制剂例如Palbociclib、Ribociclib或Abemaciclib也可以实现使蛋白保持非磷酸化的效果(Maianiet al.,2021；Simoneschi etal.,2021)。
基于本发明人的上述发现，本领域技术人员能够合理推断，只要CREPT的134和166位残基在G1末期或G1/S转换期能够保持非磷酸状态，则该蛋白就不会被泛素化，从而不能发生降解，进而导致细胞死亡。
因此，本发明提供一种非磷酸化及非泛素化的CREPT蛋白变体，当所述CREPT蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述CREPT蛋白的134和166位点能够保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，由此使该蛋白变体在该阶段不会降解。
另外已知，SKP2连接酶或CDK2激酶的缺失能抑制细胞生长，但不能使细胞死亡(Lin et al.,2010；Zhu,2010；Berthet et al.,2003；Tadesse et al.,2019)，这说明CREPT在调控细胞周期中发挥重要的核心作用。CREPT的134和166位的S残基位于CREPT的连接区域，构成被SKP2连接酶识别的磷酸化降解决定子，并且在同源蛋白之间高度保守(图4C)。以上说明134和166这两个残基的磷酸化状态在调控细胞周期中具有至关重要的作用。
发明人还发现，人CREPT蛋白的S134A/S166A突变形式诱导细胞凋亡的效果在其他真核生物中也存在。发明人在酿酒酵母中外源表达了人CREPT S134A/S166A，结果该蛋白变体在不同温度下会损害酵母的存活(图13F)。为了排除酵母中内源性Rtt103(CREPT的同源蛋白)的影响，在Rtt103缺失型酵母菌株中也外源表达了人CREPT S134A/S166A，结果其也显著阻断酵母的生长(图5F)。这说明CREPT蛋白及其同源蛋白的细胞周期调控作用和调控机理在真核生物中是普遍适用的，也说明了外源导入CREPT突变体能够控制真核细胞、优选肿瘤细胞的细胞周期，并诱导细胞凋亡。
因此，本发明的另一方面提供了一种通过对CREPT蛋白序列(SEQ ID NO:4)中的134和166位残基进行磷酸化失活修饰而得到的蛋白，所述磷酸化失活修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，从而使所述蛋白在所述真核细胞中不被降解。
在一个实施方式中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
在一个实施方式中，134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。
在一个实施方式中，134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸(S)均突变为丙氨酸(A)，此时所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2，即CREPT的S134A/S166A双突变形式。
在一个实施方式中，所述蛋白的N端和/或C端可以连接有标签序列或引导序列。在一个实施方式中，所述连接是共价连接。在一个实施方式中，带有标签序列或引导序列的所述蛋白是融合蛋白。在一个实施方式中，带有标签序列或引导序列的所述蛋白是缀合蛋白。在一个实施方式中，标签序列可以是例如纯化标签、荧光标签、增溶标签、亲和标签或抗原表位标签等。在一个实施方式中，引导序列可以是将所述蛋白跨过细胞膜引导至细胞内的多肽序列，包括例如不基于胞吞作用的细胞穿膜肽，和本身易于通过胞吞作用进入细胞的肽序列或蛋白序列。
本发明还提供与上述蛋白具有相同的134和166位点上的磷酸化失活修饰且具有90％以上、95％以上、优选98％以上或99％以上的序列同一性的蛋白。
在另一方面，本发明提供编码上述蛋白的核酸，包含所述核酸的载体，以及包含所述载体的细胞。
将目标蛋白(例如本发明的CREPT S134A/S166A)导入靶细胞(例如癌细胞)的方法可以包括将表达目标蛋白的载体通过转染、感染或其他方式导入靶细胞中，或者也可以采用化学修饰的mRNA(modRNA)来实现目标蛋白在靶细胞中的表达。此外，可以采用例如上述引导序列将目标蛋白直接导入细胞。但本发明不限于此。例如，可以利用精准基因编辑技术(例如prime editors)直接对肿瘤基因组中的目标位点进行突变(Anzalone,et al.,2019)，例如将基因组CREPT的相应碱基突变以使细胞表达CREPT S134A/S166A。
在又一方面，本发明提供上述蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述真核细胞是人、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母或拟南芥的细胞。
由于CREPT在多数癌中高表达(Li et al.,2021；Lu et al.,2012)，因此，在另一方面，本发明提供上述蛋白、核酸或载体在制备抗癌药中的应用。
在又一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向人类受试者施用有效量的上述蛋白、核酸或载体；或者，所述方法包括利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术编辑受试者癌细胞基因组中的CRPET基因，以使所述癌细胞表达SEQ ID NO:2的蛋白。在一个实施方式中，所述癌症是肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。在一个实施方式中，所述方法包括将上述核酸导入肿瘤细胞。在一个实施方式中，在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，降低或消除受试者的癌细胞中的野生型CREPT的表达。在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含：上述蛋白、核酸或载体，和药学上可接受的载体、赋形剂或介质。在一个实施方式中，所述药物组合物用于治疗癌症，例如肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。
由于CREPT蛋白的134和166这两个残基的磷酸化状态在调控细胞周期中具有至关重要的作用，因此，本发明的另一方面提供一种筛选CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂的方法或鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述修饰剂或抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；特别是当所述CREPT蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述S134和S166位点能够保持持续非磷酸化状态且所述蛋白能够保持非泛素化状态，从而使所述蛋白不会被降解；其中，所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4。
在一个实施方式中，所述方法可以如下进行：将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂或待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平。在另一个实施方式中，所述方法可以如下进行：在体外将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂或待鉴定的物质与CREPT蛋白温育，并在Cyclin E/CDK2激酶的催化条件下检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平。在上述法中，如果经步骤i)或ii)处理的CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平相对于各自的未经处理的对照下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，优选下降50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上，则将所述候选修饰剂筛选为CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂，或将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂；否则所述候选修饰剂不是CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂，且所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。在上述方法中，可以采用质谱法或免疫沉淀法来检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化状态。所述免疫沉淀法可以包括：使用识别CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化的抗磷酸化抗体来进行免疫沉淀，由此对CREPT蛋白的S134位点的磷酸化水平进行定量。具体而言，可以用抗CREPT抗体使CREPT蛋白沉淀，并测定CREPT蛋白总量作为本底量，对于用抗CREPT抗体免疫沉淀下来的蛋白，利用抗磷酸化抗体来检测磷酸化的蛋白并对其进行定量，此时，磷酸化水平可以是磷酸化蛋白的量相对于CREPT蛋白本底量的相对值，并可以针对对照进行归一化。
本发明还涉及以下化合物：
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以及该化合物在制备CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化抑制剂或CREPT蛋白的泛素化抑制剂中的用途、在制备治疗癌症的药物中的用途。在一个实施方式中，所述癌症是黑色素瘤、肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。
由于CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化是该蛋白泛素化的必要条件，因此，可以利用泛素化水平来鉴定CREPT蛋白的磷酸化泛素化抑制剂。因此，本发明还提供一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：i)将待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的真核细胞中并培养所述真核细胞，和ii)使用免疫沉淀法检查所述真核细胞的CREPT蛋白的泛素化水平；与未经所述物质处理的对照细胞中CREPT蛋白的泛素化水平相比，如果经处理的细胞中的CREPT蛋白的泛素化水平下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂，否则所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。在步骤i)之前，所述方法还可以包括：使用预测工具SwissTargetPrediction和SEA针对CREPT来设计所述待鉴定的物质。此外，步骤ii)可以包括用识别CREPT蛋白的抗CREPT抗体和识别泛素的泛素抗体对CREPT蛋白的泛素化水平进行定量。泛素化水平可以是泛素化的蛋白量相对于CREPT蛋白总量的相对值，并可以针对对照进行归一化。
此外，CREPT中的S134和S166对应于酵母Rtt103中的S136和S174(见图4C)，发明人发现Rtt103 S136A/S174A双突变蛋白的过表达导致了Rtt103缺失型酵母的致命表型(图5G)。这些结果表明，人CREPT蛋白在其他真核细胞生物中的同源蛋白具有相同或相似的调控细胞周期的作用机理。
因此，在又一方面，本发明提供了源自非人真核生物的人CREPT的同源蛋白，其在对应于人CREPT蛋白的134和166位点的同源性位点处具有磷酸化失活修饰，所述磷酸化失活修饰使得当所述同源蛋白位于所述真核生物的G1末期或G1/S转换期细胞中时，所述同源性位点保持非磷酸化状态且所述同源蛋白保持非泛素化状态，从而使所述同源蛋白在所述细胞中不会被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。
在一个实施方式中，所述真核生物是酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥。
在一个实施方式中，所述对应于人CREPT蛋白的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。在一个实施方式中，所述对应于人CREPT蛋白的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸突变为丙氨酸。在一个实施方式中，所述同源蛋白是酿酒酵母Rtt103S136A/S174A双突变蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:6。
在一个实施方式中，所述同源蛋白的N端和/或C端可以连接有标签序列或引导序列，以形成例如融合蛋白或缀合蛋白。
在一个实施方式中，还提供与上述蛋白在所述同源性位点上具有相同的磷酸化失活修饰且具有90％以上、95％以上、优选98％以上或99％以上的序列同一性的蛋白。
在一个实施方式中，本发明提供编码上述同源蛋白的核酸，包含所述核酸的载体，以及包含所述载体的细胞。
在一个实施方式中，本发明提供上述同源蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞。
除了对CREPT蛋白的134和166位点进行磷酸化失活修饰外，发明人还发现，即使不修饰CREPT，使用针对SKP2或CUL1的siRNA将它们敲低或耗尽，也能够在细胞中显著抑制野生型CREPT蛋白的降解(见图3H和图3I，图11E和图11I)。
因此，在另一方面，本发明提供一种抑制CREPT蛋白在真核细胞中的降解的方法，所述方法包括：1)使选自SKP2抑制剂、CUL1抑制剂、neddylation抑制剂和CDK2抑制剂的抑制剂进入表达CREPT的真核细胞中；和/或2)对CREPT蛋白的第134和166位点进行磷酸化失活修饰，使得当经修饰的蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述经修饰的蛋白保持非泛素化状态，从而使所述经修饰的蛋白不被降解。在一个实施方式中，所述真核细胞可以是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。在一个实施方式中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰可以是氨基酸突变和/或化学修饰，优选地，是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。在一个实施方式中，SKP2抑制剂可以是针对SKP2的双链siRNA，其序列可以为AAUCUAAGCCUGGAAGGCCUGdTdT；CUL1抑制剂可以是针对CUL1的双链siRNA，其序列可以为UAGACAUUGGGUUCGCCGUdTdT；neddylation抑制剂可以是MLN4924。
此外，如图4D所示，CREPT的单突变蛋白S134A或S166A都能够在一定程度上抑制泛素化，因此能够理解，这些单突变蛋白及在其他真核细胞中的同源蛋白的类似单突变体都具有抑制CREPT降解的功能。
因此，在又一方面，本发明还提供以下蛋白：1)通过将SEQ ID No:4的166位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；2)通过将SEQ ID No:8的136位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；3)通过将SEQ ID No:8的174位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；和4)与1)至3)中的任一种蛋白具有90％以上的序列同一性且具有相同的丙氨酸突变的蛋白。此外，本发明还提供编码所述蛋白的核酸和包含所述核酸的载体。
序列说明：
SEQ ID NO:1编码CREPT S134A/S166A双突变蛋白的核酸序列；
SEQ ID NO:2CREPT S134A/S166A双突变蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3野生型CREPT的编码核酸序列；
SEQ ID NO:4野生型CREPT的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5编码Rtt103 S136A/S174A双突变蛋白的核酸序列；
SEQ ID NO:6Rtt103 S136A/S174A双突变蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7野生型Rtt103的编码核酸序列；
SEQ ID NO:8野生型Rtt103的氨基酸序列。
实施例
实施例1.CREPT在G1/S转换期降解、在S期恢复
对DLD1和Hela细胞进行了免疫荧光(IF)染色实验以确定CREPT在肿瘤细胞中的表达模式。结果发现，大多数肿瘤细胞表达丰富的CREPT，但有少数肿瘤细胞为CREPT阴性(图1A，见虚线圆圈)。而且CREPT阴性的肿瘤细胞的核稍大，DAPI均匀染色(图1A，DAPI染色)。因此，CREPT阴性的肿瘤细胞可能是由于在特定细胞周期阶段内CREPT消失。为了验证这个假设，发明人用CRISPR-Cas9生成了敲入了GFP-CREPT的HeLa细胞(图9A，图9B)。活细胞成像分析显示，GFP-CREPT在细胞中保持了一段时间，然后消失了近30分钟，而后又恢复(图1B)。这表明CREPT蛋白的水平在肿瘤细胞周期中振荡。
为了进一步确认CREPT蛋白在细胞周期中的振荡，使用双胸苷阻滞(DTB)将DLD1和HeLa细胞同步至G1/S转换期，并释放到不同的细胞周期时间点。荧光激活细胞分选(FACS)分析显示，在DTB处理后，超过90％的细胞同步在G1期(图9C)。蛋白质印迹显示G1/S转换期几乎检测不到CREPT蛋白，但其在S期增加(图1C和图9D，泳道1，0小时和1小时)。CREPT蛋白的这种变化伴随着Cyclin E和SKP2的相反趋势，但与Cyclin A和Cyclin B1的表达模式相似(图1C和图9D)。同时，CREPT的mRNA水平从G1/S转换到S期保持不变(图9E)。这些结果表明，CREPT蛋白在肿瘤细胞周期的G1/S转换期被降解。
为了直接可视化CREPT消失的特定时间点，在DLD1细胞中建立了荧光泛素化的细胞周期指示剂(Fucci)细胞系。在嵌入有5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的Fucci细胞中进行内源性IF染色(图1D、图1E和图9F、图9G)。结果显示，CREPT在同步后消失，伴随着阴性的EdU染色(S期的标志)，但呈现阳性的GEMININ和CDT1染色(G1/S期的标志)(图1D，0小时)。随着肿瘤细胞周期进入S期，CREPT蛋白逐渐增加(图1D，1小时后)。定量分析表明，CREPT和EdU在G1/S转换期处于最低水平，但在肿瘤细胞释放到S期后恢复(图1E)。这些结果表明CREPT蛋白在肿瘤细胞的G1/S转换期处在最低水平。
实施例2.GREPT在G1/S转换期通过SKP2的泛素化而降解
为了阐明CREPT在G1/S转换期的降解机制，发明人首先用放线菌酮(CHX)阻断蛋白合成来检查CREPT的蛋白稳定性。结果表明，CHX处理后CREPT蛋白减少(图2A，图10A，10-12h)，表明CREPT蛋白降解。此外，当在细胞周期同步化过程中添加MG132(蛋白酶体诱导降解的抑制剂)时，CREPT蛋白在G1/S转换期保持在相对较高的水平(图2B，泳道7vs 1，图2C，图10B)。这些结果表明CREPT表达的降低是由于蛋白酶体诱导其降解。
为了确认CREPT的降解是否依赖于泛素，发明人进行了免疫共沉淀(Co-IP)实验来检测CREPT与泛素的相互作用。结果表明，针对Myc的抗体沉淀了Myc-CREPT和HA-泛素，而MG132增加了沉淀的HA-泛素水平(图2D)，表明CREPT可被泛素修饰。进一步的泛素连接类型表征实验发现CREPT主要以K11连接被泛素化，而非K48连接(图2E)。值得注意的是，K63泛素也能够适度诱导CREPT泛素化(见图2E，泳道6和12)。这一结果是出乎意料的，因为已广泛报道K48泛素可介导蛋白降解。发明人进一步在CHX存在下与CREPT一起过度表达了不同类型的泛素。结果表明，在存在K11而不是K48或K63泛素的情况下，CREPT在减少(图2F-图2K)。此外，发明人用自噬抑制剂CQ和LEU处理将DLD1和HeLa细胞同步到G1/S期，结果表明，在CQ或LEU处理下，CREPT蛋白在DTR后0小时仍保持降解(图10C-图10D)。上述这些结果表明CREPT在G1/S转换期的降解依赖于K11连接的泛素化。
为了鉴定出针对CREPT的E3连接酶，发明人在MG132处理下将细胞同步至G1/S期，以沉淀CREPT相互作用蛋白。质谱分析表明在沉淀复合物中存在若干种E3连接酶。在与CREPT潜在相互作用的前10种E3连接酶中，SKP2与CREPT结合的可能性最高(图3A)。为了查明SKP2是否是用于CREPT降解的E3连接酶，发明人验证了它们在不同条件下的相互作用。IP实验表明，针对HA的抗体沉淀了HA-CREPT和Flag-SKP2(图3B)，表明HA-CREPT与Flag-SKP2相互作用。重要的是，观察到针对CREPT的抗体在DLD1细胞中沉淀出内源性SKP2(图3C)，表明CREPT和SKP2在完整细胞中相互作用。为了验证物理相互作用，发明人根据先前报道的策略(Chan等人，2013；Schulman等人，2000)在大肠杆菌中纯化了GST-CREPT和His-SKP2。GST沉降实验表明，针对GST的抗体同时沉降了GST-CREPT和His-SKP2，表明SKP2直接与CREPT结合(图3D)。这些结果表明CREPT和SKP2在体内和体外都直接相互作用。
为了证明SKP2在CREPT泛素化中的作用，发明人检查了泛素化的CREPT水平。体内泛素化测定表明，SKP2的过表达增强了Myc-CREPT的多泛素化(图3E)。为了查明SKP2是否介导CREPT降解，发明人在CHX处理下在Hela细胞中过表达了SKP2。蛋白质印迹分析显示，在CHX处理后8小时，SKP2过表达细胞的CREPT蛋白水平下降，而对照细胞中时在10小时下降，表明SKP2的过表达导致CREPT的降解加快了2小时(图3F-图3G，10-12小时)。值得注意的是，添加MG132会削弱CREPT的降解(图3F，MG132的第12小时)，表明SKP2诱导的CREPT降解依赖于蛋白酶体。为了确认SKP2在体内CREPT降解中的作用，在Hela细胞中利用siRNA耗尽了内源性SKP2。结果表明，在SKP2耗尽的细胞中，在CHX处理后的不同时间点CREPT蛋白水平保持稳定(图3H-图3I)。这些表明CREPT泛素化是由F-box家族E3连接酶SKP2介导的。
为了查明SKP2在肿瘤细胞周期对CREPT降解的作用，发明人将细胞同步至G1/S期，并在不同的释放时间点沉淀出CREPT复合物。结果表明，在细胞周期进程中，SKP2从G1/S转换期到S期表达，而CREPT在G1/S期表达最低，然后逐渐恢复(图3J，裂解物)。值得注意的是，针对CREPT的抗体在在释放后0到4小时使SKP2强烈沉淀，但10小时时没有沉淀，表明SKP2与CREPT的相互作用特定地在G1/S期而不是G2/M期(图3J-图3K，0-8小时)。
为了进一步确定肿瘤细胞周期中CREPT/SKP2相互作用的时间点，将细胞同步至G2/M期。co-IP实验表明在释放后10小时SKP2出现，但CREPT表达处于最低水平(图3J)。还观察到CREPT和SKP2的相互作用出现在细胞释放后第10小时，并一直持续到第18小时(图3L-图3M，10-18h)。流式细胞仪分析表明，在释放后10小时细胞仍处于G1/S期(图11D)。这些结果表明SKP2与CREPT在G1/S转换期相互作用并诱导其降解。
由于SKP2属于SCF复合蛋白的F-box家族，为了查明Cul1-RING E3泛素连接酶(CRL1)复合物是否参与CREPT降解，发明人使用了neddylation抑制剂MLN4924，它抑制所有Cullin-RING连接酶复合物的激活。结果CREPT蛋白水平在对照细胞(si Ctrl)中增加，但在MLN4924处理的SKP2耗尽细胞(si SKP2)中没有增加(图11E)。图11E表明，在对照细胞中Cullin-RING连接酶随时间(0-6小时)逐渐被MLN4924失活，尽管SKP2始终保持显著的表达水平，但CREPT的泛素化水平逐渐下降且降解受到抑制，其水平随时间逐渐增加；而在用siRNA耗尽SKP2的细胞中CREPT的泛素化和降解始终受到抑制，因此始终保持在显著水平。以上结果说明，SKP2的缺失能够显著抑制CREPT的泛素化和降解。
相应地，免疫沉淀测定结果发现Flag-Cul1与HA-CREPT相互作用(图11F)，并且在有或没有MG132处理的情况下Cul1的过表达增加了的CREPT的泛素化水平(图11G，见HA条带)。与此一致地，Cul1的过表将CREPT的降解加快了2小时(图11H)，但用siRNA导致的Cul1的缺失保护了CREPT免受降解(图11I)。这些结果表明CRL1SKP2是识别待降解的CREPT的E3连接酶，且该连接酶的失活能够显著抑制CREPT的泛素化和降解。
实施例3.CREPT的泛素化依赖于S134和S166的磷酸化
为了鉴定CREPT蛋白上的泛素缀合位点，发明人在293T细胞中在MG132的存在下用HA-Ub表达了带Myc标签的CID结构域(Myc-CREPT-CID)和CCT结构域(Myc-CREPT-CCT)。蛋白质印迹分析显示Myc-CREPT-CID被泛素化，而Myc-CREPT-CCT没有(图4A)，表明泛素化发生在CID结构域域。而后发明人将CID结构域中的所有单个赖氨酸(K)残基突变为精氨酸(R)以绘制泛素化位点，但是蛋白质印迹分析表明所有突变都未能损害泛素化水平(图12A和12B)。而K56R突变增加了泛素化水平(图12A，泳道9)，表明K56是CREPT泛素化的抑制性残基。在突变所有K残基时，Myc-CREPT-CID仍处于高泛素化水平(图12C，最后一个泳道)，然而，当突变所有K残基但不突变K56时，泛素化处于基线水平(图12C，泳道4)。这些结果表明泛素化可能发生在其他残基上，而K56是抑制性残基。
为了寻找其他可能的泛素连接残基，发明人还在CID结构域中的苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)残基上产生了突变，但CREPT泛素化水平在这些突变中仍然保持不变(图12D)。这些负面结果促使发明人验证CREPT是否是具有磷酸化降解决定子的底物，因为SCF复合物更倾向于与磷酸化降解决定子结合以进行泛素化。为此，发明人通过质谱分析分析了CREPT的磷酸化修饰，发现丝氨酸134(S134)和丝氨酸166(S166)位点被高度磷酸化(图4B)。值得注意的是，这两个S残基位于CREPT的连接区域，并且在CREPT和其在酿酒酵母中的直系同源物Rtt103之间高度保守(图4C)。为了验证S134和S166的磷酸化是否调控CREPT泛素化，发明人生成了不同的突变体，包模拟功能丧失的非磷酸化状态的S134A、S166A和S134A/S166A双突变，以及用于模拟连续磷酸化的S134E、S166E和S134E/S166E双突变。蛋白质印迹分析显示，S134A、S166A和S134A/S166A的突变损害了泛素化，但其他突变对泛素化没有影响(图4D)。该结果表明S134和S166的磷酸化对于CREPT的泛素化是必不可少的。为了确认这两个S残基是否对SKP2识别至关重要，发明人进行了IP实验，结果表明，Myc抗体沉淀了Myc-CREPT(S134E/S166E)/Flag-SKP2复合物，但没有沉淀Myc-CREPT(S134A/S166A)/Flag-SKP2复合物(图4E)，表明CREPT(S134A/S166A)未能与SKP2相互作用。这些结果表明S134和S166参与形成CREPT的磷酸化降解决定子。
此外，CREPT的氨基酸序列分析显示S134和S166位点都可能是具有sp序列的Cyclin E-CDK2复合物识别位点。还观察到CREPT在IP实验中与Cyclin E1和CDK2相互作用(图4F)。体外激酶测定显示GST-CREPT被CDK2和Cyclin E1磷酸化，但GST-CREPT(S134A/S166A)没有被磷酸化(图4G)。还观察到GST-CREPT在哺乳动物细胞中被磷酸化，但在大肠杆菌中没有被磷酸化(图12E)。这些结果表明，CREPT在G1/S期的降解取决于S134和S166位点处的被CRLSKP2识别的磷酸化降解决定子。
实施例4.未降解的CREPT蛋白变体引起细胞凋亡
发明人发现突变蛋白CREPT(S134A/S166A)总是诱导细胞死亡(图13A，上图)。具体而言，发明人在CREPT缺失型细胞中过表达了野生型CREPT和突变CREPT。结果显示野生型(WT)CREPT和CREPT(S134E/S166E)的过表达挽救了细胞增殖，然而CREPT(S134A/S166A)的过表达导致细胞死亡显著增加(图13A，下图)。FACS分析显示CREPT(S134A/S166A)的表达导致野生型细胞和CREPT缺失型细胞的死亡显著增加，而野生型CREPT和CREPT(S134E/S166E)则没有影响(图5A-图5B)。而且CREPT(S134A/S166A)所诱导的CREPT缺失型细胞的死亡率远高于其所诱导的野生型细胞的死亡率(图5A-图5B)。相应地，当CREPT(S134A/S166A)在野生型细胞或CREPT缺失型细胞中表达时，细胞生长速率(图5D)和集落形成能力(图5D和图13C)显著受损。蛋白质印迹分析表明，CREPT(S134A/S166A)的过表达诱导了切割形式的半胱天冬酶7的表达，这是一种典型的凋亡执行器(图5C)。上述结果表明，未降解的CREPT变体诱导细胞凋亡。
为了确认S134A/S166A突变诱导细胞凋亡的效果是否在其他物种中也存在，发明人在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中外源表达了CREPT突变蛋白。结果观察到CREPT(S134A/S166A)在不同温度下会显著阻断酵母的生长(图13F)。人p15RS的外源表达对酵母存活没有影响(图13F，底部)。为了排除酵母中内源性Rtt103(CREPT的同源蛋白)的影响，在Rtt103缺失型酵母菌株中外源表达了人CREPT及其突变蛋白。结果表明，CREPT(S134A/S166A)显著阻断了酵母的生长(图5F)，这表明CREPT(S134A/S166A)在酵母中也是致命的。此外，p15RS似乎也抑制了Rtt103缺失型酵母的生长，这与p15RS在哺乳动物细胞中的抑制作用相呼应。上述结果表明CREPT中的S134A和S166A的双突变能够在哺乳动物和酵母细胞中诱导细胞死亡。
由于CREPT中的S134和S166对应于酵母Rtt103中的S136和S174(见图4C)，发明人生成了相应的酵母突变蛋白，并且观察到Rtt103(S136A/S174A)的过表达导致Rtt103缺失型酵母的致命表型(图5G)。这些结果表明，CREPT和RTT103中磷酸化降解决定子的破坏导致细胞死亡。
实施例5.未降解的CREPT变体阻止细胞进入S期
之前的结果表明CREPT的磷酸化降解决定子对G1/S转变至关重要。为了调查CREPT磷酸化对G1/S转变的作用机制，发明人鉴定了在G1/S期不能与CREPT相互作用的蛋白，具体而言，利用双胸苷阻滞将DLD1细胞系同步至G1/S期，并通过染色质免疫沉淀质谱(ChIP-MS)实验分析了与CREPT相互作用的蛋白，比较非同步和同步DLD1细胞之间的CREPT沉淀的蛋白的差异发现，MCM六聚体蛋白MCM5和MCM7在G1/S期看上去没有与CREPT相互作用，但在其他阶段仍然保持与CREPT相互作用(图6A)。该结果表明CREPT在G1/S转换期可能与MCM六聚体分离，这可能是由于CREPT的降解。
MCM六聚体包含6个MCM，包括MCM2至MCM7。为了验证CREPT和MCM六聚体的相互作用，在293T细胞中过表达了Myc-CREPT和Flag-MCM5。IP实验表明，Myc-CREPT和Flag-MCM5在未同步的293T细胞中相互作用强烈(图6B)。还观察到Myc-CREPT与Flag-MCM7相互作用(图14A)，Myc-CREPT与Flag-MCM2相互作用(图14B)，这表明CREPT与MCM六聚体结合。为了确认内源性相互作用，发明人在不同的交联条件下使用针对CREPT的抗体进行了co-IP实验(图14C)。结果表明，CREPT和MCM5在10分钟的交联下相互作用(图6C)。还观察到当将同步化的细胞释放0到8小时时，CREPT和MCM5强烈相互作用，但它们的相互作用看上去在释放后10小时减弱(图6D)。值得注意的是，在释放细胞后的第10小时，CREPT维持在最低水平，对应于正在出现的SKP2和Cyclin E1(图6D，裂解物)。这些观察结果表明，由于CREPT降解，CREPT/MCM相互作用在G1/S阶段受损。发明人进一步使用未降解的突变CREPT进行IP实验，结果表明，Myc-CREPT(S134A/S166A)与Flag-MCM5的相互作用比WT蛋白和Myc-CREPT(S133E/S166E)与Flag-MCM5的相互作用更强(图6E)。该结果表明CREPT的降解导致其与MCM六聚体解离。
为了破译CREPT/MCM相互作用和解离，发明人检查了MCM六聚体在染色质DNA上的占有率。为此，使用了不同的固定策略对MCM5和CREPT蛋白进行染色。结果表明，使用1％多聚甲醛直接固定时，MCM5在细胞中均匀染色(图14D，上图)，但在固定前使用TritonX100预提取时，在某些细胞中变为阴性(图14D，下图)。而CREPT未在预提取的细胞中染色，这意味着CREPT不直接与DNA结合。为了查明CREPT的降解是否调节MCM六聚体在染色质DNA上的占有率，过表达了未降解的CREPT突变蛋白Myc-CREPT(S134A/S166A)并在预提取的条件下染色MCM5。结果表明，当Myc-CREPT(S134A/S166A)过表达时，MCM5被强烈染色(图6F和图6G)，这意味着双MCM六聚体加载到染色质DNA上，且细胞周期停滞于G1末期或G1/S期。FACS分析证实CREPT(S134A/S166A)的表达导致S期细胞显著减少(图14E)。值得注意的是，所有MCM5阳性细胞的核都变大，并且在Myc-CREPT(S134A/S166A)过表达的细胞中显示出EdU阴性染色(图6G，见EdU染色)。这些结果表明，所有具有Myc-CREPT(S134A/S166A)过表达的MCM5强阳性细胞在进入S期之前细胞周期就阻滞了。综上，所有结果表明CREPT的降解使得MCM六聚体解离，并且这种解离的失败使细胞周期在进入S期之前停滞。
实施例6.未降解的CREPT变体使DNA复制叉中止
未降解的CREPT突变体通过与MCM六聚体保持结合而导致细胞死亡并使细胞周期停滞，因此发明人验证了CREPT-MCM复合物是否在G1/S转变期诱导基因组胁迫。由于基因组胁迫导致DNA损伤，发明人进行了TUNEL染色实验来检查DNA链断裂。结果表明，CREPT(S134A/S166A)的过表达导致WT细胞和CREPT缺失型细胞中存在显著的TUNEL信号，而WT蛋白和CREPT(S134E/S166E)的过表达显示出阴性信号(图15A)。值得注意的是，CREPT(S134A/S166A)的过表达在CREPT缺失型细胞中产生的TUNEL信号比在WT细胞中强得多(图15A，比较KO与Mock)。相应地，还观察到γH2AX焦点出现在CREPT(S134A/S166A)过表达的细胞中(图15B)。这些结果表明未降解的CREPT变体引起了DNA损伤。
为了确认该DNA损伤是否是由于未降解的CREPT变体引起的基因组胁迫，发明人检测了由复制蛋白A2(RPA2)形成的焦点，RPA2与单链DNA(ssDNA)结合并响应于复制压力而磷酸化。用针对总RPA2的抗体进行的IF染色显示，CREPT(S134A/S166A)在HeLa细胞中的过表达导致RPA2焦点增多，且蛋白水平增加(图7A，参见ctrl)。当用HU(一种dNTP合成抑制剂，其阻断DNA复制)处理细胞时，RPR2焦点大大增加(图7A，比较HU和ctrl)。进一步检查磷酸化的RPA2(p-RPA2)时观察到，CREPT(S134A/S166A)过表达的细胞中出现了阳性焦点，并且在HU处理下大大增加了(图7B)。这些结果表明未降解的CREPT蛋白变体导致了基因组胁迫。
由于在表达CREPT(S134A/S166A)的细胞中MCM-DNA解离失败，我们调查了未降解的CREPT变体诱导的细胞死亡是否是由DNA复制中断的基因组胁迫引起的。为此检查了新合成的DNA纤维。在HU阻断后释放细胞，并允许CIdU并入。IF染色结果显示，当CREPT(S134A/S166A)表达了12小时时，CIdU标记的DNA纤维轨迹的长度缩短(图7C)。为了进一步证实这一结果，进行了双重IdU和CIdU标记实验。结果表明，与WT细胞相比，在CREPT(S134A/S166A)细胞中，IdU标记的纤维的长度减少了(图7D)。与此一致地，代表正常条件下复制速率的CIdU标记的纤维在CREPT(S134A/S166A)细胞中变短(图7D)。定量分析表明，与WT细胞相比，在CREPT(S134A/S166A)过表达的细胞中诱导了更多的复制停滞纤维(CIdU+IdU-轨迹)(图7D)。这些结果表明，未降解的CREPT变体可能通过影响停滞的复制叉而导致DNA合成缺陷。
材料和方法
以上实施例中使用的材料和方法如下所述。
质粒和siRNA
HA-CREPT、Flag-CREPT、Myc-CREPT、Myc-CREPT-CID、Myc-CREPT-CCT、GSTCREPT、GFP-P15RS和Myc-P15RS质粒由发明人的实验室自己构建。Flag-MCM2质粒由孔道春博士(北京大学生命科学学院)馈赠。pRK5-HA-UBI(#17608)、pRK5-HA-UBI-K11(#22901)、pRK5-HA-UBI-K48(#17605)、pRK5-HA-UBI-K63(#17606)和pSpCas9(BB)-2AGFP(PX458,#48138)购自Addgene。Flag-SKP1、Flag-SKP2、Flag-CUL1、Flag-MCM5和Flag-MCM7由cDNA产生。CREPT突变的质粒通过定点诱变(Muta-directTM，SBS Genetech)产生。SKP2和CUL1 siRNA双链体由Lipofectamine RNAi MAX(Invitrogen)转染，寡核苷酸序列分别为AAUCUAAGCCUGGAAGGCCUGdTdT和UAGACAUUGGGUUCGCCGUdTdT。
CRISPR-Cas9敲入细胞系
HeLa细胞用于构建CRISPR-Cas9敲入细胞系。根据张锋的实验室指导(//crispr.mit.edu/)设计和优化了短向导RNA(sgRNA)寡核苷酸。sgRNA序列为CTCCTTCTCTGAGTCGGCGC。退火的sgRNA和BbsI消化的Px458载体通过溶液I(Takara)连接以构建Cas9 DNA剪切质粒。另一方面，将GFP的编码序列克隆并连接到PCDNA 3.1-HA载体上以构建GFP转录质粒。HeLa细胞与Cas9 DNA剪切和GFP转录质粒共转染。流式细胞仪对GFP阳性HeLa细胞进行分选，然后将单个细胞接种在96孔板中以选择DNA重组克隆。一周后，利用基因组插入的GFP表达来筛选细胞。
细胞周期同步
通过双胸苷阻滞(DTB)将细胞同步在G1/S期。细胞用2mM胸苷处理至少18小时，在新鲜培养基中释放8小时，然后用2mM胸苷再处理至少16小时。通过胸苷-诺考达唑阻滞使细胞同步在G2/M期。细胞用2mM胸苷处理至少24小时，释放3小时，然后用340nM诺考达唑处理至少16小时。在所示时间收获细胞。通过流式细胞仪分析验证收获细胞的细胞周期阶段。对于MG132处理，在收获前4小时将MG132添加到DLD1细胞中。
体外蛋白测定
由于SKP2蛋白在原核表达系统中不稳定。利用pET22b-SKP1、pET30A-SKP2和GST-CREPT蛋白进行体外蛋白相互作用测定。免疫沉淀测定验证了GST-CREPT和pET30A-SKP2之间的相互作用。
利用纯化的GST、GST-CREPT(野生型)或GST-CREPT(S134A/S166A)进行体外激酶测定，在30℃下将蛋白在激酶缓冲液(10mM HEPES(pH7.5)，50mM NaCl,2mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇,1mM EGTA和0.1mM ATP)中与Myc-Cyclin E/Myc-CDK2蛋白一起温育30分钟。利用SDS上样缓冲液停止反应。通过蛋白质印迹检测CREPT的磷酸化。
DNA纤维分析
DNA纤维实验如之前所述进行(Genois et al.,2021)。简言之，首先用50mM CldU标记DLD1细胞，用PBS洗涤两次并用250mM IdU标记。收获细胞并悬浮在冷PBS中，至浓度为1～1.5×106个细胞/ml，然后将3ul细胞液与7ul铺展缓冲液(0.5％SDS、200mM Tris-HClpH7.4、50mM EDTA)混合,并涂抹在硅烷化的载玻片上。将载玻片倾斜成30-60°角以铺展纤维，并在室温下放置15分钟。DNA纤维在甲醇:乙酸(3:1)中固定20分钟。干燥后，载玻片在4℃下保存过夜。DNA纤维在2.5M HCl中变性30分钟，并用3％BSA封闭60分钟。CldU和IdU用大鼠抗BrdU和小鼠抗BrdU在室温下检测2小时，然后用Alexa488抗小鼠和Cy3抗大鼠二抗在室温下结合1小时。载玻片用Prolong Gold Antifade Reagent固定。在Olympus FV3000共聚焦显微镜上使用60X物镜对纤维进行成像。
免疫荧光测定
在预提取方法中，为了提取可溶性蛋白质，首先在冰上用1mL透化缓冲液(含有0.2％TritonX-100、20mM HEPES pH＝7.4、100mM NaCl和300mM蔗糖)处理活细胞5分钟。除去透化缓冲液后，将细胞用2％多聚甲醛在室温下固定10分钟。在直接固定法中，细胞首先在室温下用2％多聚甲醛固定10分钟。然后，用PBS中的0.3％Triton X100透化细胞15分钟，并用PBST中的10％BSA封闭。固定的细胞与指定的一抗在室温下温育2小时或在4℃下温育过夜。在与荧光二抗温育并在Prolong Gold中封片后，在Olympus FV3000共聚焦显微镜上用60X物镜对细胞进行成像。
实施例7.CREPT磷酸化泛素化抑制剂的筛选
7.1作为潜在CREPT磷酸化泛素化抑制剂的小分子化合物的预测
利用预测工具SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和SEA(Similarity ensemble approach；https://sea.bkslab.org/)共同预测CREPT的小分子磷酸化抑制剂，得到并合成了5种候选小分子化合物#1至#5。由于CREPT的磷酸化是其泛素化的前提，因此这5种候选小分子化合物#1至#5是潜在的CREPT磷酸化泛素化抑制剂。
7.2候选小分子化合物对CREPT泛素化的影响
1)将293T细胞分到6cm的培养皿中，37℃培养24小时。转染图16中指定的质粒(HA-Ub和/或Myc-CREPT)至细胞中，5小时后换入新鲜培养基。
2)转染24小时后使用1ml RIPA裂解液收集细胞，4℃裂解1小时。13000rpm4℃离心10分钟。取800μl上清加入50μl protein plus beads和5μl抗myc抗体，标记为IP样品，4℃旋转温育过夜。取50μl上清加入等量的2x上样缓冲液，标记为裂解液样品。
3)IP样品使用细胞裂解缓冲液离心洗脱4次，每次10分钟。洗脱后的IP样品加入50μl的2x上样缓冲液。IP与裂解液样品100℃煮10分钟。SDS PAGE跑胶检测。
结果如图16所示，未经候选抑制剂处理的CREPT野生型蛋白能够被泛素(Ub)泛素化(图16的第三道)，阴性对照CREPT的突变体SA对照组检测不到泛素化。在添加候选化合物#1至#5的条带中，#4的泛素化明显减弱(相对于未经处理的野生型蛋白的泛素化水平下降了约20％)。
上述结果证明化合物#4是有效的CREPT磷酸化泛素化抑制剂。化合物#4的结构式如下：
Figure SMS_2
7.3候选小分子化合物对细胞增殖的影响
1)取对数生长期的DLD1(人结直肠腺癌上皮细胞)或MGC803(人胃癌细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，对活细胞进行计数，用含10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×104细胞/L。
2)按1:1比例加10mL培养液和10mL细胞稀释液混合后，取0.2mL混合液加入96孔板的每个孔中，共有3个重复孔。置于37℃、5％CO2温箱中培养12小时。
3)取上述5种候选小分子化合物#1至#5并用DMSO溶解，每种化合物的初筛浓度为10μM(DLD1细胞)或5μM(MGC803细胞)。每种化合物做3个重复；每种化合物都是以10μM(DLD1细胞)或5μM(MGC803细胞)的浓度温育3天，然后利用CCK测定细胞增殖情况。测量前，每孔换成混匀的10μl CCK-8溶液和90μl完全培养基(加了相应量CCK-8溶液及细胞培养液的孔作为空白对照)。37℃温育3小时。测定450nm波长下的吸光度。计算和统计结果并画图，结果如图17的A(DLD1细胞)和B(MGC803细胞)所示。
可以看出，作为CREPT磷酸化泛素化抑制剂的#4化合物明显抑制了细胞增殖，这说明测试浓度的化合物#4在一定程度上抑制了CREPT的降解，导致部分细胞凋亡，该结果与实施例2-4的结果一致。
以上描述了本发明的技术思想和具体实施方式，但应当理解，上述具体实施方式不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以理解，在不脱离本发明的实质的情况下，可以对具体实施方式中所显示的发明进行多种修改和/或变化，修改和/或变化后的实施方式也涵盖在本发明的范围内。因此，本发明的实施方式仅是说明性的且非限制性的。
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Claims (41)

1.一种蛋白，其通过对SEQ ID No:4的134和166位点进行磷酸化失活修饰而得到，所述磷酸化失活修饰使得当所述蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述蛋白保持非泛素化状态，从而使所述蛋白在所述真核细胞中不被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。
2.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
3.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。
4.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
5.一种蛋白，其与权利要求1至4中任一项所述的蛋白具有(i)90％以上的序列同一性和(ii)相同的134和166位点上的磷酸化失活修饰。
6.在权利要求1至5中任一项所述的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列的蛋白。
7.编码权利要求4所述的蛋白的核酸。
8.包含权利要求7所述的核酸的载体。
9.包含权利要求8所述的载体的细胞。
10.权利要求1-6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体在制备抑制真核细胞增殖、抑制真核细胞的DNA复制、调控真核细胞的细胞周期或杀灭真核细胞的试剂中的应用。
11.权利要求1-6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体在制备抗癌药中的应用。
12.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i)向受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体；或者
ii)利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术编辑受试者癌细胞基因组中的CRPET基因，以使所述癌细胞表达权利要求4所述的蛋白。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述i)还包括：在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，降低或消除受试者的癌细胞中的野生型CREPT的表达。
15.源自非人真核生物的人CREPT的同源蛋白，其在对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点处具有磷酸化失活修饰，所述磷酸化失活修饰使得当所述同源蛋白位于所述真核生物的G1末期或G1/S转换期的细胞中时，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点保持非磷酸化状态且所述同源蛋白保持非泛素化状态，从而使所述同源蛋白在所述细胞中不会被降解，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。
16.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述真核生物是酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥。
17.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。
18.如权利要求15所述的同源蛋白，其中，所述对应于SEQ ID No:4的134和166位点的同源性位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸突变为丙氨酸。
19.如权利要求15所述的同源蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:6。
20.一种蛋白，其选自：
i)在权利要求15至19中任一项所述的蛋白的N端和/或C端连接有标签序列或引导序列的蛋白；或
ii)与权利要求15至19中任一项所述的蛋白具有90％以上的序列同一性且在所述同源性位点上具有相同的磷酸化失活修饰的蛋白。
21.编码权利要求18或19所述的同源蛋白的核酸。
22.包含权利要求21所述的核酸的载体。
23.包含权利要求22所述的载体的细胞。
24.一种鉴别处于G1末期或G1/S转换期的真核细胞的方法，所述方法包括：
1)制备能够内源性表达带可检测标记的人CREPT蛋白或其在非人真核生物中的同源蛋白的真核细胞，并在允许细胞周期进行的条件下培养该真核细胞；
2)利用所述可检测标记观察或测量所述真核细胞中的所述人CREPT蛋白或所述同源蛋白的表达水平；
3)将所述人CREPT蛋白或所述同源蛋白的表达水平最低的细胞鉴别为处于G1末期或G1/S转换期的细胞；
其中，所述人CREPT蛋白的序列为SEQ ID No:4。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述可检测标记是同位素标记、荧光标记或量子点标记或者是能够进一步与同位素标记、荧光标记或量子点标记结合的标记，优选为GFP。
26.如权利要求24所述的方法，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞。
27.一种筛选CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂的方法，其中，所述修饰剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在真核细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：
i)将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；
或者
ii)在体外将模拟非磷酸化状态的候选修饰剂与CREPT蛋白温育，并在Cyclin E/CDK2激酶的催化条件下检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平，
如果经步骤i)或ii)处理的CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平相对于未经处理的对照下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述候选修饰剂筛选为CREPT蛋白的非磷酸化非泛素化修饰剂。
28.一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：
i)将待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的被同步至G1期的真核细胞中，然后释放并培养所述真核细胞，并在所述真核细胞存活时检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；或者
ii)在体外将待鉴定的物质与CREPT蛋白温育，并在Cyclin E/CDK2激酶的催化条件下检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平；
如果经步骤i)或ii)处理的CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平相对于未经处理的对照下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂，否则所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中，检查所述CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化水平的步骤采用质谱法或免疫沉淀法来进行。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述免疫沉淀法包括：使用识别CREPT蛋白的S134和S166位点的磷酸化的抗磷酸化抗体来进行免疫沉淀。
31.一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使CREPT蛋白的S134和S166位点保持持续非磷酸化状态，从而使所述CREPT蛋白在细胞中保持非泛素化状态且不会降解；所述CREPT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述方法包括：
i)将待鉴定的物质加入表达CREPT蛋白的真核细胞中并培养所述真核细胞，和
ii)使用免疫沉淀法检查所述真核细胞的CREPT蛋白的泛素化水平；
与未经所述物质处理的对照细胞中CREPT蛋白的泛素化水平相比，如果经处理的细胞中的CREPT蛋白的泛素化水平下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为CREPT蛋白的磷酸化抑制剂，否则所述物质不是CREPT蛋白的磷酸化抑制剂。
32.如权利要求30所述的方法，其中，在步骤i)之前，所述方法还包括：使用预测工具SwissTargetPrediction和SEA针对CREPT来设计所述待鉴定的物质。
33.如权利要求30所述的方法，其中，步骤ii)包括用识别CREPT蛋白的抗CREPT抗体和识别泛素的泛素抗体对CREPT蛋白的泛素化水平进行定量。
34.一种抑制CREPT蛋白在真核细胞中的降解的方法，所述方法包括：
1)使选自SKP2抑制剂、CUL1抑制剂、neddylation抑制剂和CDK2抑制剂的抑制剂进入表达CREPT的真核细胞中；和/或
2)对CREPT蛋白的第134和166位点进行磷酸化失活修饰，使得当经修饰的蛋白位于G1末期或G1/S转换期的真核细胞中时，所述134和166位点保持非磷酸化状态且所述经修饰的蛋白保持非泛素化状态，从而使所述经修饰的蛋白不被降解。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、犬、猫、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是氨基酸突变和/或化学修饰。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述134和166位点上的所述磷酸化失活修饰是将丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)。
38.如权利要求34所述的方法，其中，所述SKP2抑制剂是针对SKP2的双链siRNA，其序列为AAUCUAAGCCUGGAAGGCCUGdTdT；所述CUL1抑制剂是针对CUL1的双链siRNA，其序列为UAGACAUUGGGUUCGCCGUdTdT；所述neddylation抑制剂是MLN4924。
39.一种蛋白，其选自：
1)通过将SEQ ID No:4的166位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；
2)通过将SEQ ID No:8的136位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；
3)通过将SEQ ID No:8的174位丝氨酸突变为丙氨酸而得到的蛋白；
4)通过将SEQ ID No:4的134和166位丝氨酸均突变为半胱氨酸而得到的蛋白；
5)通过将SEQ ID No:4的166位丝氨酸突变为半胱氨酸而得到的蛋白；
6)通过将SEQ ID No:8的136位丝氨酸突变为半胱氨酸而得到的蛋白；
7)通过将SEQ ID No:8的174位丝氨酸突变为半胱氨酸而得到的蛋白；
8)通过将SEQ ID No:8的136和174位丝氨酸均突变为半胱氨酸而得到的蛋白；和
9)与1)至8)中的任一种蛋白具有90％以上的序列同一性且具有相同的丙氨酸或半胱氨酸突变的蛋白。
40.编码权利要求39所述的蛋白的核酸。
41.包含权利要求40所述的核酸的载体。
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