CN116139103A - 一种矿化铁蛋白纳米药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种矿化铁蛋白纳米药物及其制备方法，将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液加入到上述溶液中搅拌反应，制备得到矿化铁蛋白。同时该矿化铁蛋白纳米药物还可以在外壳中装载水溶性小分子药物，采用上述矿化方法，在添加钙离子时同时添加水溶性小分子药物得到外壳载药矿化铁蛋白纳米药物。该矿化铁蛋白纳米药物空腔中也可以载药，将小分子化疗药物加入铁蛋白溶液中，通过浓度扩散的方法使药物扩散进入空腔实现装载，再利用上述矿化方法制备得到内腔载药的矿化铁蛋白纳米药物。该纳米药物还可以实现外壳和内腔的同时装载。本发明制备的矿化铁蛋白药物可以增强肿瘤靶向，抑制肿瘤生长。

Description

一种矿化铁蛋白纳米药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种矿化铁蛋白纳米药物，其主要含有铁蛋白内核和磷酸钙壳层，该矿化铁蛋白纳米药物可以单独或者装载不同的药物组合用于肿瘤的治疗。
技术背景
虽然目前肿瘤药物治疗的方法较为多样，但是肿瘤患者的总体生存率依旧较低。其中一个重要的原因是给药后到达肿瘤部位的药物数量少，这极大降低了肿瘤的治疗效果，同时这种“脱靶”效应也会给正常组织带来严重的毒副作用。
随着纳米技术的发展，纳米药物在肿瘤靶向递送中扮演着越来越重要的角色。通过合理设计纳米材料可以提高药物在肿瘤中的积累。尽管这种方法取得了一些进展，这种纳米药物仍然存在一定的问题。主要是纳米载体一般为外源性材料(如硅纳米颗粒、金纳米颗粒和碳纳米管等)，其生物相容性较差，体内安全性有待进一步提高，限制了其临床转化应用。这一问题也促进研究人员寻找内源性的材料来构建纳米药物载体。除了克服生物相容性的限制外，这种策略还可以利用内源性材料体内固有的作用方式，实现更为安全高效的肿瘤靶向递送。
这种内源性生物材料的一个典型例子是铁蛋白，是一种可以在体内以可控的方式储存和释放铁的蛋白质。铁蛋白广泛存在于动物、植物、微生物体内，生物相容性好，是一种极具潜力的药物载体。铁蛋白特殊的结构和性质使其作为药物递送载体材料时具有天然优势：(1)铁蛋白是一种纳米笼型结构蛋白，粒径约为12nm，表面的孔道适合小分子药物扩散进入蛋白，内部8nm的空腔为药物装载提供了空间。(2)铁蛋白的受体CD71在实体肿瘤组织高表达，因此铁蛋白可以不用连接靶向配体实现肿瘤组织的高效靶向。(3)铁蛋白是24个亚基组装成的高度对称的结构，且亚基之间存在大量的离子键和氢键，因此其稳定性高，对环境的耐受能力强，可以在较宽泛的pH(2～10)和温度(<70℃)中稳定存在，提高了载体材料的稳定性。(4)铁蛋白可以在较短的时间内从培养的细菌中进行表达和提取，其纯化流程和技术相对成熟，适合规模化制备。
但是铁蛋白作为药物载体直接进行静脉注射会存在肝脏截留的问题。主要原因是铁蛋白受体不仅在肿瘤部位高表达，正常肝脏组织也会表达。静脉注射后会有较多的铁蛋白分布在肝脏组织，相应地，进入肿瘤组织的铁蛋白的量就会大大减少，降低肿瘤的治疗效果，同时会引发肝脏的潜在毒副作用。因此，解决铁蛋白肿瘤靶向递送中的肝脏截留问题，对其临床应用具有重要意义。
发明概述
本申请的发明人发现，通过仿生矿化的方法在铁蛋白表面原位生长一层pH敏感的磷酸钙壳层，可以使铁蛋白纳米药物静脉注射以后不会和肝脏部位的铁蛋白受体结合，减少在肝脏组织的富集。到达肿瘤部位以后，肿瘤的酸性环境会将磷酸钙壳层溶解，暴露出来铁蛋白靶向肿瘤细胞。该矿化铁蛋白的外壳和内腔可以分别装载抗肿瘤药物抑制肿瘤的生长。同时外壳和内腔联合装载药物可以发挥更有效的抗肿瘤效果。
基于此，本申请提供一种表面包裹磷酸钙的矿化铁蛋白纳米药物，其主要含有铁蛋白和磷酸钙，其中所述磷酸钙包裹在铁蛋白表面，晶型为无定型。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，其中磷酸钙壳层的厚度为1-1000nm，优选的磷酸钙壳层的厚度为1-100nm，更优选的磷酸钙壳层的厚度为1-10nm。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，所述铁蛋白具有内部空腔结构，优选该铁蛋白是由重链亚基自组装形成。该自组装过程是由分子间弱的非共价相互作用，包括疏水力、范德华力等而自发形成的有序聚集体。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，外壳中装载的药物是小分子药物，优选的是光敏剂，化疗药物、小分子抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫刺激剂、免疫佐剂，例如吲哚菁绿(ICG)、酪氨酸酶小分子抑制剂、aCD47抗体、R837。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，内腔中装载的化疗药物是抗肿瘤药物，优选的是烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂，更优选的是抗实体肿瘤和白血病的药物，例如三氧化二砷、阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、铂类、柔红霉素。
本申请的发明人发现，铁蛋白表面带有负电荷可以和吸附溶液中的钙离子，在溶液中磷酸根的作用下可以在表面形成磷酸钙的壳层。
基于此，本申请提供一种矿化铁蛋白纳米药物的制备方法，含有以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到矿化铁蛋白。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳中装载水溶性小分子药物的方法，含有以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液和水溶性小分子药物加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到外壳装载抗肿瘤药物的矿化铁蛋白纳米药物。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白空腔中装载化疗药物的方法，含有以下步骤：将离子型小分子化疗药物加入铁蛋白溶液中，通过浓度扩散的方法使药物扩散进入空腔实现装载，实现药物在铁蛋白空腔中的原位装载。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳和内腔中联合装载药物的方法，含有以下步骤：首先在铁蛋白空腔中按照上述方法装载离子型小分子化疗药物。将上述内腔载药矿化铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液和水溶性小分子药物加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到外壳和内腔联合装载抗肿瘤药物的矿化铁蛋白纳米药物。
本发明制备的矿化铁蛋白可以降低在肝脏中的分布，提高肿瘤中的蓄积。该矿化铁蛋白的外壳和内腔可以分别装载抗肿瘤药物抑制肿瘤的生长。同时外壳和内腔联合装载药物可以发挥更有效的抗肿瘤效果。
附图说明
图1全重链铁蛋白透射电镜图
图2铁蛋白静脉注射后小鼠体内分布活体成像图
图3铁蛋白静脉注射后小鼠离体组织成像及肝脏肿瘤荧光强度统计图
图4矿化铁蛋白透射电镜图
图5矿化铁蛋白能谱图
图6矿化铁蛋白静脉注射后小鼠体内分布活体成像图
图7矿化铁蛋白静脉注射后小鼠离体组织成像图
图8不同治疗组小鼠肿瘤pH统计图
图9不同治疗组小鼠肿瘤部位M1、M2巨噬细胞比例及M1/M2比值统计图
图10不同治疗组小鼠肿瘤部位钙化CT成像图
图11不同治疗组小鼠肿瘤生长曲线图
图12不同治疗组小鼠生存曲线图
图13装载ICG的矿化铁蛋白透射电镜图
图14不同治疗组小鼠肿瘤生长曲线图
图15不同治疗组小鼠生存曲线图
图16矿化含砷铁蛋白透射电镜图
图17矿化含砷铁蛋白中砷价位的X射线光电子能谱图
图18不同治疗组小鼠肿瘤生长曲线图
图19不同治疗组小鼠生存曲线图
图20包裹ICG的矿化含砷铁蛋白透射电镜图
图21不同治疗组小鼠肿瘤生长曲线图
图22不同治疗组小鼠生存曲线图
发明详述
本申请提供一种表面包裹磷酸钙的矿化铁蛋白纳米药物，其主要含有铁蛋白和磷酸钙，其中所述磷酸钙包裹在铁蛋白表面，晶型为无定型。
铁蛋白作为一类广泛存在的生物纳米材料，最初是在19世纪末由德国药物学家Schmiedeberg从马的肝脏中发现，1937年捷克生物学家Laufberger首次从马脾脏中纯化得到。研究显示，铁蛋白是体内储存铁和维持细胞铁平衡的一种蛋白质，从厌氧微生物到好氧微生物、从细菌到高等植物和动物中均有发现。由于铁蛋白具有良好的生物兼容性、低毒性和稳定性等生物学特性，被认为在生物纳米技术和生物医学领域具有巨大的应用前景。
铁蛋白是一种广泛分布于自然界生物体内的多功能多亚基球形蛋白，该球形蛋白围成的空腔内径为8nm，外径为12nm。球形蛋白外壳由24个亚基构成，外壳上含有8个亲水通道和6个疏水通道，为铁蛋白中铁的贮存及释放提供了通道；壳内包裹着由铁和磷酸盐组成的无机纳米氧化物核，该铁核是由蛋白壳包围的三价铁氧化物及磷酸盐化合物的水合复合物，每分子铁蛋白的铁核储存的铁原子可以多达4500个。铁核和铁蛋白通过磷酸根和蛋白壳内腔的氨基酸残基相联系，或铁核的铁离子和蛋白壳内腔表面的半胱氨酸残基的侧链巯基通过铁硫键相联系。
铁蛋白通常由24个亚基构成，是由重链和轻链组成的纳米笼型结构蛋白，具有4/3/2八面体对称性，分子量约为450KDa，其蛋白外径为12nm，内径为8nm。铁蛋白通常表面含有8个亲水孔道，6个疏水孔道，孔径为
Figure BDA0003363023230000051
小分子物质(如过氧化氢、巯基乙酸、连二亚硫酸钠及金属盐等)均可以通过孔道进出脱核铁蛋白，实现腔内外物质交换。脱核铁蛋白轻链(L亚基，分子量约19kDa)和铁蛋白重链(H亚基，分子量约21kDa)通常均由4个α-helices构成。
虽然在哺乳动物中，H亚基与L亚基一级结构的同源性约为50％，而且三级结构也非常相似，但是两种亚基的功能截然不同。首先，在储存铁的过程中发挥着不同的作用，H亚基中含有Fe的氧化酶位点，包括两个Fe结合位点，Fe原子可以和氨基酸残基配位，在氧化剂的存在下实现Fe2+向Fe3+的转化；L亚基中缺少Fe氧化酶活性中心，但L亚基为Fe核的形成和矿化提供有效位点，因此两种亚基协同作用实现了Fe的存储。其次，在铁蛋白通过铁蛋白受体和细胞结合时，是重链亚基和受体结合，轻链不参与和受体的结合。因此，为了实现更高效率的铁蛋白靶向，选择全重链铁蛋白尤为重要。
优选的是，在本发明中所述的矿化铁蛋白纳米药物中，所述铁蛋白是含铁或者不含铁的铁蛋白，优选该铁蛋白中铁的保留量占铁最高装载量的百分比低于50％，例如低于40％，低于30％，低于20％，低于10％，低于5％，低于2％，低于1％，低于0.5％，低于0.05％，更优选低于0.02％，该铁蛋白具有内部空腔结构，优选该铁蛋白由铁蛋白重链亚基自组装形成其内部空腔结构。
磷酸钙作为机体骨骼和牙齿的主要成分，具有很高的生物相容性；同时，磷酸钙颗粒还具备pH敏感性、高载药率和可控释放等理想药物载体所必需的条件。因此，利用磷酸钙颗粒作为药物递送载体具有较大的潜力。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，其中磷酸钙壳层的厚度为1-1000nm，优选的磷酸钙壳层的厚度为1-100nm，更优选的磷酸钙壳层的厚度为1-10nm。
矿化铁蛋白的外壳适合装载药物，主要原因如下：(1)铁蛋白表面包裹的磷酸钙为无定型壳层，适合在矿化过程中掺杂小分子药物。(2)磷酸钙壳层中的钙离子带正电荷，适合与药物分子中的负电基团(如磺酸基团)结合，从而促进药物分子的装载。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，外壳中装载的药物是亲水性小分子药物，优选的是光敏剂，化疗药物、小分子抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫刺激剂、免疫佐剂，例如吲哚菁绿(ICG)、酪氨酸酶小分子抑制剂、aCD47抗体、R837。
矿化铁蛋白的内腔适合装载药物，主要原因如下：(1)铁蛋白表面具有孔道，适合离子型药物扩散进入铁蛋白空腔，实现装载。(2)铁蛋白具有pH等条件下的解聚和自组装特性，适合大分子型药物在自组装过程中包裹进入空腔，实现装载。(3)铁蛋白具有8nm左右的空腔，具有较大的药物装载空间。(4)铁蛋白内部空腔表面具有金属结合位点，可以实现含有金属离子的药物稳定装载。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，内腔中装载的化疗药物是抗肿瘤药物，优选的是烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂，更优选的是抗实体肿瘤和白血病的药物，例如三氧化二砷、阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、铂类、柔红霉素。
铁蛋白表面带有负电荷，同时含有酸性氨基酸残基，在溶液中可以和带正电的钙离子结合，形成钙离子富集的界面，在溶液中磷酸根的作用下，形成晶核。随着反应时间的延长，晶核逐渐生长，形成磷酸钙的壳层。
基于此，本申请提供一种矿化铁蛋白纳米药物的制备方法，含有以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到矿化铁蛋白。
优选的是，在本发明所述的制备方法中，所述DMEM培养基是商品化的培养基。
优选的是，在本发明所述的制备方法中，所述钙离子溶液是二价钙离子盐溶液，例如是氯化钙、硝酸钙、碳酸氢钙。
优选的是，在本发明中所述的制备方法中，其中所述铁蛋白需要经过预处理，铁蛋白是利用大肠杆菌表达出来的，表达方法如下：(1)将含有重链铁蛋白基因的质粒载体转染进入大肠杆菌，并利用抗生素抗性基因进行筛选。(2)将形成的单菌落转入培养瓶进行扩大培养。(3)收集扩大培养得到的菌体，利用超声破碎，离心去除多余沉淀。(4)利用凝胶过滤层析，将的到的上清进一步纯化，得到全重链脱核铁蛋白。
优选的是，在本发明中所述的矿化铁蛋白纳米药物中，所述铁蛋白是含铁或者不含铁的铁蛋白，优选该铁蛋白中铁的保留量占铁最高装载量的百分比低于50％，例如低于40％，低于30％，低于20％，低于10％，低于5％，低于2％，低于1％，低于0.5％，低于0.05％，更优选低于0.02％，该铁蛋白具有内部空腔结构，优选该铁蛋白由铁蛋白重链亚基自组装形成其内部空腔结构。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳中装载水溶性小分子药物的方法，含有以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液和水溶性小分子药物加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到外壳装载抗肿瘤药物的矿化铁蛋白纳米药物。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，外壳中装载的药物是亲水性小分子药物，优选的是光敏剂，化疗药物、小分子抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫刺激剂、免疫佐剂，例如吲哚菁绿(ICG)、三氧化二砷、酪氨酸酶小分子抑制剂、aCD47抗体、R837。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白空腔中装载化疗药物的方法，含有以下步骤：将离子型小分子化疗药物加入铁蛋白溶液中，通过浓度扩散的方法使药物扩散进入空腔实现装载，实现药物在铁蛋白空腔中的原位装载。再利用上述矿化方法制备得到内腔载药的矿化铁蛋白纳米药物。
优选的是，在所述矿化铁蛋白纳米药物中，内腔中装载的化疗药物是抗肿瘤药物，优选的是烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂，更优选的是抗实体肿瘤和白血病的药物，例如三氧化二砷、阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、铂类、柔红霉素。
本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳和内腔中联合装载药物的方法，含有以下步骤：首先在铁蛋白空腔中按照上述方法装载离子型小分子化疗药物。将上述内腔载药矿化铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液和水溶性小分子药物加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到外壳和内腔联合装载抗肿瘤药物的矿化铁蛋白纳米药物。
在优选的实施方式中，例如，将钙离子添加到含有铁蛋白的DMEM溶液中以后，铁蛋白表面的负电荷会吸附较多的钙离子，形成表面钙离子富集的界面，在溶液中磷酸根的作用下形成磷酸钙晶核，随着晶核的不断生长，形成磷酸钙壳层。
本发明制备的矿化铁蛋白纳米药物可以降低在肝脏组织中的分布，增强在肿瘤部位的富集。到达肿瘤部位以后可以调节肿瘤酸性微环境，同时促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型转化。纳米颗粒在肿瘤部位的溶解会造成肿瘤部位钙过载，诱发肿瘤部位钙化。
该矿化铁蛋白的外壳和内腔可以分别装载抗肿瘤药物抑制肿瘤的生长。同时外壳和内腔联合装载药物可以发挥更有效的抗肿瘤效果。
本发明还提供一种药物组合物，其含前述任一项本发明所述的矿化铁蛋白纳米药物以及药学上或生理学上可接受的辅料和/或添加剂，该药物组合物例如是抗肿瘤药物，优选是抗实体肿瘤和白血病药物。
本发明所使用的“药学上或生理学上可接受的”意思是对于药学和兽医领域的使用是可接受的，与制剂的其它成分相容且无毒，或与利益风险比合理地相称。“药学上或生理学上可接受的载体”或“稀释剂”包括任意且全部的溶剂、分散介质、涂覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。这样的载体或稀释剂的实例包括但不限于，水、盐水、Finger’s溶液和右旋糖溶液。如由医学专业人员所确定的，药学组合物的体积是基于希望的给药模式和个体患者的安全体积。载体的选择还取决于希望的给药模式。
本发明的组合物可以通过任何多种便利的方式来给药，包括但不限于全身给药(例如，静脉注射、胃肠外注射、吸入、透皮递送、口服递送、经鼻递送、直肠递送等等)和/或局部给药(例如，直接注射至目标组织中，通过插管递送至组织中，通过植入随时间释放的材料来递送至目标组织中)、通过泵、口服、胃肠外、骨、脑脊髓流体等递送进组织中，进一步的给药模式包括面颊、舌下、阴道、皮下、肌肉或皮下给药。
适用于胃肠外给药的组合物或制剂包括含水和不含水的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂或使得制剂与血液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的含水和不含水的无菌悬浮液。组合物可以存在于单位剂量或者多剂量的密封容器中，例如安瓿和管，并且可以在恰好使用前仅需加入无菌液体载体，例如用于注射的水的冷冻干燥条件(冻干的)下储存。
适用于静脉给药的组合物或制剂包括载体，例如生理盐水、抑菌水、或者磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物必须是无菌的且应当是流体，以利于用注射器来给药。这样的组合物在制备和储存期间应当是稳定的且必须在防止微生物，例如细菌和真菌污染的条件下储存。载体可以是分散介质，该分散介质含有，例如水；多羟基化合物，例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇；以及其它相容的适合的混合物。
液体药学组合物通常配制成具有在约3.0～9.0之间的pH，更优选在约4.5～8.5之间并且仍然更优选在约5.0～8.0之间。组合物的pH可以通过使用缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸来维持，通常采用的范围从约l mM～50mM。组合物的pH可以另外通过使用生理学可接受的酸或碱来进行调节。
所述药学组合物以预防有效量或治疗有效量(视情况而定，虽然预防可被视为治疗)给个体，这足以显示出对个体有利。通常，这将引起对个体有利的治疗上有用的活性。所施用的化合物的实际量，以及施用的速率和时间过程将取决于所处理的病症的性质和严重程度。处理的处方例如剂量决定等在全科医生和其它医生的责任范围内，并且通常考虑所处理的病症、个体患者的情况、递送位点、施用方法和医生已知的其他因素。
本文中公开的具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在说明本发明的几个方面。
实施例1铁蛋白的制备
取1μl重组的pET30a质粒载体(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)转化大肠杆菌(BL21(DE3))(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，42℃热击90s后冰上静置2min后涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素(购自北京索莱宝科技有限公司)的蛋白胨(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)培养平板(LB固体平板)上，37℃培养过夜。形成单菌落后，挑取单菌落于三角瓶中(含有10mL蛋白胨液体培养基)，37℃，220rpm过夜培养，之后离心收集细胞菌体。
将收集的细菌菌体用破碎缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、500mM NaCl，0.5mM二硫苏糖醇、1mM乙二胺四乙酸、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚、，0.2mM苯甲基磺酰氟，pH7.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率为400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。超声完毕，4℃离心(12000rpm，20min)，收集上清进行下一步纯化。上清中加入0.1mg/mL脱氧核糖核苷酸酶(购自北京索莱宝科技有限公司)和5mM MgCl2(购自北京索莱宝科技有限公司)，37℃水浴30min，后于90℃水浴，10min，最后放于冰水浴中，4℃离心(12000rpm，20min)去除变性蛋白。将离心后上清液透析到磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中过夜后用超滤管(截留分子量10KD)(Millipore公司)超滤离心(5500rpm，40min)，至体积剩余约3ml。之后用凝胶过滤层析进行精纯(填料：凝胶过滤介质S-75(美国通用电气公司)，上样量：3mL；流速：1mL/min；每管收集体积：0.5mL；柱体积(CV)：150mL；流动相：磷酸盐缓冲液(Gibco公司))，从而制得全重链人源铁蛋白。
实施例2铁蛋白的形貌表征
将实例1中制得的全重链铁蛋白(3mg/mL)取20μL滴加至超薄碳支持膜(中镜科仪膜科技有限公司)，待液滴蒸干后于醋酸双氧铀(中镜科仪膜科技有限公司)中进行负染5min，之后在120kV生物透射电镜(TEM)下进行观察样品的形貌，结果如图1所示。由图1可知，制得的脱核铁蛋白大小均匀，分散性好，为无核的球形蛋白结构。
实施例3铁蛋白的体内分布考察
通过构建小鼠HeLa肿瘤模型来分析铁蛋白的肝脏截留效应。选取5周左右雌性裸鼠，在其右腿皮下接种培养状态良好的HeLa细胞(1×106/只)。待肿瘤体积长到100mm3时，通过尾静脉给药的方式注射Cy7标记的铁蛋白Fn(2mg/只)。在不同的时间点对给药后的小鼠进行小动物活体成像。对于离体组织的成像，在给药后24小时将小鼠处死，取出心、肝、脾、肺和肾进行荧光成像。结果如图2、图3所示。
由图2、图3中小动物活体成像结果可知，在给药后的不同时间点(6，12，24，48和72h)，Fn均较多地被肝脏组织截留，进入肿瘤组织的量较少。对于离体组织的成像，也可以看到肝脏部位的荧光信号显著高于肿瘤部位。相应地，肝脏部位的荧光统计值是肿瘤部位的4倍左右。
实施例4矿化铁蛋白的制备
将1mg铁蛋白Fn分散于1mL DMEM培养基中，在4℃搅拌过夜。之后向溶液中添加5μLCaCl2(1M)并搅拌均匀。将矿化体系放于室温搅拌反应3h。将反应后的溶液10000g离心8min，收集到的沉淀即为矿化铁蛋白(Fn@CaP)。
实施例5矿化铁蛋白的形貌及元素表征
将矿化后的铁蛋白样品滴在铜网上，干燥后放于透射电镜下观察。利用透射电镜配置的能谱仪对矿化后的Fn@CaP进行元素分布的考察。由图4可知，矿化后的铁蛋白纳米颗粒粒径较为均一(约为24nm)，分散性好。如图5所示，通过TEM配置的能谱仪对其检测后发现，矿化后的纳米颗粒中含有钙(Ca)、磷(P)和氧(O)等CaP外壳的成分以及氧(O)、硫(S)等Fn内核的成分。
实施例6矿化铁蛋白的体内分布考察
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。待肿瘤体积长到100mm3时，通过尾静脉给药的方式注射Cy7标记的Fn@CaP(蛋白浓度为2mg/只)。对于体内分布考察，在不同的时间点(0，6，12，24，48，72h)对给药后的小鼠进行小动物活体成像。对于离体组织的成像，在给药后24小时将小鼠处死，取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织进行荧光成像。由图6可知，在给药后的6h，Fn@CaP在肝脏和肿瘤组织中均有分布。之后，Fn@CaP在肝脏中的分布逐渐减少，而在肿瘤中的量不断增加。在24h左右，Fn@CaP在肿瘤中的富集量可以达到最大。如图7所示，通过对给药后24h的离体组织进行成像也可以明显看到肿瘤部位的高效富集。
实施例7矿化铁蛋白的肿瘤微环境调节考察
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到100mm3，将小鼠分为3组，每组3只。尾静脉注射PBS、Fn或者Fn@CaP(蛋白浓度为1mg/mL)，间隔1天注射1次，共注射5次。最后一次给药结束48h后，通过腹腔注射的方式将100μL溶于PBS的pH敏感探针SNARF-1(5mM)注射到小鼠体内。20min后，将小鼠处死，并迅速取出肿瘤组织，利用手术刀切成两半。将制备好的肿瘤组织放置在小动物成像仪中进行成像。分别在640nm和580nm处进行成像，并统计两种波长下的荧光比值。结合标准曲线计算得到肿瘤部位的pH值。由图8可知，PBS组肿瘤部位的pH值大约是6.5，呈微酸性。单独的Fn不会对肿瘤pH值有影响，也是偏酸的环境；但是Fn@CaP组小鼠肿瘤的pH相比于PBS和Fn组显著升高，大约为6.9左右，说明Fn@CaP具有较强的调节肿瘤酸性微环境的能力。
对于肿瘤组织M1和M2巨噬细胞比例分析：将肿瘤组织取出，用剪刀剪碎、消化后进行研磨。将研磨后的样本用PBS重悬并用细胞筛网过滤，将多余的组织成分过滤掉。将过滤后的单细胞悬液用PBS清洗后，分成不同的组，用于流式抗体染色。将稀释后的抗体(F4/80、Ly6c和CD206)和细胞在4℃共孵育30min。PBS将多余的抗体洗掉后，流式上机分析。由图9可知，PBS组免疫活化相关的M1型巨噬细胞比例为9.7％，而免疫抑制相关的M2型巨噬细胞的比例是20.9％，因此M1与M2细胞比例的比值小于1；由于Fn组的M1与M2细胞比例的比值和PBS相似，因此Fn处理不会对肿瘤免疫微环境造成影响；值得注意的是，Fn@CaP组的M1与M2细胞比例的比值约为1.6，说明肿瘤组织中巨噬细胞的表型发生了变化，由免疫抑制的M2型极化为了免疫活化的M1型。
对于肿瘤组织钙化分析：在最后1次给药结束24h后，将小鼠进行MicroCT成像。之后将小鼠处死，将肿瘤组织迅速取出，再次进行MicroCT成像。由图10可知，在小鼠活体成像和离体组织的成像中，PBS和Fn组小鼠的肿瘤组织中没有钙化现象的发生，而Fn@CaP组小鼠的肿瘤部位有明显的钙化现象。
实施例8矿化铁蛋白的体内抑瘤效果评价
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到100mm3，将小鼠分为2组，每组6只。尾静脉注射PBS、Fn@CaP(蛋白浓度为1mg/mL)，间隔1天注射1次，共注射5次。肿瘤体积每隔1天检测1次。肿瘤体积的计算公式如下：V＝(L×W2)/2，其中，L为肿瘤的长，W为肿瘤的宽。同时观察小鼠的生存情况，记录小鼠的生存曲线。由图11，图12所示，相比于PBS治疗组，矿化铁蛋白治疗组小鼠的肿瘤体积得到抑制。相应地，小鼠的生存期得到延长。上述结果证明了矿化铁蛋白的体内抑瘤效果。
实施例9外壳装载ICG的矿化铁蛋白纳米药物的制备
在矿化铁蛋白纳米药物的磷酸钙外壳中可以实现ICG的装载。具体来说，将1mg铁蛋白分散于1mL DMEM培养基中，在4℃搅拌过夜。之后向溶液中添加5μL CaCl2(1M)和2μLICG(0.5mM)并搅拌均匀。将矿化体系放于室温搅拌反应3h。将反应后的溶液10000g离心8min，收集到的沉淀即为装载ICG的矿化铁蛋白纳米药物Fn@CaP/ICG。将样品避光保存。如图13所示，制备得到的装载ICG的矿化铁蛋白粒径约为24nm。
实施例10装载ICG的矿化铁蛋白对小鼠皮下宫颈癌的药效分析
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到300mm3，将小鼠分为3组(PBS、Fn@CaP/ICG、Fn@CaP/ICG+L组)(蛋白浓度为1mg/mL)，每组6只。对于Fn@CaP/ICG+L小鼠，静脉注射药物24h后，用808nm激光(1W/cm2)照射5min。肿瘤体积每隔1天检测1次。肿瘤体积的计算公式如下：V＝(L×W2)/2。同时观察不同治疗组小鼠的生存情况，记录小鼠的生存曲线。结果如图14、图15。
如图14、图15所示，Fn@CaP/ICG能够一定程度上抑制小鼠肿瘤的生长，同时延长荷瘤小鼠的生存时间。Fn@CaP/ICG+L组小鼠的肿瘤生长得到进一步的抑制，小鼠的生存时间显著延长。上述结果说明装载ICG的矿化铁蛋白具有抑制肿瘤的作用，进一步结合激光照射可以增强其治疗效果。
实施例11内腔装砷矿化铁蛋白的制备
在三口圆底烧瓶中(容量50mL)加入1.5ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)(购自Gibco公司)，13.5ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(50mM/L)(HEPES缓冲液)，4ml超纯水，然后称取30mg实例1中制备的脱核铁蛋白，溶解于上述混合溶液中，边搅拌(600rpm/min)边加入Fe(NH4)2(SO4)2溶液(0.1M/L)(与铁蛋白以1000:1的摩尔数加入到溶液中)，在半小时内加完，连续搅拌3h。之后离心(10000rpm，10min)，取上清，用滤膜(孔径0.45μm)过滤后，用超滤管(截留分子量10KD)(Millipore公司)超滤离心(5500rpm，40min)，至体积剩余约2.5ml。将其加入到单口圆底烧瓶(容量20mL)，然后补加5ml HEPEs(50mM/L)缓冲溶液，再加入1mlNaAsO2溶液(0.5Mol/L)，用HCl(2Mol/L)调pH等于7，将烧瓶置于加热搅拌器上，60摄氏度回流1.5小时。然后用超滤管(截留分子量10KD)超滤离心(5500rpm，45min)，至体积剩余3ml。将得到的混合溶液用透析袋(截留分子量7000D)(购自北京索莱宝科技有限公司)透析到磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)(购自Gibco公司)中过夜，然用超滤管(截留分子量10KD)(Millipore公司)超滤离心(5500rpm，40min)，至体积剩余约3ml，制成含砷纳米药物As/Fn的水溶液。
之后将As/Fn进行仿生矿化。具体来说，将1mg As/Fn分散于1mL DMEM培养基中，在4℃搅拌过夜。之后向溶液中添加5μL CaCl2(1M)并搅拌均匀。将矿化体系放于室温搅拌反应3h。将反应后的溶液10000g离心8min，收集到的沉淀即为矿化含砷铁蛋白As/Fn@CaP。
实施例12矿化含砷铁蛋白的形貌及装砷的价态表征
对于TEM分析，将制备得到的As/Fn@CaP滴于铜网上，干燥后放于透射电镜下观察。对于As价态分析，将制备得到的As/Fn分散于超纯水中后冻干成粉末状态，之后用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)进行测试。如图16所示，As/Fn@CaP粒径均一(约为24nm)，分散性较好。如图17所示，装载砷的价位为三价，和临床中使用的三氧化二砷的价位一致，保持了药效。
实施例13矿化含砷铁蛋白对小鼠皮下宫颈癌的药效分析
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到100mm3，将小鼠分为4组，每组6只。尾静脉注射PBS、ATO、As/Fn、As/Fn@CaP，间隔1天注射1次，共注射5次。肿瘤体积每隔1天检测1次。肿瘤体积的计算公式如下：V＝(L×W2)/2，其中，L为肿瘤的长，W为肿瘤的宽。同时观察小鼠的生存情况，记录小鼠的生存曲线。由图18、图19可知，ATO组小鼠的肿瘤体积与PBS组相比轻微降低，说明单独注射ATO不能明显抑制肿瘤的发展；As/Fn组小鼠的肿瘤负荷进一步降低，主要是由于药物的靶向性有所增加，肿瘤抑制效果得到提高；值得注意的是，相比于其他组，As/Fn@CaP组小鼠的肿瘤体积最小，证实了As/Fn@CaP较强的抗肿瘤效果。相应地，As/Fn@CaP治疗组小鼠在50天的时候全部存活，而其他治疗组小鼠在45天内全部死亡。以上结果共同表明As/Fn@CaP具有很好的抗肿瘤效果。
实施例14装载ICG的矿化含砷铁蛋白的制备
按照实施例11中的方法制备含砷铁蛋白。之后将含砷铁蛋白As/Fn进行仿生矿化并共装载ICG。具体来说，将1mg As/Fn分散于1mL DMEM培养基中，在4℃搅拌过夜。之后向溶液中添加5μL CaCl2(1M)和2μL ICG(0.5mM)并搅拌均匀。将矿化体系放于室温搅拌反应3h。将反应后的溶液10000g离心8min，收集到的沉淀即为As/Fn@CaP/ICG。将样品避光保存。如图20所示，制备得到的装载ICG的矿化含砷铁蛋白粒径均一(约为24nm)，分散性好。
实施例15装载ICG的矿化含砷铁蛋白对小鼠皮下宫颈癌的药效分析
首先构建HeLa荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到300mm3，将小鼠分为3组(PBS、As/Fn@CaP/ICG、As/Fn@CaP/ICG+L组)(蛋白浓度为1mg/mL)，每组6只。对于As/Fn@CaP/ICG+L组小鼠，静脉注射药物24h后，用808nm激光(1W/cm2)照射5min。肿瘤体积每隔1天检测1次。肿瘤体积的计算公式如下：V＝(L×W2)/2。同时观察不同治疗组小鼠的生存情况，记录小鼠的生存曲线。结果如图21、图22。
如图21、图22所示，As/Fn@CaP/ICG+L治疗组小鼠的肿瘤在第10天得到了完全的抑制，证实了其较强的抗肿瘤效果。进一步通过小鼠生存曲线也可以看到As/Fn@CaP/ICG+L治疗组小鼠在第45天的时候生存率仍然为100％，而其他组小鼠在40天内全部死亡。

Claims (14)

1.一种表面包裹磷酸钙的矿化铁蛋白纳米药物，其主要含有铁蛋白和磷酸钙，其中所述磷酸钙包裹在铁蛋白表面，晶型为无定型。
2.权利要求1所述的矿化铁蛋白纳米药物，其中磷酸钙壳层的厚度为1-1000nm，优选的磷酸钙壳层的厚度为1-100nm，更优选的磷酸钙壳层的厚度为1-10nm。
3.权利要求1所述的矿化铁蛋白纳米药物，所述铁蛋白是含铁或者不含铁的铁蛋白，优选该铁蛋白中铁的保留量占铁最高装载量的百分比低于50％，例如低于40％，低于30％，低于20％，低于10％，低于5％，低于2％，低于1％，低于0.5％，低于0.05％，更优选低于0.02％，该铁蛋白具有内部空腔结构，优选该铁蛋白由铁蛋白重链亚基自组装形成其内部空腔结构。
4.一种矿化铁蛋白纳米药物的制备方法，其含以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到矿化铁蛋白。
5.权利要求4所述的制备方法，所述DMEM培养基是商品化的培养基。
6.权利要求4所述的制备方法，所述钙离子溶液是二价钙离子盐溶液，例如是氯化钙、硝酸钙、碳酸氢钙。
7.本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳中装载水溶性小分子药物的方法，含有以下步骤：将铁蛋白分散于含有DMEM培养基的溶液中，平衡搅拌，然后将至少一种含钙离子的溶液和水溶性小分子药物加入到上述溶液中，搅拌反应一段时间，制备得到外壳装载抗肿瘤药物的矿化铁蛋白纳米药物。
8.权利要求7所述的制备方法，所述DMEM培养基是商品化的培养基。
9.权利要求7所述的制备方法，所述钙离子溶液是二价钙离子盐溶液，例如是氯化钙、硝酸钙、碳酸氢钙。
10.权利要求7所述的制备方法，外壳中装载的药物是亲水性小分子药物，优选的是光敏剂，化疗药物、小分子抑制剂、免疫检查点抑制剂、免疫刺激剂、免疫佐剂，例如吲哚菁绿(ICG)、酪氨酸酶小分子抑制剂、aCD47抗体、R837。
11.本申请还提供一种在矿化铁蛋白空腔中装载化疗药物的方法，含有以下步骤：将离子型小分子化疗药物加入铁蛋白溶液中，通过浓度扩散的方法使药物扩散进入空腔实现装载，实现药物在铁蛋白空腔中的原位装载。再利用权利要求4中的矿化方法制备得到内腔载药的矿化铁蛋白纳米药物。
12.权利要求11所述的制备方法，内腔中装载的化疗药物是抗肿瘤药物，优选的是烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂，更优选的是抗实体肿瘤和白血病的药物，例如三氧化二砷、阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、铂类、柔红霉素。
13.本申请还提供一种在矿化铁蛋白外壳和内腔中联合装载药物的方法，利用权利要求7中的方法在矿化铁蛋白外壳装载水溶性小分子药物，同时利用权利要求11中的方法在矿化铁蛋白内腔装载化疗药物。
14.本发明还提供一种药物组合物，其含前述任一项本发明所述的矿化铁蛋白、外壳载药矿化铁蛋白、内腔载药矿化铁蛋白、外壳和内腔联合载药矿化铁蛋白纳米药物以及药学上或生理学上可接受的辅料和/或添加剂，该药物组合物例如是抗肿瘤药物，优选是抗实体肿瘤和白血病药物。
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