CN116125071A - 一种用于肺癌辅助诊断的蛋白标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测技术领域和肿瘤学领域，公开了一种用于肺癌辅助诊断相关的蛋白质标志物及其应用。该标志物为蛋白TIE2，MCP‑2，CXCL5和IL10的组合。其检测抗体组合可用于制备肺癌辅助诊断试剂盒。

Description

一种用于肺癌辅助诊断的蛋白标志物及其应用

发明领域

本发明属于免疫检测技术领域和肿瘤学领域，涉及肺癌辅助诊断相关的蛋白质标志物及其应用。

背景技术

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。根据国际癌症研究机构发布的全球最新癌症负担数据显示，2020年肺癌位居所有肿瘤发病数第二，死亡人数第一。研究表明，肺癌的预后与诊断时的疾病分期高度相关，5年总生存率从IA期的85％急剧下降到IV期的6％。因此，肺癌的早期筛查及早期诊断对提高肺癌生存率，降低肺癌死亡率，减轻肺癌疾病负担具有重要意义。

肺癌早期以肺结节的形式存在，对其进行筛查评估是改善肺癌生存率的关键。目前，肺癌的早筛方法主要是依靠影像学(X线胸片和胸部CT)。但是X线胸片分辨率低，很难发现直径＜6mm的病变，且存在死角，临床不建议用于肺癌的筛查。国际上几项大型肺癌筛查试验据均表明，胸部CT是肺癌筛查的有效手段。同时，由于高敏感性、价格低廉，胸部CT在临床应用中越来越普及。尽管LDCT确实比传统X胸片更能有效地识别小结节，但这一优势也带来了一些不可忽视的问题，假阳性与过度诊断。使用胸部CT每年能识别出数百万个肺部结节，其中许多未被诊断为恶性或良性。在许多情况下，通过细针穿刺等活检技术进行组织病理学诊断是不可能(由于结节位置或由于结节尺寸小)。而这些结节中的绝大多数是良性的，但许多良性结节患者接受了不必要的手术。据估计，接受活检或手术的肺结节患者中实际上只有20％患有恶性肺结节。因此，非常需要一种可以辨别恶性结节，即肺癌的非侵入性临床诊断测试。

越来越多的流行病学证据表明，自身免疫在致癌过程中起着核心作用，这已被广泛认为是癌症的标志之一。免疫排斥或抑制是诱发某些癌症的危险因素，而癌症本身可诱发全身免疫反应失调，从而促进肿瘤增殖和转移。在血液中，免疫反应可以通过免疫相关蛋白和其他循环蛋白的丰度来衡量。免疫反应在肺癌发生中起到重要作用，少量循环免疫相关蛋白在肺癌诊断前显著升高，这表明循环蛋白浓度有望作为早期癌变的标志。在寻找肺癌生物标志物的早期研究中，由于缺乏超高灵敏度以及高效覆盖炎症标志物的方法，阻碍了肺癌生物标志物早筛的进程。Olink蛋白质组学技术的出现，很好的弥补了高灵敏与标志物高覆盖兼顾的技术空白。

采用与特定疾病相关的蛋白质辅助诊断疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，还可以实现对疾病作出早期的“蛋白质诊断”。近年来，利用蛋白质辅助诊断疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在包括肺癌在内的常见重大疾病早期诊断上的应用价值已初见端倪。找出与肺癌相关的蛋白质作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，对我国胸部CT筛查出的肺结节的诊断现状必将是一次有力的推动，进而减少胸部CT的假阳性和过度诊断问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与肺癌辅助诊断相关的蛋白质标志物。

本发明的第二个目的是提供上述蛋白质标志物检测抗体。

本发明的第三个目的是提供肺癌蛋白辅助诊断试剂盒。

发明人通过检测肺癌患者及与其年龄、吸烟状态匹配的健康对照外周血血浆中的蛋白质水平，寻找一组与肺癌高度相关的蛋白质标志物，并研制出可便于临床应用的肺癌蛋白辅助诊断试剂盒，为肺癌的辅助诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型蛋白质药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与肺癌辅助诊断相关的蛋白质标志物，该标志物为蛋白TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10的组合。

所述的蛋白质标志物使用Olink Target 96Immuno-Oncology免疫肿瘤面板检测。

所述的肺癌蛋白辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有用于检测外周血血浆中的CXCL5，IL10，MCP-2和TIE2蛋白的对应抗体(abcam公司购买或其他市购产品也可)。

所述的肺癌蛋白辅助诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10在健康人群中的标准品，进行免疫实验时的底物溶液、样品稀释剂及包被缓冲液。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：

(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。

(2)蛋白质水平检测：选择肺癌病例、与肺癌病例年龄、性别、吸烟状态匹配的健康对照，利用Olink Target 96Immuno-Oncology面板(同时实现92个相关指标检测)进行蛋白质定量并分析，在免疫肿瘤相关蛋白质范围内找出与肺癌相关的蛋白质。

(3)肺癌蛋白辅助诊断试剂盒的研制：根据肺癌病例和健康对照中蛋白质水平有显著差异的蛋白质开发蛋白质辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血浆样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Olink Target 96Immuno-Oncology免疫肿瘤检测面板进行血浆靶向蛋白质水平检测。

具体来说，研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究对象的选择

(1)术后病理学明确确诊为肺癌病人；

(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；

(3)与病例年龄、性别、吸烟状态匹配的健康对照；

本研究共采用85例符合标准的样本进行研究。

2.血浆样本收集

(1)收集全血到市售的抗凝剂处理采集管内；

(2)在制冷离心机(2-8℃)中以1000-2000x g离心10分钟，以去除血浆中的细胞；

(3)立即将血浆转移到干净的管中；

(4)运输过程中使用干冰

3.使用Olink Target 96Immuno-Oncology进行蛋白质定量

按照Olink提供的标准手册操作

4.统计分析方法

运用X²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。运用X²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较蛋白表达量在研究对象组间分布的差异。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R v4.0)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

5.差异蛋白筛选

本实验分为肺癌病例组和健康对照组，经olink的邻位延伸技术，使用Target96Immuno-Oncology面板共鉴定了92种血浆蛋白。对于鉴定到的蛋白，计算病例组和对照组的相对定量值均值之比，作为差异倍数。为了判断差异的显著性，将每个蛋白在比较组样本中的相对定量进行T检验，计算相应的P value，以此作为显著性指标。通过上述差异分析，当P value<0.05时，以差异表达量变化超过1作为上调的变化阈值，小于1作为下调的变化阈值。其中TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10在肺癌患者中表达均上调，具体表达情况如表1所示(A表示肺癌病例组，B表示健康对照组)。

表1各蛋白的表达情况

6.肺癌辅助诊断试剂盒制备方法

Olink Target 96Immuno-Oncology面板进行血浆92种靶向蛋白质水平检测后确定肺癌病例与健康对照中蛋白质水平分布有显著差异的蛋白质，作为肺癌诊断的指标。最后筛选出的与肺癌有关的蛋白质用于制作肺癌蛋白辅助诊断试剂盒(TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10)。试剂盒包括所述的4种用于肺癌辅助诊断的血浆蛋白标志物的检测抗体，联合检测血浆标志物包被于聚氯乙烯的凹孔平板上。同时，试剂盒内还包括一定量的阳性对照血浆、阴性对照血浆、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液，阳性对照血浆为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血浆，阴性对照血浆为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血浆，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG。

检测具体步骤如下：

1)包被：对联合检测血浆标志物分别进行包被，100μL/孔，4℃过夜。

2)封闭：2％BSA的PBST(PBS，Tween20)溶液，200μL/孔，4℃过夜。

3)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。

4)一抗孵育：待测血浆与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

5)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

6)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

7)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

8)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色。

9)终止：10％的浓硫酸50μL/孔终止后10min内测吸光度。

10)判定：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；

P＝1/(1+Exp(-(-13.91+0.76OD_TIE2+0.37OD_MCP-2+0.25OD_CXCL5+0.73OD_IL10)))

式中OD_TIE2、OD_MCP-2、OD_CXCL5、OD_IL10分别为各个指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为疑似肺癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似肺癌样品。

由于本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有肺癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

以下是本发明进一步的说明：

在上述21例符合条件的非小细胞肺癌病例及64例健康对照中，两组年龄、性别及吸烟状态均衡可比。我们将这两组人群使用Olink Target 96Immuno-Oncology面板进行92种免疫肿瘤相关蛋白水平检测。

本发明人检测到在“肺癌病例”组和“健康对照”组中蛋白质水平存在差异的蛋白质包括：TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10。

两组间t检验分析结果表明，这4个蛋白质在两组间存在显著差异。

进一步在这85个研究对象中分析这4个蛋白质的组合用于肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照，结果如图1所示。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于肺癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血浆中TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10蛋白质的特异性抗体和qPCR过程中需要的检测试剂。

具体而言，这一系列蛋白质的组合，或者这一系列蛋白质组合构成的检测试剂盒，促进了血浆蛋白质相关研究结果的临床转化和不同实验室研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明的有益效果：

本发明提供的蛋白质标志物作为肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)血浆蛋白是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，疾病的发生发展密切相关，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功研究有助于血浆蛋白在疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。

(2)肺癌蛋白辅助诊断试剂盒可用于检测不同受试者血浆中的TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10蛋白质含量，有助于反应不同受试者蛋白的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的蛋白表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达蛋白。单独采用本发明的蛋白质，绘制ROC来分析诊断的灵敏性和特异性，来评价这些蛋白质对肺癌的辅助诊断效果。对4种蛋白标志物的联合分析发现，这4个蛋白质以69％的AUC将健康对照组和肺癌病例组分开。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人采用Olink Target 96Immuno-Oncology面板对匹配的肺癌病例与健康对照血浆中的蛋白质进行相对定量；以上的方法和策略的应用加速和保证了肺癌蛋白辅助诊断试剂盒的应用。

以上方法和策略的应用加速和保证了蛋白质生物标志物和蛋白辅助诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过检测肺癌与健康对照外周血中存在差异的蛋白，寻求可用于肺癌蛋白辅助诊断的应用前景。阐述蛋白质对于肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明肺癌相关的蛋白，通过肺癌蛋白辅助诊断试剂盒的研制和应用，促进血浆蛋白相关研究结果的临床转化，可使恶性肺结节与良性肺结节的鉴别诊断更加方便易行，为临床医生快速掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1为显示肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：

1.研究对象的选择

(1)术后病理学明确确诊为肺癌病人；

(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗；

(3)与病例年龄、性别、吸烟状态匹配的健康对照；

本研究共采用85例符合标准的样本进行研究。

3.血浆样本收集

(5)收集全血到市售的抗凝剂处理采集管内；

(6)在制冷离心机(2-8℃)中以1000-2000x g离心10分钟，以去除血浆中的细胞；

(7)立即将血浆转移到干净的管中；

(8)运输过程中使用干冰

3.使用Olink Target 96Immuno-Oncology进行蛋白质定量

按照Olink提供的标准手册操作

4.统计分析方法

运用X²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。运用X²检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较蛋白表达量在研究对象组间分布的差异。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R v4.0)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

6.差异蛋白筛选

本实验分为肺癌病例组和健康对照组，经olink的邻位延伸技术，使用Target96Immuno-Oncology面板共鉴定了92种血浆蛋白。对于鉴定到的蛋白，计算病例组和对照组的相对定量值均值之比，作为差异倍数。为了判断差异的显著性，将每个蛋白在比较组样本中的相对定量进行T检验，计算相应的P value，以此作为显著性指标。通过上述差异分析，当P value<0.05时，以差异表达量变化超过1作为上调的变化阈值，小于1作为下调的变化阈值。其中TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10在肺癌患者中表达均上调，具体表达情况如表1所示(A表示肺癌病例组，B表示健康对照组)。

表1各蛋白的表达情况

进一步在这85个研究对象中分析这4个蛋白质的组合用于肺癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照，结果如图1所示，这4个蛋白质以69％的AUC将健康对照组和肺癌病例组分开。

实施例2：肺癌辅助诊断试剂盒制备及使用方法

Olink Target 96Immuno-Oncology面板进行血浆92种靶向蛋白质水平检测后确定肺癌病例与健康对照中蛋白质水平分布有显著差异的蛋白质，作为肺癌诊断的指标。最后筛选出的与肺癌有关的蛋白质用于制作肺癌蛋白辅助诊断试剂盒(TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10)。试剂盒包括所述的4种用于肺癌辅助诊断的血浆蛋白标志物的抗体，联合检测血浆标志物包被于聚氯乙烯的凹孔平板上。同时，试剂盒内还包括一定量的阳性对照血浆、阴性对照血浆、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液，阳性对照血浆为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血浆，阴性对照血浆为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血浆，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG。

检测具体步骤如下：

(1)包被：对联合检测血浆标志物分别进行包被，100μL/孔，4℃过夜。

(2)封闭：2％BSA的PBST(PBS，Tween20)溶液，200μL/孔，4℃过夜。

(3)清洗：350μL/孔PBST清洗3次。

(4)一抗孵育：待测血浆与含1％BSA的PBST 1:100稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

(5)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

(6)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG与含1％BSA的PBST 1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

(7)清洗：350μL/孔PBST清洗5次。

(8)显色：TMB显色系统，A液(索莱宝，北京)与B液1:1混合后100μL/孔，室温避光，达到预期颜色。

(9)终止：10％的浓硫酸50μL/孔终止后10min内测吸光度。

(10)判定：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，将各个指标(即血清标志物)的吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值大小；

P＝1/(1+Exp(-(-13.91+0.76OD_TIE2+0.37OD_MCP-2+0.25OD_CXCL5+0.73OD_IL10)))

式中OD_TIE2、OD_MCP-2、OD_CXCL5、OD_IL10分别为各个指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为疑似肺癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似肺癌样品。

本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有肺癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

Claims (6)

1.一种与肺癌辅助诊断相关的蛋白质标志物，其特征在于，该标志物为蛋白TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10的组合。

2.用于检测权利要求1所述蛋白质标志物的抗体组合，其特征在于，该抗体组合为检测外周血血浆中的CXCL5，IL10，MCP-2和TIE2蛋白的对应抗体。

3.权利要求2所述抗体组合在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

4.一种肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求2所述的抗体组合。

5.根据权利要求4所述的肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有检测外周血血浆中的CXCL5，IL10，MCP-2和TIE2蛋白的对应抗体。

6.根据权利要求5所述的肺癌蛋白辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒还可以包括TIE2，MCP-2，CXCL5和IL10在健康人群中的标准品，进行免疫实验时的底物溶液、样品稀释剂及包被缓冲液。

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