CN116124842A - 一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法。本发明通过石英晶体微天平技术实时监测粘附于AT切、BT切双切型石英晶体芯片表面的、无明显细胞‑细胞间相互作用的HeLa和HUVECs细胞群在发生焦亡、凋亡全过程中引起的石英晶体频率、电阻变化，从而测得HeLa和HUVECs细胞焦亡、凋亡过程中细胞群对石英晶体施加的表面应力的实时变化，建立了通过细胞力学响应差异鉴别细胞焦亡与凋亡的方法。
Description
技术领域
本发明牵涉一种基于双谐振压电技术鉴定焦亡与凋亡的方法，是基于石英晶体微天平技术原理，通过实时、动态监测粘附于AT切、BT切双切型石英晶体表面的、无明显细胞-细胞间相互作用的HeLa和HUVECs细胞群在焦亡、凋亡过程中产生的力学响应变化而建立的一种鉴定细胞焦亡、凋亡的细胞力学新方法。
背景技术
细胞死亡，作为细胞生命的终点和生物机体中重要的保护机制，参与到许多生命活动中。其中，程序性死亡是一种由遗传调控的常见细胞死亡形式。凋亡，作为一种程序性死亡机制，与许多疾病的发生、发展息息相关，包括心血管疾病,如心衰、动脉粥样硬化，癌症等。然而目前，癌细胞对药物诱导的凋亡逃逸现象逐渐增加，使得肿瘤干预治疗反应不佳，而焦亡则为临床解决肿瘤干预治疗反应不佳提供了可能性，并表现出有潜力成为绕过细胞凋亡而激活肿瘤特异性免疫反应的有效手段。且焦亡也是触发心血管疾病的原因，在心血管疾病发病机制中起着重要作用。然而，细胞焦亡和凋亡引起的生物学功能及响应却截然不同，且影响疾病的不同进展，故使用合适的方法鉴别细胞焦亡和凋亡于药效评估及新药开发领域具有不可或缺的意义。
目前用以鉴别细胞焦亡和凋亡的技术主要基于细胞焦亡和凋亡的形态学、激活途径、生化产物差异。基于形态学差异的光学检测方法操作简单、直接但鉴定标准相对主观且只能在同一时间内观测极小部分区域内的细胞死亡，无法进行定量测定。而基于生化产物和激活路径差异的检测方法具有可定量或半定量测定的优势，如通过Western Blot、ELISA、免疫荧光技术等检测细胞凋亡、焦亡发生的关键蛋白表达，或通过DNA凝胶电泳、RT-qPCR、TUNEL技术等检测基因标记物等，此类方法检测结果更精准，但此类方法都是基于终点测试且容易产生假阳性结果。而目前应用最为广泛的检测不同细胞死亡方式的流式细胞仪，价格昂贵且操作不易上手，需要专业培训的人员进行操作，且流式细胞仪技术检测仍然是非实时性的。因此，一种能够同时满足实时、无损、高灵敏度、且操作简单的鉴别细胞死亡方式的技术是目前该领域所亟需的。
近年，细胞力学技术已应用于细胞死亡方式检测领域中，如原子力显微镜(AtomicForce Microscopy,AFM)、牵引力显微镜(Traction Force Microscopy,AFM)等。但该类技术的检测方式仍然是基于终点测试，既无法动态、实时地获取细胞在死亡过程中的力学信息，也无法避免测定过程对细胞自然生理状态的干扰，影响检测的准确性和有效性。此外，该类技术多应用于单细胞死亡方式的检测。而本技术提供了一种能实时测定且不影响细胞生理状态的鉴定细胞群死亡方式的细胞力学方法，通过细胞对石英晶体施加的表面应力变化鉴别细胞焦亡和凋亡，建立以实时、无损的方式鉴别细胞凋亡、焦亡的细胞力学模型，这一优势于新药开发及药效评估领域的应用具有十分重要的帮助。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法包括如下步骤：
(1)将AT切与BT切石英晶体置于检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同基础频率、表面形态和一致的表面粘附分子修饰；
(2)加入细胞，待细胞稳定粘附石英晶体界面后(12小时)，向检测池内加入脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin subunit B,CTB)以诱导细胞焦亡，及肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)以诱导细胞凋亡，全程实时监测AT切、BT切石英晶体的频率、电阻变化；优选地，向检测池内共加入40μL脂多糖和20μL霍乱毒素B亚单位以诱导细胞焦亡，或共加入40μL肿瘤坏死因子α和20μL环己酰亚胺以诱导细胞凋亡；
(3)通过如下公式测定细胞对石英晶体产生的表面应力(ΔS)：
其中，KAT＝2.75×10-12cm2 dyn-1，KBT＝-2.65×10-12cm2 dyn-1分别为AT切、BT切石英晶体的应力系数；tq AT和tq BT分别为以cm单位的石英晶体厚度；f0 AT＝f0 BT＝9MHz是石英晶体谐振器的原始谐振频率；Δft AT和Δft BT是在t时刻谐振器经历表面应力产生的新频移影响减去相应f0后的频移；
(4)通过如下公式测定细胞的存储模量(G′)与损耗模量(G″):
其中，Γ为半带宽，ρc为细胞密度，基于其与纯水密度一致的假设：ρ水＝1.00g/cm3，其中Zq为石英晶体的声阻抗，Zq AT＝8.84*105g/cm·s,Zq BT＝1.35*106g/cm·s，ρc＝0.9933g/cm3；半带宽Γ与动态电阻R之间存在如下关系：ΔΓ＝ΔR/4πLq，其中Lq为石英晶体在细胞培养基中的电感；
(5)根据细胞焦亡和凋亡过程中ΔS变化差异鉴别细胞焦亡和凋亡，并同时获得细胞焦亡和凋亡过程中细胞粘弹性变化。
下面对本发明作进一步说明：
本发明在不影响细胞功能的情况下，同时使用AT切、BT切双切型石英晶体芯片，实时、长期监测HeLa和HUVECs细胞群在焦亡和凋亡过程中对石英晶体施加的表面应力(ΔS)及细胞群存储模量(G′)和损耗模量(G″)的动态变化，并根据细胞对石英晶体施加的表面应力(ΔS)差异鉴别细胞焦亡和凋亡。AT切与BT切石英晶体谐振器具有相同的应力系数大小，但是符号相反。细胞对石英晶体施加的应力变化可根据两谐振器对同一界面过程的不同频移变化来计算，故这一技术的基本前提在于保证监测过程AT切、BT切石英晶体表面的质量变化、溶液粘性、及电极粗糙度一致。基于此必要充分条件，根据横向应力在AT切和BT切石英晶体上产生的不同响应计算出应力的大小及方向。
本发明采用100nm厚度金镀层厚度的9MHz石英晶体双切型谐振器、适配的特氟隆检测池，搭载四通道石英晶体微天平网络分析仪250B动态监测细胞在焦亡和凋亡过程中的力学响应变化。用于测量的石英晶体谐振器芯片直径为12.5mm，金电极镀层直径为5mm。
具体来说，所述基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法如下：
将AT切、BT切石英晶体置于检测池内，所述AT切与BT切石英晶体具有相同频率、表面状态和/或修饰了相同的表面粘附分子。向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力：
式中，KAT＝2.75×10-12cm2 dyn-1，KBT＝-2.65×10-12cm2 dyn-1分别为AT切、BT切石英晶体的应力系数；tq AT和tq BT分别为以cm单位的石英晶体厚度；f0 AT＝f0 BT＝9MHz是石英晶体谐振器的原始谐振频率；Δft AT和Δft BT是在t时刻谐振器经历表面应力产生的新频移影响减去相应f0后的频移。
上述值代入公式(1)，可简化为：
ΔS＝380.8ΔfAT-582.2ΔfBR (2)
据公式(2)所求ΔS单位为dyne/cm,ΔS>0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于张应力状态，即细胞在铺展、粘附过程中通过粘着斑复合物对底部基质施加收缩牵引力的过程，此过程使得石英晶体受到压应力，ΔS呈正值；当ΔS<0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于压应力状态，即与收缩牵引力相反方向的突出力占主导，使得石英晶体受到张应力，ΔS呈负值。
此外，由于石英晶体的工作频率在兆赫兹级别，其厚度剪切波的衰减长度远小于细胞厚度，活细胞可以看作是半无限粘弹性载荷。故可通过如下公式测定出细胞粘弹性模量：
式中，Zq AT＝8.84*105g/cm·s,Zq BT＝1.35*106g/cm·s分别为AT切、BT切石英晶体的声阻抗；ρc＝0.9933g/cm3为细胞密度，假设细胞密度与纯水密度相同；Lq为所测石英晶体的动态电感；f0 AT＝f0 BT＝9MHz是石英晶体谐振器的原始谐振频率。Δf、Δf分别为石英晶体表面均匀粘弹性层相较于空气而引起的频移和动态电阻。
已知培养基引起的9MHz AT和BT切上的频移和电阻为：
横向应力在AT切和BT切上引起的频移为：
故用总频移减去由横向应力引起的频移，可得由细胞粘弹性引起的频移为：
综上，用细胞粘弹性引起的频移和动态电阻减去培养基引起的频移和动态电阻，可得校正后的频移(Δf)和动态电阻(ΔR)：
将公式(9-12)及LAT＝10.7*10-3H，LBT＝40.1*10-3H代入公式(3)、(4)计算可得：
G′(AT)＝0.5297ΔR2-0.009576Δf2 (13)
G″(AT)＝-0.1425ΔfΔR (14)
G′(BT)＝0.0879ΔR2-0.02233Δf2 (15)
G″(BT)＝-0.08868ΔfΔR (16)
通过本发明的方法，可对焦亡和凋亡过程中的细胞产生的力与细胞粘弹性响应进行实时、同时、定量、连续的测定，并根据细胞对石英晶体施加的表面应力响应差异辨别焦亡和凋亡。当细胞稳定粘附于石英晶体表面上时，细胞在牵引力的主导下使石英晶体受到压应力，此时ΔS为正值。当细胞发生焦亡时，石英晶体受到的压应力转变为张应力，即细胞以与牵引力方向相反的突出力为主导，ΔS由正值转变为负值；而当细胞发生凋亡时，石英晶体受到的压应力进一步增大，细胞仍以牵引力为主导，对石英晶体施加的力方向不发生改变，ΔS仍为正值。
附图说明
图1是2000个HeLa细胞在AT切、BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB的焦亡诱导过程中的动态QCM响应及细胞对石英晶体施加的应力、细胞粘弹性变化曲线。(A)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下引起的频移和动态电阻变化；(B)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下引起的频移和动态电阻变化；(C)HeLa细胞粘附及在LPS和CTB诱导过程中对石英晶体施加的应力变化；(D)WesternBlot检测HeLa细胞在LPS和CTB诱导下焦亡的发生；(E)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的存储模量变化；(F)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的存储模量变化；(G)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的损耗模量变化；(H)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的损耗模量变化；
图2是2000个HeLa细胞在AT切、BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX的凋亡诱导过程中的动态QCM响应及细胞对石英晶体施加的应力、细胞粘弹性变化曲线。(A)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下引起的频移和动态电阻变化；(B)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下引起的频移和动态电阻变化；(C)TNF和CHX的凋亡诱导过程中对石英晶体施加的应力变化；(D)WesternBlot检测HeLa细胞在TNF和CHX诱导下凋亡的发生；(E)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的存储模量变化；(F)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的存储模量变化；(G)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的损耗模量变化；(H)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的损耗模量变化；
图3是2000个HUVECs细胞在AT切、BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB的焦亡诱导过程中的动态QCM响应及细胞对石英晶体施加的应力、细胞粘弹性变化曲线。(A)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下引起的频移和动态电阻变化；(B)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下引起的频移和动态电阻变化；(C)HUVECs细胞粘附及在LPS和CTB诱导过程中对石英晶体施加的应力变化；(D)WesternBlot检测HeLa细胞在LPS和CTB诱导下焦亡的发生；(E)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的存储模量变化；(F)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的存储模量变化；(G)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的损耗模量变化；(H)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在LPS和CTB诱导下的损耗模量变化；
图4是2000个HUVECs细胞在AT切、BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX的凋亡诱导过程中的动态QCM响应及细胞对石英晶体施加的应力、细胞粘弹性变化曲线。(A)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下引起的频移和动态电阻变化；(B)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下引起的频移和动态电阻变化；(C)TNF和CHX的凋亡诱导过程中对石英晶体施加的应力变化；(D)WesternBlot检测HUVECs细胞在TNF和CHX诱导下凋亡的发生；(E)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的存储模量变化；(F)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的存储模量变化；(G)细胞在AT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的损耗模量变化；(H)细胞在BT切石英晶体芯片上的粘附及在TNF和CHX诱导下的损耗模量变化；
具体实施方式
本发明所用石英晶体谐振器为9MHz的AT切、BT切石英晶体，晶体直径为12.5mm，金电极涂层厚度为100nm(直径5mm)，20nm铬镀层作为金电极涂层与石英晶体基质间的粘附层。本专利基于双谐振器压电技术，通过实时监测粘附于石英晶体上的HeLa和HUVECs细胞引起的频移，定量测得HeLa和HUVECs细胞对石英晶体施加应力(ΔS)的动态变化。ΔS正负值代表细胞群整体对石英晶体施加的不同应力，ΔS>0对应粘附于石英晶体表面的细胞群整体处于张应力状态，出现于细胞在底部基质上铺展、粘附的过程，细胞通过粘着斑复合物对石英晶体施加收缩牵引力，使得石英晶体受到压应力；而ΔS<0对应细胞群整体对石英晶体施加的合力方向与收缩牵引力方向相反，表现为突出力占主导，细胞整体处于压应力状态，使得石英晶体受到张应力。
所述基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法的具体步骤如下：
(1)将AT切、BT切石英晶体金电极部分置于1滴80℃Piranha溶液(1：3的30％ H2O2和98％ H2SO4混合物)30秒，后用Milli-Q水和乙醇冲洗，再用超高纯度N2吹干，此过程重复三次。
(2)将四个独立的同批次石英晶体谐振器逐一组装于特氟龙检测池中，检测池垂直方向上下个有两个硅薄层O形环。将Piranha处理后的金电极表面暴露于含有20mM 3-巯基丙酸(MPA)和1mM三甘醇单-11-巯基十一烷基醚(TGME)的无水乙醇溶液中，于室温、避光静置16小时，以形成自组装单分子膜。
(3)取出溶液，将自组装单层金电极表面浸于150mM N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC)和30mM N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinmide,NHS)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH＝5.5)中，于室温、静置30分钟。
(4)取出溶液，将界面暴露于用PBS(pH＝8.2)配制的浓度为20μg/mL纤连蛋白(Fibronectin,FN)中，于室温、避光静置6小时。
(5)6小时后取出溶液，向检测池中加入2000个HeLa或HUVECs细胞，连接检测池与250B-2石英晶体网络分析仪，开始进行数据监测。
(6)待HeLa或HUVECs细胞稳定粘附于金电极表面后(加入细胞10小时以上)，加入焦亡或凋亡药物进行诱导。
(7)焦亡实验组，取出20μL细胞培养基并加入20μL LPS(Conc.1μg/ml)进行诱导并进行监测。为提高焦亡诱导效率，6小时后取40μL培养基并加入20μL LPS(Conc.1μg/ml)和20μL CTB(Conc.10μg/ml)联合进行焦亡诱导。
(8)凋亡实验组，取出60μL细胞培养基并加入40μL TNF-α(Conc.20ng/ml)和20μLCHX(Conc.10μg/ml)联合进行凋亡诱导。
从细胞培养至药物诱导过程中不中断QCM信号的监测，频移、动态电阻数据连续采集30小时以上，采样速度为每秒/组。整个检测过程中，石英晶体谐振器放置于37℃、5％CO2的恒温细胞培养箱中。
细胞在焦亡和凋亡过程中细胞牵引力的动态变化
本发明展示了如图1、2所示的2000个HeLa细胞粘附在修饰了FN的石英晶体表面时AT切、BT切芯片的QCM响应，包括频移Δf和动态电阻ΔR随时间的变化，以及细胞对石英晶体产生的应力(ΔS)、细胞存储模量(G′)和损耗模量(G″)的变化，并通过Western Blot检测焦亡执行蛋白GSDMD的切割及其切割产物N-端和C-端蛋白的表达，验证该焦亡诱导方式的可行性。在细胞粘附阶段，随着HeLa细胞在金电极上的不断铺展及整合素等粘着斑复合物的逐渐形成，细胞整体对石英晶体施加逐渐增大的压应力(ΔS)，直至近20,000dyne/cm后保持稳定。在此阶段，细胞牵引力占主导地位，细胞通过牵引力对底部硬基质施加压应力，从而调控细胞的粘附。随着粘着斑复合物的成熟，细胞对石英晶体施加的压应力逐步趋于稳定，这一过程与ΔS趋于稳定的时间一致。随后，用LPS进行焦亡诱导，QCM响应出现频率下降、电阻上升的趋势，ΔS从正值降至负值，见图1-C。为提高焦亡诱导效率，于6小时后加入LPS与CTB对细胞进行再一次焦亡诱导。在LPS与CTB的共同作用下，频率进一步下降、电阻进一步上升。同时，ΔS在负值继续下降。对HeLa进行焦亡诱导后，细胞对石英晶体施加的应力出现由正值向负值变化的响应，表明焦亡的发生改变了HeLa细胞群对底部基质施加的合力方向，变成以突出力方向为主导的模式。当进一步结合细胞焦亡过程中粘弹性响应的变化，如图1-E,F,G,H所示。存储模量(G′)和损耗模量(G″)在细胞粘附初期呈上升趋势，继而随着粘着斑复合物的逐渐成熟，存储模量和损耗模量逐渐趋于稳定。进行第一次焦亡诱导后，G′、G″都出现明显上升，此时G′值上升近一倍，G″值上升约3000pascal。进行LPS和CTB共诱导后，存储模量和损耗模量出现更加明显的上升，存储模量直接上升近三倍(AT切升至30,000pascal；BT切升至25,000pascal)，同时损耗模量也分别在AT切上升了约25,000pascal，BT切20,000pascal。然而，HeLa细胞发生凋亡时的力学响应则与焦亡时完全相反(见图2)。在通过Western Blot检测凋亡执行蛋白Caspase3的切割并验证TNF和CHX诱导的细胞凋亡发生后(图2-D)，我们对细胞凋亡力学响应进行监测。细胞粘附过程中的频率、电阻响应与焦亡组一致，而在加入TNF和CHX进行凋亡诱导后，AT、BT切上都观察到频率略微升、电阻下降的响应，与焦亡响应截然相反。另外，细胞凋亡发生后对石英晶体产生的压应力增大，ΔS仍为正值。而继续对比细胞凋亡与焦亡的粘弹性模量变化，我们发现：凋亡诱导后，细胞在AT、BT切上都观察到存储模量与损耗模量的明显下降，其中存储模量在AT切上最终降至约3000pascal、BT切上最终降至约5000pascal；而存储模量在AT切上最终降至约46,000pascal、BT切上最终降至约49,000pascal。
综上，HeLa细胞的焦亡力学响应体现为：(1)改变细胞群对石英晶体施加的总应力方向。(2)细胞存储模量和损耗模量升高。HeLa细胞的凋亡力学响应体现为：(1)增大细胞群对石英晶体施加的压应力。(2)使得细胞存储模量和损耗模量降低。
具体地，细胞焦亡和凋亡的力学响应上差异主要体现为以下几方面：在焦亡发生后，Δf表现为持续下降，而凋亡发生后Δf则是略微上升；同时，ΔR在焦亡发生后表现为上升，在凋亡发生后则表现为下降。两种死亡过程中，Δf响应的差异导致细胞对石英晶体产生的应力(ΔS)差异。细胞发生焦亡时，细胞体积膨胀，焦亡细胞群整体在石英晶体上产生指向石英晶体外周的的突出力，使得石英晶体处于张应力状态，对应ΔS值为负；而细胞发生凋亡时，细胞内部骨架结构微管的破坏使得凋亡细胞对底部基质施加更大压应力，对应ΔS值增加。此外，本发明技术还提供HeLa细胞焦亡和凋亡的粘弹性响应实时变化。细胞发生焦亡时，细胞的存储模量和损耗模量都显著上升，而在凋亡发生后中，存储模量和损耗模量则明显下降。
同样，细胞焦亡和凋亡的应力响应在HUVECs细胞系中也得到了一致验证。
在HUVECs细胞发生焦亡响应后，ΔS也从正值降至负值。而在发生凋亡响应后，ΔS也呈上升趋势。但是，经TNF和CHX诱导后的HUVECs细胞粘弹性响应与HeLa具有差异性。HUVECs细胞凋亡发生后的存储模量、损耗模量都呈增加趋势，表明在同一浓度下对HUVECs和HeLa诱导的凋亡粘弹性响应结果是不一致的，正常细胞与癌细胞发生凋亡时的细胞粘弹性响应具有明显差异性。
综上，本发明专利提出了一种通过细胞对石英晶体施加的应力响应鉴定细胞焦亡和凋亡的细胞力学新方法，且该技术还可提供不同细胞系在焦亡和凋亡过程中的粘弹性实时变化。
Claims (2)
1.一种基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将AT切与BT切石英晶体置于检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同基础频率、表面形态和一致的表面粘附分子修饰；
(2)加入细胞，待细胞稳定粘附石英晶体界面后，向检测池内共加入脂多糖和霍乱毒素B亚单位以诱导细胞焦亡，共加入肿瘤坏死因子α和环己酰亚胺以诱导细胞凋亡，全程实时监测AT切、BT切石英晶体的频率、电阻变化；
(3)通过如下公式测定细胞对石英晶体产生的表面应力(ΔS)：
其中，KAT＝2.75×10-12cm2 dyn-1，KBT＝-2.65×10-12cm2 dyn-1分别为AT切、BT切石英晶体的应力系数；tq AT和tq BT分别为以cm单位的石英晶体厚度；f0 AT＝f0 BT＝9MHz是石英晶体谐振器的原始谐振频率；Δft AT和Δft BT是在t时刻谐振器经历表面应力产生的新频移影响减去相应f0后的频移；
(4)通过如下公式测定细胞的存储模量(G′)与损耗模量(G″):
其中，Γ为半带宽，ρc为细胞密度，基于其与纯水密度一致的假设：ρ水＝1.00g/cm3，其中Zq为石英晶体的声阻抗，Zq AT＝8.84*105g/cm·s,Zq BT＝1.35*106g/cm·s，ρc＝0.9933g/cm3；半带宽Γ与动态电阻R之间存在如下关系：ΔΓ＝ΔR/4πLq，其中Lq为石英晶体在细胞培养基中的电感；
(5)根据细胞焦亡和凋亡过程中ΔS变化差异鉴别细胞焦亡和凋亡，并同时获得细胞焦亡和凋亡过程中细胞粘弹性变化。
2.如权利要求1所述的基于双谐振压电技术鉴别细胞焦亡与凋亡的细胞力学方法，其特征在于，所述步骤(2)中是向检测池内共加入40μL脂多糖和20μL霍乱毒素B亚单位以诱导细胞焦亡，共加入40μL肿瘤坏死因子α和20μL环己酰亚胺以诱导细胞凋亡。
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