CN116098884A - 一种n-乙酰-l-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种N‑乙酰‑L‑酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。本发明研究发现，NAT可通过促进胆汁酸外排介导缓解炎症性肠病的作用，因而可以作为活性成分制备治疗炎症性肠病的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
据发明人研究了解，N-乙酰-L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine，NAT)是一种来源于AA乙酰酶作用下的酪氨酸，在体内迅速水解为酪氨酸，也因此通常在肠外营养中用于代替酪氨酸。NAT存在于健康动物的血液中，其浓度在热应激时增加。NAT与芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症以及酪氨酸血症有关，能够作为儿茶酚胺的前体，用于神经递质治疗。此外，NAT还可以抑制肿瘤生长，同时还可能是有丝分裂的触发因子。然而，对于NAT其他作用及机制研究极少。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，本发明研究发现，NAT可通过促进胆汁酸外排介导缓解炎症性肠病的作用，因而可以作为活性成分制备治疗炎症性肠病的药物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备促进胆汁酸外排制剂中的应用。
进一步地，促进胆汁酸外排制剂为促进细胞内胆汁酸外排制剂。
更进一步地，所述细胞为小肠上皮细胞。
另一方面，一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
研究表明，N-乙酰-L-酪氨酸可以作为通过促进胆汁酸外排缓解肠炎的活性成分。
进一步地，治疗炎症性肠病药物中，N-乙酰-L-酪氨酸作为唯一活性成分。
进一步地，炎症性肠病为溃疡性结肠炎。
第三方面，一种治疗炎症性肠病的药物，由活性成分和药用辅料组成，所述活性成分为N-乙酰-L-酪氨酸。
本发明所述的药用辅料为载体和/或赋形剂。药用辅料的用量可以为药物总重量的1～99％。
进一步地，所述载体包括但不限于甘油、乙二醇、硬脂酸铝、卵磷脂、羧甲基纤维素钠、磷酸盐、血清蛋白等。
进一步地，所述赋形剂包括但不限于粘合剂、填充剂、增稠剂、崩解剂等。所述粘合剂例如阿拉伯胶、黄芪胶等。所述填充剂例如玉米淀粉、磷酸钙等。所述增稠剂例如藻蛋白酸钠、果胶等。所述崩解剂例如马铃薯淀粉等。
进一步地，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、注射剂等。
本发明的有益效果为：
通过细胞实验表明，N-乙酰-L-酪氨酸能够促进小肠上皮细胞系MODE-K内的胆汁酸外排，经过溃疡性结肠炎模型实验表明，N-乙酰-L-酪氨酸可降低溃疡性结肠炎严重程度，缓解肠炎，在小鼠的实验性溃疡性结肠炎模型中有较好治疗效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中NAT缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎的表征图；
图2为本发明实施例中NAT促进胆汁酸外排的表征图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
实验材料：MODE-K：小鼠小肠上皮细胞系，由本实验室保存。
实验动物：C57BL/6J，雄性，6周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
小鼠按SPF级别环境饲养于山东大学药学院SPF级动物房，符合山东大学动物饲养及管理条例。所有动物实验和流程严格按照山东大学实验动物条例进行。
实验制剂：
细胞培养基：RPMI1640培养基购于迈晨科技(北京)有限公司。
胎牛血清：购于Gibco公司。
磷酸盐缓冲液(1×PBS)：9g NaCl、0.421g Na2HPO4、0.144g KH2PO4，溶于1L三蒸水。0.22μm微孔滤膜过滤，存于4℃冰箱备用。
0.25％胰酶溶液：购于北京索莱宝科技有限公司。
0.05Mβ-巯基乙醇溶液：37μLβ-巯基乙醇溶于10mL 1×PBS，0.22μm微孔滤膜过滤，存于4℃冰箱备用。
二甲亚砜(DMSO)：购于索莱宝生物科技有限公司(D2650)。
细胞冻存液：购于上海瑟欧生物科技有限公司。
葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt Colitis Grade，DSS)：购于MPBiomedicals(160110)。
4％多聚甲醛通用型组织固定液：4％多聚甲醛、1.9mM二水磷酸二氢钠、8.1mM十二水磷酸氢二钠，购于合肥兰杰柯科技有限公司(BL539A)。
实验方法：
细胞复苏：
(1)取20mL培养基于50mL离心管中，37℃水浴加热10-15min。
(2)-80℃冰箱中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴锅中，以“8”字型摇晃使其快速融化。
(3)将融化的细胞悬液转移至预热过的培养基中，800g离心5min。
(4)弃上清，弹起细胞沉淀，用10mL预热好的培养基重悬细胞沉淀。
(5)将其转移至细胞培养皿中，于37℃恒温培养箱培养。
贴壁细胞的传代培养：
(1)当细胞密度达到80％时，弃培养基。
(2)加入2-3mL 0.25％胰酶，37℃恒温培养箱进行消化3min。
(3)加入2-3mL培养基终止消化。
(4)将细胞轻轻吹打下来，并转移细胞悬液至15mL离心管内。
(5)800g离心5min，弃上清，弹起细胞沉淀，用1mL培养基悬起细胞沉淀。
(6)将细胞悬液接入新的细胞培养皿中，加入适量的培养基，于37℃恒温培养箱培养。
细胞的冻存：
(1)向离心得到的细胞沉淀中加入1mL冻存液，吹打混匀。
(2)将1mL细胞悬液加入至冻存管内。
(3)将冻存管置于冻存盒内，置于-80℃冰箱中。24h后取出，放于液氮罐中保存。
小鼠实验性溃疡性结肠炎模型的建立及治疗：
(1)C57BL/6J 8只，6周龄，雄性，SPF级环境下饲养一周后，给3％DSS饮水，与此同时给予NAT治疗。
(2)配制NAT，按100mg/kg的剂量对小鼠进行灌胃，对照组灌胃等体积的无菌水，每天一次。
(3)每天称量各组小鼠体重，在第6天处死小鼠，收集结肠进行评估，统计长度差异、HE染色后进行病理评分。
(4)将所有检测的小鼠体重用Graph Pad Prism 9软件进行统计分析，绘制体重变化曲线。
NAT对胆汁酸外排的影响：
(1)将MODE-K细胞按5万/孔接入96孔板，加200μL培养基，培养24小时。
(2)弃培养基，配制荧光DCA，按10μM的浓度处理细胞30min后，换培养基缓冲2小时。
(3)配制NAT，按10uM浓度处理细胞12小时，Control组加等量DMSO。
(4)消化细胞，800g离心5min，用MACS buffer重悬。
(5)用Gallios流式细胞仪检测control及NAT处理组细胞的DCA含量并用FlowJo进行分析。
实验结果：
1.体重变化曲线及病理：
为了探究NAT在溃疡性结肠炎中的治疗作用，选择6周龄雄性C57BL/6J鼠，给3％DSS(葡聚糖硫酸钠)建立实验性溃疡性结肠炎模型并随机分为两组，分别为Control组和NAT治疗组。治疗组小鼠按100mg/kg的剂量对小鼠灌胃NAT，对照组灌胃等体积的无菌水，从Day 0开始每天灌胃一次，同时每天测量小鼠体重(图1A)。图1B为小鼠体重变化曲线，从图中可以看出，与Control组相比，治疗组体重下降较少。从结肠长度的统计结果可以看出，同对照组相比，NAT治疗组结肠显著较长(图1C)。HE染色结果显示，与对照组相比，NAT治疗组肠道上皮结构更完整，炎性细胞浸润较少，粘膜下水肿也更轻(图1D)。病理评分统计结果分析表明，与对照组相比，NAT治疗明显缓解小鼠溃疡性结肠炎(图1E)。这些结果表明，NAT可降低溃疡性结肠炎严重程度，缓解炎症性肠病，在小鼠的实验性溃疡性结肠炎模型中有较好治疗效果。
2.NAT促进胆汁酸外排：
为了探究NAT缓解溃疡性结肠炎的机制，用小鼠小肠上皮细胞系MODE-K对NAT在胆汁酸外排中的影响进行检测。将MODE-K细胞按5万/孔接入96孔板培养24小时，弃培养基，配制荧光DCA(9,10-二腈基蒽)，按10uM的浓度处理细胞30min后，换培养基缓冲2小时后，按10μM浓度用NAT处理细胞12小时，Control组加等量DMSO，用Gallios流式细胞仪检测Control及NAT处理组细胞的DCA含量并用FlowJo进行分析。结果显示NAT组细胞中DCA含量明显少于Control组，如图2所示，说明NAT具有促进胆汁酸外排的作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备促进胆汁酸外排制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的N-乙酰-L-酪氨酸在制备促进胆汁酸外排制剂中的应用，其特征是，促进胆汁酸外排制剂为促进细胞内胆汁酸外排制剂。
3.如权利要求2所述的N-乙酰-L-酪氨酸在制备促进胆汁酸外排制剂中的应用，其特征是，所述细胞为小肠上皮细胞。
4.一种N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
5.如权利要求4所述的N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，其特征是，治疗炎症性肠病药物中，N-乙酰-L-酪氨酸作为唯一活性成分。
6.如权利要求4所述的N-乙酰-L-酪氨酸在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，其特征是，炎症性肠病为溃疡性结肠炎。
7.一种治疗炎症性肠病的药物，其特征是，由活性成分和药用辅料组成，所述活性成分为N-乙酰-L-酪氨酸。
8.如权利要求7所述的治疗炎症性肠病的药物，其特征是，所述的药用辅料为载体，所述载体为甘油、乙二醇、硬脂酸铝、卵磷脂、羧甲基纤维素钠、磷酸盐或血清蛋白。
9.如权利要求7所述的治疗炎症性肠病的药物，其特征是，所述的药用辅料为赋形剂，所述赋形剂为粘合剂、填充剂、增稠剂和/或崩解剂。
10.如权利要求7所述的治疗炎症性肠病的药物，其特征是，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂或注射剂。
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