CN116083532A - 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116083532A
CN116083532A CN202310307297.5A CN202310307297A CN116083532A CN 116083532 A CN116083532 A CN 116083532A CN 202310307297 A CN202310307297 A CN 202310307297A CN 116083532 A CN116083532 A CN 116083532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
crispr
detection
amplification
gene
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310307297.5A
Other languages
English (en)
Inventor
邢佑强
王燕
武文涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202310307297.5A priority Critical patent/CN116083532A/zh
Publication of CN116083532A publication Critical patent/CN116083532A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas13a的针对CHP1基因的快速检测方法，属于生物技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas13a系统特异性识别特定的CrRNA产生切割活性，从而切断周边的荧光报告分子，产生荧光信号，实现检测。在该过程中无需对原始的基因信号进行放大，可进行无扩增的检测。该种检测方式相较于传统的基因检测方式更加快速直接，不仅可以应用在检测CHP1基因，更可以广泛地应用在多重基因量化检测芯片，降低检测成本，实现超快精准化疗评价。

Description

一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法
技术领域
本发明涉生物技术领域和分子诊断等领域，具体地，是一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法。
背景技术
基因芯片的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。现有的基因芯片可分为三类，点阵芯片、自组装阵列芯片以及原位合成阵列。现有的检测方式无法准确识别超低浓度样本，此外，同一芯片难设计多个DNA探针。总之，目前基因检测方法存在成本高、通量低以及有串扰的缺点。
自1980年发现CRISPR系统以来，它已被广泛用于基因编辑和其他应用。CRISPR-Cas系统根据核糖核蛋白效应复合物的性质分为两类。第一类CRISPR-Cas系统包括由多个效应蛋白组成的复合物。第二类CRISPR-Cas系统包括单个crRNA结合蛋白，可用于核酸检测。Cas9可以在crRNA和tra-crRNA的引导下特异性地裂解DNA序列，这取决于预扩增1。Cas12只需要crRNA的引导来特异性地裂解DNA序列，同时也获得非特异性的DNA裂解活性。Cas13可以在crRNA的引导下特异性地裂解RNA序列，同时也获得非特异性的RNA裂解活性。一方面，cas12和cas13系统可以与预扩增相结合进行核酸检测，如DETECTR、SHERLOCK2、CARMEN3等。另一方面，这两个系统可用于直接的无扩增核酸诊断。将CRISPR-Cas13a系统用在基因检测中，可实现高通量、低成本、超灵敏以及高特异性检测，可满足临床中快速诊断的需要。
发明内容
本发明基于目前最新的基因检测技术，提拱了一种基于CRISPR-Cas13a的无扩增检测方法，进行基因的荧光检测。方法简单，控制方便，可实现高通量、低成本检测。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述方法的配方包含CHP1基因的质粒、CrRNA、lwaCas13a蛋白、荧光Reporter。
所述的基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a系统的CHP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示；目标RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；荧光Reporter的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述检测步骤可概括为：
(a)将所需试剂从冰箱中取出，进行解冻；
(b)取出一支ep管，向内加入26.13μL无引物复水缓冲液、10μL转录优化5X缓冲液、5μLrNTP、1μLT7聚合酶、1μLRnase抑制剂、1μL荧光Reporter、1μL质粒溶液、0.12μLCrRNA以及0.45μLCRISPR-Cas13a溶液；
(c)将加有试剂的ep管放在漩涡器上加速混合；
(d)使用针管将混合液吸入，并安装在微量进样器上；
(e)使用另一支针管吸入足量的油相液体，并安装在另一微量进样器上；
(f)调节混合液的进样速度为4-6μL/min，调节油相液体的进样速度为15-18μL/min；
(g)将产生的液滴放置在荧光显微镜下观测荧光。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明利用高灵敏的CRISPR-Cas13a系统特异性识别目标RNA，可实现特异性检测目标基因。该种方式无需对目标基因进行扩增，可直接对目标进行检测，简化了检测流程，降低了检测成本。
2、本发明的检测方法可实现高通量的检测，只需将对应的目标基因的CrRNA设计出来，便可实现检测。
3、本发明的检测方法是荧光检测，后期可结合数字微流控技术，实现定量检测，且可制成芯片实现多个基因的快速检测，在分子检测领域具有广泛的应用前景。
Figure BDA0004147268170000021
附图说明
图1为微量进样器产生液滴的结构示意图；
图2为实施例中无扩增体系放置1小时后的荧光结果图；
图3为实施例中无扩增体系放置1小时后的荧光读取图；
图4为实施例中无扩增体系放置12小时后的荧光结果图；
图5为实施例中无扩增体系放置12小时后的荧光读取图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明详细说明。所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其实施方式主要分两个部分：一是反应体系的搭建，二是混合液滴的产生以及液滴的荧光检测。
如图1所示为该反应体系的混合液滴的产生过程示意图，其中包含反应体系混合液(1)、油相液(2)以及产生的混合液滴(3)。
如图2所示，示例放置1小时后阴性对照组的荧光强度图(4)、样本浓度为106copies/μL的荧光强度图(5)以及样本浓度为106copies/μL的荧光强度图(6)。
如图3所示，使用软件imageJ读取图片2的荧光强度值，得到如图的柱状图。
如图4所示，示例放置12小时后阴性对照组的荧光强度图(7)、样本浓度为106copies/μL的荧光强度图(8)以及样本浓度为106copies/μL的荧光强度图(9)。
如图5所示，使用软件imageJ读取图片4的荧光强度值，得到如图的柱状图。
示例的检测步骤具体为：
(a)将所需试剂从冰箱中取出，进行解冻；
(b)取出三支ep管，向内加入26.13μL无引物复水缓冲液、10μL转录优化5X缓冲液、5μLrNTP、1μLT7聚合酶、1μLRnase抑制剂、1μL荧光Reporter、1μL质粒溶液、0.12μLCrRNA以及0.45μLCRISPR-Cas13a溶液，第一支管内的模板为无酶水，作为阴性对照组，第二支管内的模板为浓度为106copies/μL的样本液，第三支管内的模板为浓度为108copies/μL的样本液。
(c)将加有试剂的ep管放在漩涡器上加速混合；
(d)使用针管将混合液吸入，并安装在微量进样器上；
(e)使用另一支针管吸入足量的油相液体，并安装在另一微量进样器上；
(f)调节混合液的进样速度为4μL/min(1)，调节油相液体的进样速度为16μL/min；
(g)将产生的液滴(3)放置在荧光显微镜下观测荧光。
(h)放置1小时后的荧光结果图如图2所示，阴性对照组(4)、浓度为106copies/μL的样本液(5)以及浓度为108copies/μL的样本液(6)。使用软件image J读取图片中的荧光强度值得到如图3的柱状图。
(i)放置12小时后的荧光结果图如图4所示，阴性对照组(7)、浓度为106copies/μL的样本液(8)以及浓度为108copies/μL的样本液(9)。使用软件image J读取图片中的荧光强度值得到如图5的柱状图。
由以上的结果可知，本发明使用的方法能够有效的针对CHP1基因进行无扩增的检测，后续可将浓度梯度继续向下调整，延长放置时间，可取适当的时间阈值，并结合数字微流控技术对样本液的浓度进行定量。
以上结合具体的实施例对本发明做了比较详细的说明，但这些具体的说明不应理解为对本发明的限制。应当理解，本领域普通技术人员在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述方法的配方包含CHP1基因的质粒、CrRNA、lwaCas13a蛋白、荧光Reporter。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a系统的CHP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1与SEQ ID NO.2所示；目标RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；荧光Reporter的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法，其特征在于，所述检测步骤可概括为：
(a)将所需试剂从冰箱中取出，进行解冻；
(b)取出一支ep管，向内加入26.13μL无引物复水缓冲液、10μL转录优化5X缓冲液、5μLrNTP、1μL T7聚合酶、1μLRnase抑制剂、1μL荧光Reporter、1μL质粒溶液、0.12μLCrRNA以及0.45μLCRISPR-Cas13a溶液；
(c)将加有试剂的ep管放在漩涡器上加速混合；
(d)使用针管将混合液吸入，并安装在微量进样器上；
(e)使用另一支针管吸入足量的油相液体，并安装在另一微量进样器上；
(f)调节混合液的进样速度为4-6μL/min，调节油相液体的进样速度为15-18μL/min；
(g)将产生的液滴放置在荧光显微镜下观测荧光。
CN202310307297.5A 2023-03-27 2023-03-27 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法 Pending CN116083532A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310307297.5A CN116083532A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310307297.5A CN116083532A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116083532A true CN116083532A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86202848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310307297.5A Pending CN116083532A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116083532A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200370097A1 (en) Quantitating high titer samples by digital pcr
US11891654B2 (en) Methods of making gene expression libraries
US11732300B2 (en) Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
Plongthongkum et al. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond
EP1784508B1 (en) Method for nucleic acid isolation and amplification
US8802367B2 (en) Methods for quantitative cDNA analysis in single-cell
EP3942036B1 (en) System
CN111560482A (zh) 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人乳头瘤病毒检测试剂盒
CN114269916A (zh) 用于样品分析的装置和方法
CN115109846A (zh) 用于准确的平行定量稀释或未纯化样品中的核酸的方法
JP2019509724A (ja) ヌクレアーゼ保護を使用する直接標的シーケンシングの方法
CN104059907A (zh) 含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用
US20060172314A1 (en) Quantification of amplified nucleic acids
CN116083532A (zh) 一种基于CRISPR-Cas13a系统的无扩增基因检测方法
JP2023514388A (ja) 並列化サンプル処理とライブラリー調製
JP2010501184A (ja) 検出方法
TW202411430A (zh) 準確地平行檢測和定量核酸的方法
JP2007330134A (ja) 核酸の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination