CN116077513B - 七叶皂苷或其盐在制备抗幽门螺杆菌药物及制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了七叶皂苷或其盐在制备抗幽门螺杆菌药物及制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用,属于生物医疗技术领域。本发明所述七叶皂苷或七叶皂苷盐制备的药物在实现抗幽门螺杆菌及治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡的同时,对机体的免疫功能不产生任何影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及七叶皂苷或其盐在制备抗幽门螺杆菌药物或制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是定植于胃黏膜上皮表面的一种微需氧革兰氏阴性菌,是诱发胃溃疡、胃癌等消化系统疾病的重要因素之一。胃溃疡是常见的消化性溃病,好发于中老年人,以男性居多。研究证明80%的胃溃疡患者中Hp检测呈阳性,经过治疗根除Hp后复发率仅为3%,因此靶向Hp的药物治疗是改善胃溃疡十分有效的方法。目前针对幽门螺杆菌感染胃溃疡的治疗方法主要包括一线疗法,二线疗法,三线疗法和序贯疗法,标准三联疗法的清除率可达80%左右。但在临床应用中,存在Hp对各类抗生素耐药性增强、诱发肠道菌群紊乱、药物毒副作用大、复发率高等诸多问题。吴优、杜奕奇等研究(吴优,新型药敏检测及胃微生态调节在难治性幽门螺杆菌感染治疗中的作用研究,中国人民解放军海军军医大学,2021。)表明Hp对克拉霉素耐药率81.8%,对左氧氟沙星耐药率78.8%,对甲硝唑耐药率45.5%,对阿莫西林耐药率33.3%,对呋喃唑酮耐药率9%;在上海地区Hp对抗生素单一耐药率为12.1%,双重耐药率达36.4%,多重耐药率更高达48.5%;因此,选择更加安全有效根除Hp的方法是治疗胃溃疡亟待解决的问题。
七叶皂苷是从中药娑罗子中提取得到的含有30多种皂苷的混合物,主要存在形式为α-七叶皂苷和β-七叶皂苷。其中α-七叶皂苷有七叶皂苷A、七叶皂苷B二种,β-七叶皂苷有七叶皂苷C、七叶皂苷D二种。
七叶皂苷具有众多药理活性,在抗炎、抗渗出、消肿、增加静脉张力和抗肿瘤等方面作用显著。此外,含有七叶皂苷的中药娑罗子功能主治为理气宽中、和胃止痛,可用于胸腹胀闷、胃脘疼痛。CN111939166B公开了一项七叶皂苷在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的用途。CN201910238241.2公开了一种治疗口腔溃疡的七叶皂苷钠复方含片及其制备方法。区别于已有治疗方法,我们发现七叶皂苷除具有抗炎、抗氧自由基、促进肠蠕动等作用外,同时具有抗幽门螺杆菌、保护胃粘膜,增强胃粘膜屏蔽功能的作用,尤其对幽门螺杆菌感染型胃溃疡具有良好治疗作用。并且迄今为止尚未发现有关七叶皂苷抗幽门螺杆菌作用及其治疗或改善幽门螺杆菌感染型胃溃疡的文献报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了七叶皂苷或其盐在制备抗幽门螺杆菌药物及制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用。本发明所述七叶皂苷的应用对机体的免疫功能不产生任何影响。
本发明的技术方案如下:
本发明涉及七叶皂苷或七叶皂苷盐在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
本发明涉及七叶皂苷或七叶皂苷盐在制备治疗幽门杆菌感染型胃溃疡药物中的应用。
进一步地,所述七叶皂苷为七叶皂苷组合物。
进一步地,按质量百分比计,所述七叶皂苷组合物包括如下组分:七叶皂苷A 0~30%;七叶皂苷B 0~25%;七叶皂苷C10~55%;七叶皂苷D10%~65%。
进一步地,按质量百分比计,所述七叶皂苷组合物包括如下组分:七叶皂苷A10%;七叶皂苷B10%;七叶皂苷C 40%;七叶皂苷D 40%。
进一步地,所述七叶皂苷盐为药学上可接受的各种盐。
进一步地,所述七叶皂苷盐为七叶皂苷钠盐或七叶皂苷赖氨酸盐。
进一步地,所述药物为有效剂量的七叶皂苷或七叶皂苷盐与药学上可接受的辅料制成的制剂。
进一步地,所述制剂为注射剂或口服剂。
进一步地,所述注射剂选自注射液、注射用无菌粉末或无菌块状物或冻干制剂;所述口服制剂选自片剂、口服液、混悬液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、合剂、糊剂、散剂、滴丸剂、泡腾剂。
本发明还涉及七叶皂苷组合物在降低caspase家族蛋白表达量的应用。
进一步地,所述七叶皂苷组合物包括如下组分:七叶皂苷A 0~30%;七叶皂苷B 0~25%;七叶皂苷C10~55%;七叶皂苷D10%~65%。
本发明有益的技术效果在于:
本发明首次提出了七叶皂苷或七叶皂苷盐在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
本发明首次提出了七叶皂苷或七叶皂苷盐在制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用,七叶皂苷在大鼠幽门螺杆菌感染型胃溃疡治疗实验中,连续七天给药后,治疗组均无胃溃疡现象,本发明为临床治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡提供了一个潜在的、有效的新药物选择。同时,进一步针对组方配比及机理进行了探索,获得最适用于幽门螺杆菌感染型胃溃疡的配方。
附图说明
图1为本发明空白组和实验组幽门螺杆菌菌株生长图。
图中:a、为空白组HP菌株生长图;b、为实验组HP菌株生长图。
图2为本发明不同实验组蛋白免疫实验结果图。
图3为本发明不同实验组胃组织Caspase酶活性图。
图4为对照组与治疗组大鼠感染胃溃疡的胃组织图。
图中a、b、c为对照组大鼠的胃组织图;d、e、f为治疗组大鼠的胃组织图。
图5为本发明不同浓度组WB检测结果图。
图6为本发明不同浓度组Caspase酶活性检测结果图
图7为本发明不同浓度组qPCR检测结果图
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
本发明提供了七叶皂苷或七叶皂苷盐在制备抗幽门螺杆菌药物及在制备治疗幽门螺杆菌感染型胃溃疡药物中的应用。包括以下实施例。
实施例1七叶皂苷抗幽门螺杆菌的实验研究
制备哥伦比亚血平板6只,其中3只为普通哥伦比亚血平板,设为空白对照组;另3只含有0.5%七叶皂苷(其中七叶皂苷为七叶皂苷C与七叶皂苷D,且七叶皂苷C与七叶皂苷D的质量比为4:6)溶液的哥伦比亚血平板,设为实验组。取幽门螺旋杆菌(HP)菌株分别在6只哥伦比亚血平板上进行接种,将接种后的哥伦比亚血平板放置于低氧培养小室中,37℃恒温培养,培养小室分别通5%空气、10%二氧化碳、85%氮气,同时放入无菌水,以保证幽门螺杆菌生长所需要的湿度,培养72h后进行观察。
实验结果显示:空白组HP菌株正常生长(见图1-a所示),实验组HP菌株无生长(见图1-b所示)。表明七叶皂苷对幽门螺旋杆菌具有抑制作用。
实施例2七叶皂苷对大鼠胃溃疡组织细胞凋亡的抑制作用研究
(1)乙醇诱导的大鼠胃溃疡模型建立与给药方案
取大鼠40只,随机分为正常组、模型组、给药组和模型给药组,每组10只。除正常组为空白组和给药组外,其余各组大鼠均一次性灌胃无水乙醇(0.2mL/10g)以诱导胃溃疡。灌胃无水乙醇后,各组大鼠继续禁食不禁水1小时。然后对正常组和模型组每天灌胃生理盐水(0.1mL/10g)一次,连续灌胃七天。给药组和模型给药组每天给予七叶皂苷(其中七叶皂苷为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D,且七叶皂苷A、七叶皂苷B、叶皂苷C、七叶皂苷D的质量比为1:1:4:4)1次,连续给药7天,剂量为20mg/kg。最后将灌胃或给药七天的大鼠麻醉后取胃组织冻存待检。
(2)蛋白免疫印迹法
取冻存的大鼠胃组织0.1g,加组织裂解液600μL,剪碎、匀浆、离心取上清,取50μL做BCA试剂盒对蛋白提取液进行定量分析。样品进行聚丙烯酚胺凝胶电泳,120V恒压转膜,室温封闭1小时,一抗4℃冰箱孵育过夜,1xTBST洗膜3次,每次10分钟,二抗室温孵育2小时,1xTBST洗膜3次,每次10分钟,最后采用化学发光底物进行化学发光,显影,并使用Image J软件进行数据分析。
免疫印迹检测结果显示,乙醇可以诱导胃组织中抑凋亡Bcl-2蛋白表达水平降低,促凋亡Bax蛋白水平升高,七叶皂苷能显著升高Bcl-2蛋白表达水平,降低Bax蛋白水平,与模型组相比均有显著差异(详见图2)。
(3)胃组织Caspase酶活性检测
取冻存的大鼠胃组织放入管中,每管加1ml组织裂解液,于冰上用匀浆机充分匀浆,裂解10分钟。裂解后于4℃,12000rpm离心10分钟,吸取上清为蛋白溶液。测定pNA标准曲线:标准品稀释液的配制:按照缓冲液:裂解液=9:1的比例配制适量的标准品稀释液。将pNA(10mmol/L)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μmol/L待用。标准品和样本中加入Ac-DEVD-pNA后混匀,37℃孵育1小时。用酶标仪在405nm处测吸光值,绘制标准曲线,计算Caspase酶活性。
检测诱导凋亡蛋白Caspase 3,6,9的活性,结果显示,模型组中Caspase 3,6,9的活性均显著升高,七叶皂苷能显著抑制三者的活性,提示七叶皂苷具有抑制胃组织细胞凋亡的作用(详见图3)。
实施例3
七叶皂苷在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
取大鼠6只,一次性灌胃无水乙醇(0.2mL/10g)并禁食不禁水1小时以诱导胃溃疡,随后灌以接种幽门螺旋杆菌培养液2ml。将大鼠随机分为对照组和治疗组,每组3只。对照组每天灌胃生理盐水(0.1mL/10g);治疗组按每天灌胃0.2%七叶皂苷(其中七叶皂苷为七叶皂苷C与七叶皂苷D,且七叶皂苷C与七叶皂苷D的质量比为3.5:6.5)溶液1次,剂量为20mg/kg,连续7天。将大鼠麻醉后取胃组织观察。
结果显示:对照组胃组织明显存在局部溃疡和多处糜烂现象(详见图4中a、b、c所示)。治疗组3只均无胃溃疡现象,有1只存在局部糜烂现象,2只表面光洁(详见图4中d、e、f所示)。表明七叶皂苷对大鼠幽门螺旋杆菌感染型胃溃疡具有良好的治疗作用。
实施例4
不同七叶皂苷活性成分组合的比对
(1)乙醇诱导的大鼠胃溃疡模型建立与给药方案
取大鼠40只,随机分为空白组、模型组、模型试验药组和模型对照组,每组10只。空白组和模型组灌胃生理盐水(0.1mL/10g),每天1次,连续7天;模型试验组每天给予七叶皂苷组合1(七叶皂苷A:七叶皂苷B:叶皂苷C:七叶皂苷D,1:1:4:4)1次,连续给药7天,剂量为20mg/kg;模型对照组每天给予七叶皂苷组合2(七叶皂苷A:七叶皂苷B:叶皂苷C:,4:4:2)1次,连续给药7天,剂量为20mg/kg。除空白组外,其余各组大鼠均一次性灌胃无水乙醇(0.2mL/10g)以诱导胃溃疡。灌胃无水乙醇后,各组大鼠继续禁食不禁水1小时。将大鼠麻醉后取胃组织冻存待检。
(2)胃组织Caspase酶活性检测
取冻存的大鼠胃组织放入管中,每管加1ml组织裂解液,于冰上用匀浆机充分匀浆,裂解10分钟。裂解后于4℃,12000rpm离心10分钟,吸取上清为蛋白溶液。测定pNA标准曲线:标准品稀释液的配制:按照缓冲液:裂解液=9:1的比例配制适量的标准品稀释液。将pNA(10mmol/L)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μmol/L待用。标准品和样本中加入Ac-DEVD-pNA后混匀,37℃孵育1小时。用酶标仪在405nm处测吸光值,绘制标准曲线,计算Caspase酶活性。
WB检测结果如附图5所示,与空白组相比,模型组中caspase3、caspase6和caspase9蛋白表达升高,表明细胞凋亡增加。与模型组相比,模型试验药组和模型对照组中caspase3、caspase6和caspase9蛋白降低。表明细胞凋亡减少,与模型对照组相比,模型试验药组中caspase3、caspase6和caspase9蛋白降低,表明细胞凋亡减少。结果显示模型试验药组抑制细胞凋亡效果比模型对照组较好。
Caspase酶活性检测结果如图6显示,与空白组相比,模型组中caspase3、caspase6和caspase9活性升高,表明细胞凋亡增加。与模型组相比,模型试验药组和模型对照组中caspase3、caspase6和caspase9活性降低。表明细胞凋亡减少,与模型对照组相比,模型试验药组中caspase3、caspase6和caspase9活性降低,表明细胞凋亡减少。结果显示模型试验药组抑制细胞凋亡效果比模型对照组较好。
qPCR检测结果如图7显示,与空白组相比,模型组中caspase3、caspase6和caspase9 mRNA升高,表明细胞凋亡增加。与模型组相比,模型试验药组和模型对照组中caspase3、caspase6和caspase9 mRNA降低。表明细胞凋亡减少,与模型对照组相比,模型试验药组中caspase3、caspase6和caspase9 mRNA降低,表明细胞凋亡减少。结果显示模型试验药组抑制细胞凋亡效果比模型对照组较好。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种七叶皂苷组合物在制备治疗胃溃疡药物中的应用,其特征在于,所述七叶皂苷组合物包括如下组分:七叶皂苷A 10%;七叶皂苷B 10%;七叶皂苷C 40%;七叶皂苷D 40%。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为有效剂量的七叶皂苷或七叶皂苷盐与药学上可接受的辅料制成的制剂,所述制剂为口服液、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂或泡腾剂。
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