CN116075586A - 用于过滤和细胞生长的过滤组件、盒、系统和方法 - Google Patents

用于过滤和细胞生长的过滤组件、盒、系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明的特征在于用于从样本溶液中过滤细胞并且然后孵育捕获的细胞的过滤组件、盒、系统和方法。

Description

用于过滤和细胞生长的过滤组件、盒、系统和方法
背景技术
许多行业需要确定样本中的微生物数量。一种确定样本中微生物数量的方法包括在膜上捕获微生物、在膜上培养微生物、并对形成的菌落数量进行计数。操纵膜会引入非样本微生物污染物或碎片、损坏膜或产生缺陷，所有这些都会妨碍计数。
因此，需要新的用于微生物计数的过滤和培养装置。
发明内容
本发明提供了用于从样本溶液过滤细胞并且然后培养捕获的细胞以用于例如菌落形成单位(CFU)的成像和计数的装置、系统和套件。本发明的过滤组件、盒、系统和方法特别适于结合到自动化计数系统和过程中。
在第一方面，本发明提供了一种过滤组件，包括漏斗、包括多孔膜的膜框架和带有膜支撑件和出口的基座。膜框架可释放地附接到漏斗，并且基座可释放地附接到漏斗。在过滤期间，液体从漏斗通过膜和膜支撑件流到出口。在一些实施例中，膜支撑件在过滤期间保持膜平坦。
在一些实施例中，漏斗通过锁定机构附接到基座，当按压基座外壁的一部分时，锁定机构释放。在某些实施例中，多孔膜被超声结合或热熔到膜框架。在其他实施例中，膜框架通过漏斗上的凸起唇缘和膜框架中的凹部的互锁布置可释放地附接到漏斗。在某些实施例中，膜框架包括与盒基座上的突出部互锁的突出环。在一些实施例中，膜是黑色的和/或非荧光的。在特定实施例中，膜是黑色混合纤维素酯膜。
在一些实施例中，漏斗是透明的和/或包括体积标记。在某些实施例中，过滤组件还包括覆盖通向漏斗的开口的漏斗盖。在一些实施例中，漏斗盖铰接在漏斗上。在一些实施例中，膜支撑件附接到过滤器基座。在某些实施例中，过滤器基座包括多个支撑件，这些支撑件被构造成促进流体流到出口和/或支撑膜支撑件。在一些实施例中，膜框架还可以包括基准标记。
在一些实施例中，过滤组件还包括垫圈。在某些实施例中，垫圈附接到膜支撑件和/或为薄膜。在特定实施例中，垫圈和膜支撑件是单个模制部分。在一些实施例中，垫圈包括弹簧。在一些实施例中，垫圈和膜支撑件是单个模制部分。
在某些实施例中，过滤组件包括位于膜和膜支撑件之间的空腔和/或垫片。在某些实施例中，膜支撑件和/或基座被成形为产生空腔。
本发明的第二方面提供了一种带基座层的盒基座，该基座层包括外壁、包括多个径向设置的间隙的第一内壁、和第二内壁。第二内壁具有外侧横档并限定凹孔，并且第一内壁设置在外壁和第二内壁之间。盒还包括凹孔中的固体或半固体营养培养基。培养基具有高于第二内壁的平坦生长区域。该盒还包括能够可释放地密封到基座的盒盖。
在一些实施例中，盒盖是光学透明且非荧光的。在一些实施例中，盒基座是非荧光的。在某些实施例中，盒还包括设置在第一内壁和外壁之间的第三内壁。在特定实施例中，盒还包括在第三内壁和外壁之间的第四内壁。
在一些实施例中，第二内壁包括朝向第一内壁径向突出的多个支撑件。
在一些实施例中，盒包括垫圈。在某些实施例中，垫圈附接到盒基座和/或为薄膜。在特定实施例中，垫圈和盒基座是单个模制部分。在一些实施例中，垫圈包括弹簧。
在一些实施例中，盒基座被设置成接收相对于平坦生长区域以1°到75°之间的角度降低到基座上的膜。在某些实施例中，盒基座包括由环状布置的多个弹簧支撑的环，其中多个弹簧中最高的弹簧与多个弹簧中最低的弹簧对跖，并且设置在它们之间的多个弹簧在高度上逐渐减小。在一些实施例中，盒基座包括接合膜框架的特征，以导致膜和平坦生长区域之间的初始角度在1°和75°之间。
本发明的另一方面提供了一种用于过滤和培养细胞的系统。该系统可以包括第一方面的过滤组件的实施例，以及第二方面的盒的实施例。膜框架被构造成从带有漏斗的过滤器基座分离，附接到盒基座，并且一旦附接到盒基座就从漏斗分离。
在系统的一些实施例中，膜框架包括突出环，并且盒基座包括与突出环互锁的突出部。在一些实施例中，将膜框架附接到盒基座将膜放置成与平坦生长区域共形接触。
本发明的另一方面提供了一种确定微生物存在的方法。该方法包括将第一方面的任何实施例的过滤组件附接到真空源。该方法还包括使样本流体流过过滤组件，使得流体中的任何细胞被保留在膜上，使附接到膜框架的漏斗从基座分离，将膜框架附接到第二方面的盒基座，以及使漏斗从膜框架分离。然后可以孵育该膜。
在一些实施例中，该方法还包括对膜进行成像以检测由保留的细胞形成的任何菌落。
在一些实施例中，过滤组件包括空腔，并且该方法包括施加压力，例如来自真空的压力，以使膜适形于膜支撑件和/或空腔的形状。在某些实施例中，在使漏斗从基座分离后，膜保持膜支撑件和/或空腔的形状。在特定实施例中，成形膜与盒相互作用，以防止在将膜附接到盒基座期间截留气泡。
在一些实施例中，膜在其圆周上的第一点处与平坦生长区域进行第一次接触，并在与第一点对跖的圆周上的第二点处进行最终接触。在一些实施例中，膜框架最初相对于平坦生长区域以1°到75°之间的角度降低到基座上。在某些实施例中，盒包括接合膜框架的特征，以在膜框架被降低到盒基座上时，将膜定位成相对于平坦生长区域以1°到75°之间的角度接触平坦生长区域。在某些实施例中，特征包括由环形布置的多个弹簧支撑的逐渐变细的环，其中多个弹簧中最高的弹簧与多个弹簧中最低的弹簧对跖，并且设置在它们之间的多个弹簧在高度上逐渐减小。
应当理解，本文描述的过滤组件、盒、系统和方法可以包括在此规定的特征之外的附加特征，包括与下面的过滤组件、盒、系统或方法的结构一致的任何特征。
如本文使用的术语“约”是指所述数值的±10％。
附图说明
图1是示出过滤样本、然后将膜转移到盒基座以用于细胞生长的示意图。
图2A是示出具有盖的本发明的漏斗的示意图。图2B是示出本发明的过滤组件的分解图的示意图，其特征在于：具有漏斗盖的漏斗；具有膜的膜框架、和基座。
图3是示出(从左到右)示例的示意图：没有膜的膜框架；过滤组件基座和膜支撑件(例如，扁平烧结热塑性聚合物盘，诸如
Figure BDA0004110386600000041
)；和盒基座。
图4是示出本发明的漏斗、膜框架和基座在附接时的横截面的示意图。
图5是示出漏斗、膜框架和基座的特写的示意图。
图6是本发明的实施例的示意图，其特征在于具有体积标记的透明漏斗和基座，该基座的特征在于在基座的外壁中用于从基座释放漏斗的按钮。
图7A是无盖堆叠的本发明过滤组件的示意图。图7B是有盖堆叠的本发明的过滤组件的示意图。
图8A是本发明的过滤组件的示意图，其特征在于注射模制的盖。
图8B是本发明的过滤器的示意图，其特征在于热成型盖。
图9是示出具有三种不同盖的本发明的过滤组件的示意图。
图10是示出具有铰接盖的本发明的过滤组件的示意图。
图11A-11B是示出本发明的过滤组件的交错布置的示意图。
图12A-12B是示意图，示出了与矩形布置相比的本发明的过滤组件的交错布置。
图13A-13B是示出本发明的过滤组件在本发明的托盘上的交错布置的示意图。
图14是示意图，示出了具有在附接时的漏斗、膜框架和基座的过滤组件的横截面。
图15A是示出本发明的漏斗的俯视图和仰视图的示意图。图15B是示出本发明的基座的俯视图和仰视图的示意图。图15C是示出本发明的膜框架(没有膜)的俯视图和仰视图的示意图。
图16A是示出本发明的盒基座的俯视图和仰视图的示意图。图16B是示意图，示出了本发明的漏斗、膜框架和盒基座在附接时的横截面。
图17是示意图，示出了具有在附接时的漏斗、膜框架和基座的过滤组件的横截面。
图18A是示出本发明的漏斗的俯视图和仰视图的示意图。图18B是示出本发明的基座的俯视图和仰视图的示意图。图18C是示出本发明的膜框架(没有膜)的俯视图和仰视图的示意图。
图19A是示出本发明的盒基座的俯视图和仰视图的示意图。图19B是示出漏斗、膜框架和盒基座在附接时的横截面的示意图。
图20是示出漏斗、膜框架和盒基座在附接时的特写横截面的示意图。
图21是示出过滤组件的一部分的特写横截面的示意图，包括在附接时的漏斗、膜框架和基座附图，并示出了密封件和各种突出部。
图22是示出了本发明的漏斗、膜框架和盒基座的特写横截面的示意图，包括盒基座上用于解除膜框架上的突出部的接合的特征。
图23是具有固体或半固体营养培养基和膜框架中的膜的本发明的盒基座的图示，示出了膜框架中的膜以一定角度(顶部到底部)放置在固体或半固体营养培养基上。
图24是示出本发明的过滤组件的横截面的示意图。
图25是示出具有固体或半固体营养培养基和垫圈的本发明的盒基座的图示。
图26A是示出在本发明方法的过滤步骤期间本发明的部分横截面的图示。图26B是示出将膜框架中的膜附接到盒基座的图示。
图27是示出本发明的各种有益特征的图示。
图28A-28D是示出本发明的不同垫圈的图示。图28A示出了作为附接(例如，通过机械相互接合)到膜环的一部分的垫圈。图28B示出了作为附接(例如，通过机械相互接合)到膜框架的薄膜的垫圈。图28C示出了作为单个模制部分的垫圈和膜框架。图28D示出了作为连结(例如，热连结)到膜框架的膜的垫圈。
图29A-29C是附接到盒基座的本发明的垫圈的图示。图29A示出了作为与固体或半固体营养培养基接触的附接部分的垫圈。图29B示出了作为附接到盒并与固体或半固体营养培养基接触的薄膜的垫圈。图29C示出了作为附接到盒的弹簧的垫圈。
图30A和30B是在具有成角度的垫片的本发明的过滤组件基座上的本发明的膜的照片。
图31是本发明的盒基座的照片，该盒基座包括成角度的装有弹簧的(sprung)元件，以在将膜转移到盒基座期间控制膜的搁置。
图32是示出包括本发明垫圈的本发明过滤组件的局部剖视图的示意图。
图33是示出在将具有本发明的薄膜(例如，0.1mm)和较厚(例如，0.45mm)垫圈的本发明的膜框架中的膜搁置在盒基座中的固体或半固体营养培养基上之前和之后、具有该膜的本发明的盒基座的横截面的示意图。薄膜(例如，0.1mm厚)适形于膜压力。较厚(例如，0.45mm)垫圈适形于膜压力，并呈现贝氏垫图形状，并钻入固体或半固体营养培养基中。甚至更厚的(例如，0.80垫圈)是刚性的，并且在压力下不太适形于膜，从而导致额外的拉伸，并且钻入固体或半固体营养培养基中。
具体实施方式
本发明提供了用于微生物生长计数(例如细菌、真菌和古菌)的过滤组件、盒、系统和方法。本发明的装置、系统和方法特别适于自动化计数，并允许以降低膜损坏或污染可能性的方式在部件之间转移保留细胞的膜。
过滤组件
本发明的一个装置是过滤组件，用于过滤样本并保留其中可能发现的任何微生物(参见例如图2B、图14或图17)。本发明的过滤组件的特征在于漏斗(例如，图2A、图15A或图18A)、包括多孔膜(例如，混合纤维素酯膜)的膜框架(例如，如图3、图15C或图18C所示的环)、具有膜支撑件(例如，烧结热塑性聚合物的平坦的盘或具有平坦部分的成形盘)和出口(例如，用于连接到真空源)的基座(例如，图3、图15B或图18B)。膜框架可释放地附接到漏斗(例如，通过互锁或重叠特征或摩擦或紧配合，参见例如图4或图21)，并且基座可释放地附接到漏斗(例如，利用锁定机构)。在过滤期间，液体从漏斗通过膜和膜支撑件流到出口。该组件的结构允许膜框架在附接到漏斗时从基座分离，以便以避免直接操作膜或膜框架的方式转移到盒基座。
在一些实施例中，膜支撑件在过滤期间保持膜平坦，例如，通过具有保持膜支撑件和膜共形接触的高度。可以被烧结以产生膜支撑件的合适材料包括例如高密度或超高分子量聚乙烯、聚醚砜、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯等。也可以使用本领域已知的其他热塑性聚合物。在一些实施例中，膜支撑件附接到过滤器基座(例如，通过胶粘或互锁特征)，这防止膜支撑件与漏斗和膜框架一起被移除。膜支撑件也可以直接结合到基座中，例如在基座的制造期间。替代地，膜支撑件允许膜在过滤期间变形，例如，以适形于膜支撑件中的空腔。
在一些实施例中，漏斗通过锁定机构附接到基座，当按压基座的外壁的一部分时该锁定机构释放(例如，解除闩锁接合的按钮，例如，图6)。在一个示例中，基座的壁的外部部分可以包括具有向内突起(例如，突出部)的柔性铰链，该柔性铰链将向外突出的特征锁定在漏斗外壁的一部分上(例如，环或横档)，其中按压铰链使闩锁缩回，从而将漏斗从基座释放。铰链的特征也可以在于支点。其他合适的锁定机构包括可变形的突出部或扣件，它们可以通过将漏斗和基座拉开而分开。
在某些实施例中，多孔膜被超声结合或热熔到膜框架。其他合适的结合方法可以包括粘合剂结合、机械保持等。膜框架可以通过例如漏斗上的凸起唇缘和膜框架外壁中的凹部的互锁布置可释放地附接到漏斗(例如，图4)。在某些实施例中，膜框架可以包括与盒基座上的突出部互锁的突出环。替代地，突出部可以在膜框架上(例如，图15C或图18C)并且环在盒基座上(例如，图20)。膜框架上的锁定特征(例如，突出部或环)可被构造成，与保持到过滤组件的基座相比，将膜框架更牢固地保持到漏斗。膜框架上的锁定特征可以是用于附接到过滤组件基座的特征，与盒基座相同，但是过滤组件基座的一个或多个互补特征与盒基座上的对应一个或多个特征相比提供更弱的相互作用。膜框架上的锁定特征(例如，突出部)也可以被构造成与盒基座上的特征相互作用，该特征用于从漏斗解除锁定特征的接合。膜框架上的锁定特征可以是对跖地(antipodally)不对称的，例如，被构造成首先用一个锁定特征与盒基座接合，并且最后用与第一锁定特征对跖的锁定特征与盒基座接合。
膜框架包括多孔膜，细胞在过滤期间保留在该多孔膜上(参见，例如，图2B)。膜可以是黑色的和/或非荧光的，以便不干扰成像和计数。示例性的膜是黑色混合纤维素酯膜。其他合适的膜材料可以包括例如纤维素、醋酸纤维素、乙烯醋酸乙烯酯、聚苯乙烯、硝化纤维、聚醚醚酮、尼龙、聚烯烃(例如聚乙烯或聚丙烯)、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚砜、径迹蚀刻聚酯或聚碳酸酯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、醋酸纤维素和硅酮共聚物等。膜的特征也可以在于表面涂层，例如，以允许或促进细胞附着或菌落生长。材料和/或涂层的选择可取决于预期被保留的细胞类型。取决于应用，本发明的膜具有防止微生物(诸如细菌或酵母)通过的孔径，例如约0.45μm，例如约0.1-1μm(例如0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm)。膜外部的膜框架可以由允许附接到过滤器和基座的任何合适的材料制成，例如塑料或金属。
漏斗可以是透明的和/或包括体积标记，以帮助用户添加正确量的样本流体，并允许体积数据生成，即每单位体积样本流体的CFU数。漏斗还可以包括在内部中的密封件(例如，图2A)，该密封件压靠在膜上并限定感兴趣的区域(例如，图5)，该区域限定可以发现细胞的区域。当漏斗和膜框架从基座移除时，膜可与密封件分开，例如，以防止密封件在膜框架附接到盒基座时与营养培养基相互作用。过滤组件还可以包括覆盖到漏斗的开口的漏斗盖，该漏斗盖可以铰接在漏斗自身上。漏斗盖可用于保护膜表面而在储存或使用期间免受污染。铰接盖可以由单独的盖和漏斗形成，例如，通过每个盖和漏斗具有夹在一起以形成铰链的特征(例如，参见图10)。这种设置具有用于储存和运输多个过滤组件的优点，因为它们可以在没有处于覆盖位置的盖的情况下更高效地堆叠(例如，参见图7A至图7C)。本发明的盖可以是(例如，图8B或图9)热成型或注射模制的(例如，图8A或图9)，并且可以具有与漏斗相同的材料或另一种合适的材料。漏斗和盖可以由任何合适的材料形成，诸如塑料或金属。
基座将过滤组件连接到真空源，例如经由漏斗形件(tulip)。本发明的基座可以成形为联接到例如漏斗形阀，从而允许出口与真空源流体连通。在某些实施例中，过滤器基座包括多个支撑件，这些支撑件被构造成促进流体流到出口和/或支撑膜支撑件。过滤基座可包括用于与真空源配合的特征，例如，接收漏斗形阀的唇缘的凹槽，或另一密封构件。
由于膜框架的最终用途可能是用于菌落生长的成像，所以膜框架或膜还可以包括基准标记，以帮助在例如孵育时间序列内保持多个图像的对准。基准标记也可以帮助与机器人处理系统对准。
膜框架可以被构造(例如，通过具有定位特征)成最初以1°和75°之间的角度降低到基座上((例如，在约1°和5°、约1°和10°、约1°和15°、约10°和15°、约15°和25°、约20°和30°、约25°和35°、约30°和40°、约35°和45°、约40°和50°、约45°和55°、约50°和60°、约55°和65°、约60°和70°、或约°65和75°之间)，例如在约1°和37.5°之间、约10°和40°、约15°和45°、约22.5°和67.5°、约40°和70°、约25°和75°、或约35°和75°，例如至少5°、10°、15°、20°、25°或30°，例如约22.5°、约30°、约45°、约60°、约67.5°)。
过滤组件可包含设置在膜下方的垫圈，参见例如图28A-28D和图32，例如围绕膜框架的内边缘。垫圈可以是单个元件，例如，环状圈或部分环(例如，C形)，或者多个元件(例如，环状地布置为不连续的环)。垫圈可以是例如塑料，例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚碳酸酯等。过滤组件中的垫圈可以是膜框架的一部分，例如，附接到膜框架(例如，通过机械接合或密封，例如，通过粘合剂或热结合)，或者与膜框架一起形成(例如，模制，例如，作为单个部分)。垫圈可以减少膜下的气泡截留(例如，当转移到盒时)。作为膜支撑件一部分的垫圈可以提高膜的平坦度，例如，当在固体或半固体营养培养基上拉伸时。本发明的垫圈可以包括荧光材料，以作为基准标记透过示出，例如经由膜或膜框架中的孔。垫圈可以是薄膜，例如小于约0.2mm厚，例如0.1至0.2mm、0.5至0.15mm、0.01至0.05mm或约0.05mm、0.07mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm或约0.15mm厚。垫圈可以是更厚、更刚性的环，例如大于0.2mm厚，例如约0.2至0.3mm、0.25至0.35mm、0.3至0.4mm、0.35至0.45mm、0.4至0.5mm、0.45至0.55mm、0.5至0.6mm、0.55至0.65mm、0.6至0.7mm、0.65至0.75mm、0.7mm至0.8mm、0.75至0.85mm、0.8至0.9mm、0.85至0.95mm或0.9至1mm厚。垫圈可以是平坦的。垫圈可以是光滑的。垫圈可以允许在膜安置在盒基座上时减小摩擦。
本发明的过滤组件可被构造成拉伸膜，使得其适形于平坦表面(例如，膜支撑件的表面)，参见例如图24和26A。过滤组件可包括位于膜支撑件和膜之间的空腔，当过滤发生时，膜被吸入该空腔中。膜支撑件可以被成形为产生空腔，例如，具有围绕中心平坦的盘区域向上逐渐变细的边缘。基座的内部可以类似地逐渐变细，以容纳或产生空腔。基座中的垫片可以使空腔成形。过滤之后的膜的形状可以全部或部分地由垫片确定(参见例如图30A和30B)。垫片可以是过滤基座的附加物(例如，静置在其上附接到其，例如，通过机械接合或密封，例如，通过粘合剂或热结合)或是过滤基座的一部分(例如，与其一起模制)。
盒
本发明提供了用于细胞生长(例如在本文所述的膜上)的盒。本发明的盒包括盒基座(参见例如图3、图16A或图19A)，该基座具有基座层，基座层包括外壁、包括多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多)径向设置的间隙的第一内壁、和第二内壁。第一内壁位于第二内壁和外壁之间。第二内壁限定用于保持固体或半固体营养培养基的凹孔。第二内壁还包括外侧横档，其可以允许凹孔被营养培养基过度填充。具有高于第二内壁的平坦生长区域的固体或半固体培养基确保当框架附接到基座时，通过将膜共形地压靠在培养基上，膜保持平坦以用于成像。盒基座层还可以在第一内壁和外壁之间具有一个或多个孔(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多)(例如，图3或图19A)。这些孔可以有助于防止当膜附接到盒基座时，气泡被截留在膜下面。截留在膜和培养基之间的气泡不仅会阻止膜的区域接收营养物，而且还可能会扭曲膜并混淆成像。这些孔还可以接收膜框架上的一个或多个突出部，作为膜框架和盒基座之间的锁定机构的一部分(例如，参见图19B)。盒基座可以包括这样的特征(例如，参见图21和图22)，该特征用于在漏斗和膜框架被推到盒基座上，解除膜框架和漏斗的互锁特征的接合。该盒还包括能够可释放地密封到基座的盒盖。
在一些实施例中，第二内壁可包括多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)朝向第一内壁径向突出的支撑件。这种径向支撑件可以有助于将过度填充的培养基保持到横档，并增加平坦生长区域的直径。其他内壁的特征也可以在于朝向外壁径向突出的多个支撑件，例如用于支撑膜框架。
盒还可以具有设置在第一内壁和外壁之间的第三内壁，并且可以附加地具有位于第三内壁和外壁之间的第四内壁(例如，参见图3)。盒可以包括附加的内壁(例如，5、6、7、9或10个或更多个)。在一些实施例中，内壁中的一个或多个被构造成与膜框架和漏斗之间的锁定机构(例如，突出部)相互作用，以便解除锁定机构接合并释放漏斗。
固体或半固体营养培养基可以是任何合适的培养基。示例包括沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、R2A琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)运送培养基(letheen)和平板计数琼脂(PCA)。其他培养基是本领域已知的。平坦生长区域的直径通常至少为5mm，例如5至200mm，例如10至80mm。
盒盖可以是热成型的或注射模制的。盒盖可以优选是光学透明的(例如，通过光来检测细胞)和/或非荧光的(例如，允许通过自发荧光来检测细胞)，例如，环烯烃聚合物盖。其他合适的透明盖材料可以包括PET、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯四氟乙烯、聚苯乙烯等。盒可以包括在运输期间保护盒的覆盖盖，例如柔性聚合物(例如橡胶)盖。
盒基座可以优选地由非荧光材料制成，以防止干扰成像，例如黑色苯乙烯-丁二烯共聚物。
盒可包括位于第二内壁顶部上或连接到第二内壁的垫圈，参见例如图29A-29C和图33，其例如设置在膜和第二内壁和/或固体或半固体营养培养基之间。盒中的垫圈可以是单个元件，例如，环状环或部分环(例如，C形)或多个元件(例如，环状地布置为不连续的环)。垫圈可以是例如塑料，例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚碳酸酯等)。盒中的垫圈可以是盒基座的一部分，例如，附接到(例如，通过机械接合或密封，例如，通过粘合剂或热结合)，或者与盒基座一起形成(例如，模制，例如，作为单个部分)。垫圈可以减少膜和固体或半固体营养培养基之间的气泡截留。垫圈可以提高膜的平坦度，例如，当在固体或半固体营养培养基上拉伸时。作为盒基座一部分的垫圈可以提高膜的平坦度，例如，当在固体或半固体营养培养基上拉伸时。本发明的垫圈可以包括荧光材料，以作为基准标记透过示出，例如经由膜或膜框架中的孔透过示出。垫圈可以是薄膜(参见例如29B)，例如小于约0.2mm厚，例如0.1至0.2mm、0.5至0.15mm、0.01至0.05mm，或约0.05mm、0.07mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm或约0.15mm厚。垫圈可以是更厚(例如参见图29A)、更刚性的环，例如大于0.2mm厚，例如约0.2至0.3mm、0.25至0.35mm、0.3至0.4mm、0.35至0.45mm、0.4至0.5mm、0.45至0.55mm、0.5至0.6mm、0.55至0.65mm、0.6至0.7mm、0.65至0.75mm、0.7至0.8mm、0.75至0.85mm、0.8至0.9mm、0.85至0.95mm或0.9至1mm厚。垫圈可以是平坦的。垫圈可以是光滑的。垫圈可以是装有弹簧的附接部分(参见，例如，图29C)，例如，被设置成在压下的膜的压力下朝向营养培养基向下弯曲。当垫圈是薄膜(例如，约0.1mm厚)时，它可以适形于膜和/或营养培养基的形状。当较厚时(例如，约0.45mm厚)，垫圈可适形于垫圈的压力并呈现贝氏垫圈形状，从而钻入营养培养基中。当垫圈更厚时(例如，约0.8mm)，它可能更不太适形于膜压力并钻入营养培养基中。当膜安置在盒基座上时，垫圈可以允许摩擦减小。
盒基座可被构造成与膜框架接合，使得当膜与固体或半固体营养培养基接触时，膜框架和膜成角度(例如，在1°和75°之间)。例如，盒基座可包括成角度的特征，诸如成角度的槽、突出部、扣件、凸轮、闩锁或钩，其以相对于培养基表面的角度接合膜框架。
盒基座可以被构造(例如，通过具有定位特征)成使得膜框架可以以在1°和75°之间的角度(例如，在约1°和5°、约1°和10°、约1°和15°、约10°和15°、约15°和25°、约20°和30°、约25°和35°、约30°和40°、约35°和45°、约40°和50°、约45°和55°、约50°和60°、约55°和65°、约60°和70°、或约65°和75°之间)，例如在约1°和37.5°、约10°和40°、约15°和45°、约22.5°和67.5°、约40°和70°、约25°和75°、或约35°和75°之间，例如至少5°、10°、15°、20°、25°或30°，例如约22.5°、约30°、约45°、约60°或约67.5°。
在一些实施例中，盒基座可包括具有不同高度的弹簧的环，参见例如图31，例如，其被设置成使得环的一侧在其对跖物之前接触膜或膜框架，从而导致膜的相对侧首先接触营养培养基。
当膜框架附接到盒基座时，盒基座与膜框架和固体或半固体培养基一起可以用于拉伸膜。本发明的垫圈也可有助于拉伸膜。
系统和套件
本发明提供了用于过滤和培养细胞的系统，例如用于微生物计数。本发明的系统包括本发明的过滤组件和盒。在本发明的系统中，过滤组件的膜框架被构造成从过滤组件的基座分离、附接到盒基座、并且一旦附接到盒基座就从漏斗分离。通过保持膜框架附接到漏斗、直到它牢固地附接到盒基座，膜在转移过程期间受到保护免受污染和损坏。
本发明的系统要求膜框架能够以产生比膜框架到漏斗的附接更牢固的附接的方式附接到盒基座。为了实现这一点，膜框架可以包括突出环，并且盒基座可以包括与突出环互锁的突出部，以将膜框架附接到盒基座。替代地，这些特征可以颠倒，并且盒的特征可以在于例如从内壁中的一个突出的环，并且膜环可以包括突出部。替代地或附加地，盒可以包括压靠在膜框架或漏斗上的突出部上(例如，见图21)并解除互锁特征的接合的特征(例如，内环，如图22所示)。
在一些实施例中，将膜框架附接到盒基座使膜与生长区域共形接触，即，保持膜和培养基压在一起。在成像期间，保持膜生长区域的平坦度(例如通过压靠在培养基上)是有利的。
套件可包括一个或多个本文所述的装置。例如，当漏斗和/或盒不包括盖时，本发明的套件可以包括一个或多个单独的盖，用于覆盖漏斗和/或盒。盖可以包括在具有过滤组件和盒的套件中，或者单独包装。套件可以包括过滤组件和盒，或者多个过滤组件，或者多个盒，使得例如不可知微生物的过滤组件可以由用户与针对某种微生物的盒配对。替代地，过滤组件可以是针对某种微生物的。套件可以包括在运输期间保护盒基座的柔性聚合物覆盖件和用于孵育和成像的透明和/或非荧光的单独的盖。套件也可以包括如本文所述的作为单独部件的垫圈。
本发明的系统或套件还可包括用于保持多个过滤组件(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多)的托盘。在一些实施例中，该系统还包括设置成保持六个过滤组件的基座，例如如图13A和图13所示。托盘可能够在有过滤组件和没有过滤组件的情况下堆叠。托盘可以以交错布局(例如，见图13A和图13B)或矩形布局(例如，图12B)保持过滤组件。与矩形布置相比，交错布置可以允许过滤组件的堆叠托盘占据更少的体积，例如在运输期间(参见例如图12A)。托盘可以是热成型或注射模制的。
本发明的过滤组件和盒可以与作为套件和系统的一部分的各种外部部件组合，例如真空泵、抽吸器、液体处理机器人、机械臂、光源(例如激光器)、检测器、加热器(例如用于孵育)、冷却器(例如用于储存)、试剂(例如用于细胞染色)等。
方法
本发明提供了用于确定样本(例如水样本)中微生物(例如细菌或酵母)存在的方法。示例性的方法包括首先将过滤组件附接到真空源，例如通过将基座连接到与真空泵或抽吸器相连的漏斗形阀。然后，该方法包括使样本流体流过过滤组件，使得流体中的任何细胞保留在膜上。然后，在将膜框架附接到本发明的盒基座之前，使附接到膜框架的漏斗从基座分离(例如，通过按压释放闩锁的按钮)(例如，如图16B或图19B所示)。然后使漏斗从膜框架分离，并孵育盒以允许任何保留的细胞繁殖。该方法有利地允许膜的转移，而无需处理和冒着损坏或污染的风险。该方法特别有利于结合到自动化测试系统中。图1示出了本发明方法的示例。
本发明的方法可包括使用压力，例如来自真空的压力，以使膜在膜和膜支撑件之间呈现空腔的形状(参见例如图24、26A和27)。在使膜框架从基座分离之后且直到膜框架连接到盒基座(例如，参见图27)，膜可以保持这种形状。成形的膜可以与盒(例如，固体或半固体培养基)相互作用，以防止在将膜附接到盒基座期间截留气泡(例如，参见图27)。
在本发明的方法中，膜可以在其圆周上的第一点处与平坦生长区域进行第一次接触，并在圆周上的与第一点对跖的第二点处进行最终接触(参见例如图26B)。在第一接触点和最终点之间以连续减小的接触角的接触传播可以用于最小化或消除例如气泡截留和起皱。膜框架最初可以相对于平坦生长区域以1°至75°之间的角度降低(例如，约1°和5°、约1°和10°、约1°和15°、约10°和15°、约15°和25°、约20°和30°、约25°和35°、约30°和40°、约35°和45°、约40°和50°、约45°和55°、约50°和60°、约55°和65°、约60°和70°、或约65°和75°之间)，例如在约1°和37.5°、约10°和40°、约15°和45°、约22.5°和67.5°、约40°和70°、约25°和75°、或约35°和75°、例如至少5°、10°、15°、20°、25°或30°之间，例如约22.5°、约30°、约45°、约60°或约67.5°之间。不对称设置的锁定特征(例如，设置在不同的高度处，或者具有不同的阻力)可以用于在将膜框架附接到盒基座期间引导膜框架(和膜)的接近角度。盒和/或膜框架可以包括特征(例如，成角度的槽、突出部、扣件、凸轮、闩锁、钩等，或附接或插入的不对称的装有弹簧的环)，其将膜定位成接触平坦生长区域，使得当膜框架被降低到盒基座上时，接触从第一点传播到最终的对跖点(例如，以约1°和75°之间的初始角度，例如，具有逐渐减小的角度)。装有弹簧的环(sprung ring)可以是由环状布置的多个弹簧支撑的环，其中多个弹簧中最高的弹簧与多个弹簧中最低的弹簧对跖，并且设置在它们之间的多个弹簧在高度上逐渐减小。
该方法可以进一步包括对膜进行成像以检测由保留的细胞形成的任何菌落。例如，通过检测某些微生物的自发荧光，包括只有几百个细胞的小菌落。成像还可以包括通过拍摄时间序列的图像来监测菌落的生长，对于这种情况，以基准标记为特征的本发明的实施例是特别适当的。盒可以有利地在Growth
Figure BDA0004110386600000151
自动化微生物检测系统(RapidMicro Biosystems)中成像。
其他实施例在权利要求中。

Claims (45)

1.一种过滤组件，包括：
a)漏斗；
b)包括多孔膜的膜框架；
c)包括膜支撑件和出口的基座；
其中，所述膜框架能够释放地附接到所述漏斗，并且所述基座能够释放地附接到所述漏斗；其中，在过滤期间，液体从所述漏斗通过所述膜和膜支撑件流到所述出口；并且其中，所述膜支撑件在过滤期间保持所述膜平坦。
2.根据权利要求1所述的过滤组件，其中，所述漏斗通过锁定机构附接到所述基座，当按压所述基座的外壁的一部分时，所述锁定机构释放。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的过滤组件，其中，所述多孔膜被超声结合或热熔到所述膜框架。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜框架通过所述漏斗上的凸起唇缘和所述膜框架中的凹部的互锁布置能够释放地附接到所述漏斗。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜框架包括突出环，所述突出环与盒基座上的突出部互锁。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜是黑色的和/或非荧光的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜包括黑色混合纤维素酯膜。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的过滤组件，其中，所述漏斗是透明的和/或包括体积标记。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的过滤组件，还包括覆盖通向所述漏斗的开口的漏斗盖。
10.根据权利要求9所述的过滤组件，其中，所述漏斗盖铰接在所述漏斗上。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜支撑件附接到所述过滤器基座。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的过滤组件，其中，所述过滤器基座包括多个支撑件，所述支撑件被构造成促进流体流到所述出口和/或支撑所述膜支撑件。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的过滤组件，其中，所述膜框架还包括基准标记。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的过滤组件，其中，所述过滤组件还包括垫圈。
15.根据权利要求14所述的过滤组件，其中，所述垫圈附接到所述膜支撑件和/或为薄膜。
16.根据权利要求14或15所述的过滤组件，其中，所述垫圈和膜支撑件是单个模制部分。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的过滤组件，其中，所述垫圈包括弹簧。
18.根据权利要求14或15所述的过滤组件，其中，所述垫圈和膜支撑件是单个模制部分。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的过滤组件，还包括位于所述膜和膜支撑件之间的空腔和/或垫片。
20.根据权利要求17所述的过滤组件，其中，所述膜支撑件和/或所述基座被成形为产生所述空腔。
21.一种盒，包括：
a)盒基座，包括：
i.基座层，其包括外壁、包括多个径向设置的间隙的第一内壁、以及包括外侧横档并限定凹孔的第二内壁，其中，所述第一内壁设置在所述外壁和所述第二内壁之间；
ii固体或半固体营养培养基，其设置在所述凹孔中并具有平坦生长区域，其中，所述生长区域高于所述第二内壁；和
b)能够可释放地密封到所述基座的盒盖。
22.根据权利要求21所述的盒，其中，所述盒盖是光学透明并且是非荧光的。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的盒，其中，所述盒基座是非荧光的。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的盒，还包括设置在第一内壁和外壁之间的第三内壁。
25.根据权利要求24所述的盒，还包括位于所述第三内壁和所述外壁之间的第四内壁。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的盒，其中，所述第二内壁包括朝向所述第一内壁径向突出的多个支撑件。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的盒，还包括垫圈。
28.根据权利要求27所述的盒，其中，所述垫圈附接到所述盒基座和/或为薄膜。
29.根据权利要求25或16所述的盒，其中，所述垫圈和盒基座是单个模制部分。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的盒，其中，所述垫圈包括弹簧。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的盒，其中，所述盒基座被设置成接收相对于所述平坦生长区域以1°至75°之间的角度降低到所述基座上的膜。
32.根据权利要求31所述的盒，其中，所述盒基座包括由环状布置的多个弹簧支撑的环，其中，所述多个弹簧中最高的弹簧与所述多个弹簧中最低的弹簧对跖，并且设置在它们之间的多个弹簧在高度上逐渐减小。
33.根据权利要求21-32中任一项所述的盒，进一步包括接合所述膜框架以导致所述膜和所述平坦生长区域之间的初始角度在1°和75°之间的特征。
34.一种用于过滤和培养细胞的系统，包括：
a)根据权利要求1-20中任一项所述的过滤组件；和
b)根据权利要求21-33中任一项所述的盒；
其中，所述膜框架被构造成与带有漏斗的过滤器基座分离，附接到盒基座，并且一旦附接到所述盒基座就从漏斗分离。
35.根据权利要求34所述的系统，其中，所述膜框架包括突出环，并且所述盒基座包括与所述突出环互锁的突出部。
36.根据权利要求34-35中任一项所述的系统，其中，将所述膜框架附接到所述盒基座将所述膜放置成与所述平坦生长区域共形接触。
37.一种用于确定微生物存在的方法，包括：
a)将根据权利要求1-20中任一项所述的过滤组件附接到真空源；
b)使样本流体流过所述过滤组件，其中，所述流体中的任何细胞被保留在所述膜上；
c)使附接到所述膜框架的漏斗从所述基座分离；
d)将所述膜框架附接到根据权利要求21-33中任一项所述的盒基座；
e)使所述漏斗从所述膜框架分离；和
f)孵育所述盒。
38.根据权利要求37所述的方法，还包括对所述膜进行成像，以检测由保留的细胞形成的任何菌落。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述过滤组件包括空腔，并且步骤(a)包括施加压力以使所述膜适形于所述空腔的形状。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，在使所述漏斗从所述基座分离之后，所述膜保持所述空腔的形状。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，成形的膜与所述盒相互作用，以防止在步骤(d)期间截留气泡。
42.根据权利要求37到41中任一所述的方法，其中，在步骤(d)期间，所述膜在其圆周上的第一点处与所述平坦生长区域进行第一次接触，且在与所述第一点对跖的所述圆周上的第二点处进行最终接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，在步骤(d)期间，所述膜框架最初相对于所述平坦生长区域以1°到75°之间的角度降低到所述基座上。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述盒包括与所述膜框架接合的特征，以在所述膜框架被降低到所述盒基座上时，将所述膜定位成相对于所述平坦生长区域以1°至75°之间的角度接触所述平坦生长区域。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述特征包括由环状布置的多个弹簧支撑的环，其中，所述多个弹簧中的最高弹簧与所述多个弹簧中的最低弹簧对跖，且设置在其间的多个弹簧在高度上逐渐减小。
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