CN116075311A - 人长期造血干细胞标志物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及：用于浓缩或分离造血干细胞的标志物以及利用该标志物的方法、通过所述标志物而分离或浓缩的细胞或细胞群、利用所述细胞或细胞群的方法、含有所述细胞或细胞群的药物、利用所述细胞或细胞群而得到的分类器。

Description

人长期造血干细胞标志物
技术领域
本公开涉及：用于浓缩或分离造血干细胞的标志物以及利用该标志物的方法、通过所述标志物而分离或浓缩的细胞或细胞群、利用所述细胞或细胞群的方法、含有所述细胞或细胞群的药物、利用所述细胞或细胞群而得到的分类器。
背景技术
已知干细胞、例如造血干细胞(HSC)具有自我复制能力和多向分化潜能这样的生物学功能。已知在具有自我复制能力和多向分化潜能的干细胞中，存在长期保持使这些干细胞具有特征的生物学功能的细胞和较短期间丧失该功能的干细胞(非专利文献1)。
长时间、例如在生物个体的一生中保持自我复制能力和多向分化潜能的干细胞，可以利用其自我复制能力进行大量培养，并且可利用其多向分化潜能而分化为各种细胞。认为具有这样的特性的干细胞是能够成为再生医疗实用化时的王牌的细胞。然而，这些干细胞都是生物体内中的存在量及其稀少的细胞，不能容易地从生物体中鉴定、分离。
造血干细胞(Hematopoietic stem cell：HSC)主要存在于骨髓内，被定义为具有自我复制能力和多向分化潜能的血液细胞，用于造血干细胞移植等。如果能够适当地对长期保持干细胞的性质的长期造血干细胞等品质优良的造血干细胞进行分离，则认为可在体外大量增殖该造血干细胞，但能够在人中适当分离长期造血干细胞(long-term HSC：LT-HSC)的特异性标志物尚不清楚。
以往，已经尝试鉴定在造血干细胞的细胞表面特异性表达的分子，并通过这些分子的组合来鉴定具有确定特性的造血干细胞。然而，在这样的方法中，需要通过尝试错误来发现用于鉴定具有确定特性的造血干细胞的“最适合的单克隆抗体的组合”，需要非常熟练的技术。并且，由于要检测的单克隆抗体的组合较多等，一般这样的开发方法需要庞大的时间和费用。实际上，自1988年发现小鼠造血干细胞(HSC)以来，在具有造血干细胞特性的细胞中，特别是在小鼠个体的一生中发现并鉴定具有保持自我复制能力和多向分化潜能的特征的长期造血干细胞需要30年的时间(非专利文献2)。另一方面，提出了在小鼠和人中，在造血干细胞表面特异性表达的分子标志物不同，希望找到能够浓缩、鉴定人的长期造血干细胞的标志物。
迄今为止，为了鉴定、分离长期造血干细胞，已经尝试探索在长期造血干细胞表面特异性表达的分子的组合。据报道，例如，为了从CD34阳性的造血干细胞群进一步浓缩造血干细胞，提出了从脐带血中的CD34阳性、CD38阴性、CD45RA阴性部分中分离Thy1阳性的部分，但该部分也依然在保持造血干细胞的特性的能力方面含有各种不同的细胞(非专利文献3)。为了探索这种细胞表面分子的组合，通常需要进行伴随用于进行细胞功能检测的大量操作的尝试错误(非专利文献4)。因此，需要确定用于确定长期造血干细胞的新的细胞表面分子的组合。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：日本输血细胞治疗学会志，2006年，Vol.52，No.5，pp.583-588
非专利文献2：nature，2016年，Vol.530，pp.223-227
非专利文献3：Science，2011年，Vol.333，pp.218-221
非专利文献4：Cell Stem Cell，2007年，Vol.1，pp.635-645
发明内容
发明所解决的技术问题
本公开的技术问题在于：提供用于浓缩或分离造血干细胞的标志物以及其用途。
解决问题的技术手段
在一个方式中，本公开提供长期造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，其包含：选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
在一个方式中，本公开提供分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群，其由以下表达形式确定，所述表达形式为选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
在一个方式中，本公开提供分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达形式作为指标对细胞进行分离或浓缩的工序。
在另一个方式中，本公开提供对所述细胞群中的造血干细胞的含量和/或含量的变化进行评价的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
对各细胞中的各细胞的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量进行测定的工序。
在另一个方式中，本公开提供含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将所述含造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，检测所述细胞群的品质的工序。
在另一个方式中，本公开提供含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将所述含造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，检测所述细胞群的移植适合性的工序。
在另一个方式中，本公开提供检测含造血干细胞的细胞群的方法，其中，为了进行受试者的疾病预后预测或健康情况预想，所述方法包含：
取得包含患者来源的造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量的工序；和
将所述标志物的表达量与对照进行比较的工序。
在另一个方式中，本公开提供对造血干细胞的特性进行修饰的化合物的筛选方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过候补化合物对含造血干细胞的细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
在另一个方式中，本公开提供对造血干细胞的特性进行修饰的培养条件的调节方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过经过调节的培养条件而培养含造血干细胞的细胞群的工序；和
将通过经过调节的培养条件而培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养条件的调节方法的工序。
在另一个方式中，本公开提供分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将选自所述细胞群中包含的细胞表达的CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Si glec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达量作为指标，以修饰造血干细胞的特性的方式调节培养条件的工序。
在另一个方式中，本公开提供制造对造血干细胞的特性进行修饰的培养培养基或培养辅助添加物的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过具有评价对象的构成的培养基或包含评价对象的培养辅助添加物的培养基对含造血干细胞的细胞群进行培养的工序；和
将培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养培养基或培养辅助添加物的构成的工序；和
制造具有上述决定的构成的培养培养基或培养辅助添加物的工序。
在另一个方式中，本公开提供诱导造血干细胞的化合物的筛选方法，其包含：
准备细胞群的工序；
通过受试化合物对细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
在另一个方式中，本公开提供用于鉴定、检测、分离或浓缩造血干细胞的组合物或试剂盒，其包含：对选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量进行定量或检测的试剂。
在另一个方式中，本公开提供制造经过修饰的造血干细胞的方法，其中，通过修饰本公开的造血干细胞，来制造经过修饰的造血干细胞。
在另一个方式中，本公开提供通过施用造血干细胞来预防或治疗待改善或预防的疾病或障碍的药物，其含有：
分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群或对它们进行修饰而得到的细胞。
在另一个方式中，本公开提供对受试物质的生理作用进行评价的方法，其包含：使分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群或对它们进行修饰而得到的细胞与受试物质接触的工序。
在另一个方式中，本公开提供通过分析分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合来鉴定造血干细胞并制造含有该造血干细胞的细胞群的方法。
在另一个方式中，本公开提供制造通过分析分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合来鉴定造血干细胞的分类器的方法。
在另一个方式中，本公开提供用于通过施用造血干细胞来预防或治疗待改善或预防的疾病或障碍的药物，其包含：将选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物分子的表达形式作为指标而制造的细胞。
本发明在一个方式中，提供以下项目。
[项目1]
一种造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，其包含：
选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
[项目2]
根据项目1所述的造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，其包含：
选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上。
[项目3]
一种分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群，其由以下表达形式确定，所述表达形式为选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
[项目4]
根据项目3所述的分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群，其由选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的表达形式确定。
[项目5]
一种分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达形式作为指标对细胞进行分离或浓缩的工序。
[项目6]
根据项目5所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其将选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的表达形式作为指标。
[项目7]
由项目1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或项目3或4所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群或通过项目5或6中任一项所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群，其进一步包含修饰。
[项目8]
一种对细胞群中的造血干细胞的含量和/或含量的变化进行评价的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
对各细胞中的各细胞的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量进行测定的工序。
[项目9]
一种含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将所述含造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD48、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，检测所述细胞群的品质的工序。
[项目10]
根据项目9所述的检测方法，其中，
所述品质是造血能力保持能力、移植适合性或保存稳定性。
[项目11]
一种含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
取得包含源自受试者的造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量的工序；和
将所述标志物的表达量与对照进行比较，以进行受试者的疾病预后预测或健康情况预想的工序。
[项目12]
一种对造血干细胞的特性进行修饰的化合物的筛选方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过候补化合物对含造血干细胞的细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
[项目13]
一种对造血干细胞的特性进行修饰的培养条件的调节方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过经过调节的培养条件而培养含造血干细胞的细胞群的工序；和
将通过经过调节的培养条件而培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养条件的工序。
[项目14]
一种制造对造血干细胞的特性进行修饰的培养培养基或培养辅助添加物的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过具有评价对象的构成的培养基或包含评价对象的培养辅助添加物的培养基对含造血干细胞的细胞群进行培养的工序；
将培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养培养基或培养辅助添加物的构成的工序；和
制造具有上述决定的构成的培养培养基或培养辅助添加物的工序。
[项目15]
根据项目5～14中任一项所述的方法，其中，
所述含造血干细胞的细胞群为从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。
[项目16]
一种通过项目5～7中任一项所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群，其中，
所述含造血干细胞的细胞群为从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。
[项目17]
一种诱导造血干细胞的化合物的筛选方法，其包含：
准备细胞群的工序；
通过受试化合物对细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
[项目18]
一种用于鉴定、检测、分离或浓缩造血干细胞的组合物或试剂盒，其包含：
对选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达量进行定量或检测的试剂。
[项目19]
一种对通过分析由权利要求1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或项目3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过项目5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合进行确定的方法。
[项目20]
一种制造对造血干细胞进行鉴定的分类器的方法，其中，
将通过分析由权利要求1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或项目3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过项目5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合作为指标。
[项目21]
一种用于通过施用造血干细胞来预防或治疗待改善或预防的疾病或障碍的药物，其包含：
由权利要求1或2中任一项所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或项目3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过项目5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群。
[项目22]
根据项目21所述的药物，其中，
通过施用造血干细胞来改善或预防的疾病或障碍为异染性脑白质营养不良(MLD)、戈谢病、法布瑞氏病、粘多糖症、HIV、ADA-SCID、X-SCID或地中海贫血。
[项目23]
根据项目21所述的药物，其中，
通过施用造血干细胞来改善或预防的疾病或障碍为慢性肉芽肿病(CGD)或肾上腺脑白质营养不良(ALD)。
发明的效果
本公开具有提供用于浓缩或分离造血干细胞的标志物及其用途的效果。
附图说明
[图1]图1是将由将脐带血样品进行细胞染色而得的数据生成的、在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构可视化而得到的图像。
[图2]图2是在由将脐带血样品进行细胞染色而得的数据生成的、在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构中，将各细胞的CD34的表达量可视化而得到的图像。
[图3]图3是表示比较从脐带血得到的CD34(+)细胞和CD34(-)细胞的移植试验中的嵌合率的结果的图。
[图4]图4是表示在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构中，更详细地配置CD34(+)部分的细胞配置的结果的图像。
[图5]图5是表示由CD34(+)和CD38(-/+)确定的脐带血部分的造血干细胞的增殖·分化能力的图。表示包含CD34(+)和CD38(+)的部分(P6)、包含CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(-)和CD90(+)的部分(P7)、包含CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(-)和CD90(-)的部分(P8)以及包含CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(+)和CD90(-)的部分(P9)的CFU测定结果。
[图6]图6是表示1个细胞水平的CFU测定的概要的图。
[图7]图7是表示在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构上，将CD34阳性细胞分级作为对象，未分化细胞定位的方向的图。
[图8]图8是表示在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构上，探索沿分化方向表达分布不均匀的分子标志物而得到的结果的一个实例的图。
[图9]图9是表示在由各标志物确定的细胞的CFU测定中，呈现CFU-GEMM的细胞的比例(与未分化细胞的浓缩程度相关)的图。
[图10]图10是表示以c-Kit(+)和CD34(+)对从脐带血中以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群设门(gating)(部分P1)，进一步以CD48(-)(P2部分)或CD48(+)(non-P2部分)设门时的FACS图表的一个实例的图。
[图11]图11是表示以c-Kit(+)和CD34(+)对从骨髓中以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群设门(部分P1)，进一步以CD48(-)(P2部分)或CD48(+)(non-P2部分)设门时的FACS图表的一个实例的图。
[图12]图12是表示以c-Kit(+)和CD34(+)对从动员外周血中以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群设门(部分P1)，进一步以CD48(-)(P2部分)或CD48(+)(non-P2部分)设门时的FACS图表的一个实例的图。
[图13]图13是表示将每1ml脐带血中包含的CD34阳性细胞数与P2部分的细胞数进行比较的结果的图。
[图14]图14是表示通过CFU测定对从脐带血中分离的、以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)确定的细胞部分(P2)与以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(+)确定的细胞部分(non-P2)的造血干细胞的增殖·分化能力进行比较的结果的图。
[图15]图15是表示通过移植试验对从脐带血中分离的细胞部分P2与细胞部分non-P2的未分化性进行比较的结果的图。
[图16]图16是表示通过CFU测定对从骨髓中分离的、以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)确定的细胞部分(P2)与以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(+)确定的细胞部分(non-P2)的造血干细胞的增殖·分化能力进行比较的结果的图。同时显示作为以c-Kit(+)、CD34(+)确定的部分的P1部分的结果。
[图17]图17是表示通过CFU测定对从动员外周血中分离的、以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)确定的细胞部分(P2)与以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(+)确定的细胞部分(non-P2)的造血干细胞的增殖·分化能力进行比较的结果的图。同时显示作为以c-Kit(+)、CD34(+)确定的部分的P1部分的结果。
[图18]图18是表示对于脐带血样品将CD34(+)部分分级为c-Kit(+)部分和c-Kit(-)部分，分别通过CFU测定对造血干细胞的增殖·分化能力进行比较的结果的图。同时显示CD34(+)部分整体的结果。
[图19]图19是表示追加性的标志物的浓缩倍率的图。浓缩倍率超过10的数据表示为10。
[图20]图20是表示在添加或不添加UM171的条件下培养P2部分的细胞，检测7天后的总细胞数和未分化细胞(P1)的比率的结果的图。
[图21]图21是表示在添加或不添加UM171的条件下培养non-P2部分的细胞，检测7天后的总细胞数和未分化细胞(P1)的比率的结果的图。
[图22]图22是表示将从脐带血样品中以c-Kit(+)、CD34(+)和CD48(-)的标志物组分级的P2部分的细胞培养7天后，使用c-Kit(+)、CD34(+)和CD48(-)的标志物组将培养后的细胞群分级为P2部分(培养后)和non-P2部分(培养后)，分别进行了CFU测定的结果。
具体实施方式
以下，对本公开的实施方式进行说明。以下的说明只是一个示例，本公开的范围不受这些说明的约束，可以在不障碍本公开主旨的范围内适当变更并实施。
(定义)
本公开中，当显示多个数值的范围时，由这些范围的任意下限值和上限值的组合构成的范围也具有同样意义。
本公开中，“分化”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指具有低特化程度的细胞变为更特化的细胞、例如神经细胞或肌肉细胞等的过程。“分化的”或“进行了分化”是相对性的术语，“分化的细胞”或“分化细胞”比其所比较的细胞在发生路径上更先进、更特化。
本公开中，“干细胞”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指在单个细胞水平上具有自我复制能力，并且具有产生两种或更多种不同分化细胞的能力的未分化细胞。即，干细胞可以不对称地分裂，其中一个子细胞保持干细胞状态，另一个子细胞表达某些不同的其他确定生物学功能和表型。或者，干细胞可以对称地分裂成两个干细胞，因此，在具有干细胞的细胞群中保持一些干细胞，而群中的其他细胞只产生分化而得的后代。
本公开中，“造血干细胞”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指能够最终分化为所有血细胞(红细胞、白细胞和血小板等)的具有多向分化潜能的细胞。造血干细胞可以包含向祖细胞或母细胞分化的中间阶段。“祖细胞”或“母细胞”在本公开中可互换使用，是指具有降低的分化能力，但仍具有成熟为确定谱系(例如骨髓系统或淋巴系统)的不同细胞的能力的成熟中的细胞。
本公开中，“长期造血干细胞”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指即使经过细胞分裂也能长期保持自我复制能力的造血干细胞。由长期造血干细胞通过细胞分裂产生的两个子细胞中的至少一个保持与分裂前的细胞相同的造血干细胞的性状。在一个方式中，长期造血干细胞在生物体内的通常的培养环境或生物体外的培养环境中完全不因细胞分裂而丧失自我复制能力。另外，在一个方式中，长期造血干细胞即使经过100次、50次、20次或10次细胞分裂，也保持自我复制能力。
可以通过各种公知的方法确认该自我复制能力被保持。例如，可通过测定培养一定期间后的细胞群中所含的未分化细胞群的含有率，确认保持了自我复制能力。未分化细胞群可以通过例如在细胞表面表达的公知标志物的阳性·阴性的组合来鉴定。此外，在一个方式中，造血干细胞即使经过细胞分裂也能长期保持自我复制能力，这也可以通过长期保持骨髓重建能力来确认。例如，长期造血干细胞在公知的移植方法中在初次移植受体中保持骨髓重建，并且在特别优选的方式中也可以在二次移植中重建骨髓。仅在短时间内保持自我复制能力的造血干细胞，在体外或初次移植中可以重建骨髓，但在初次移植受体中不能保持骨髓重建，在二次移植中不能保持骨髓重建。此处，二次移植是指将通过初次移植重建的骨髓来源的造血干细胞进一步移植到另一个体。在一个方式中，造血干细胞即使经过细胞分裂也能长期保持自我复制能力，这通过以下方式确认：在将该细胞移植到另一生物体的情况下，连续4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天以上产生血液，通常，在上述期间内，产生500、600、700、800、900或1000个/μL(mm3)以上作为白细胞的一种的嗜中性粒细胞。
本公开的造血干细胞或长期造血干细胞包含来自各种动物的造血干细胞或长期造血干细胞。例如，可以在本公开中使用各种哺乳动物、属于灵长类的动物、属于灵长目的动物或人来源的造血干细胞或长期造血干细胞，或者本公开可以应用于这些细胞。此外，本公开的造血干细胞除了可以从生物体得到的体细胞群中分离之外，还可以从ES细胞或由人工多能干细胞分化诱导的细胞群中分离。
本公开中，“分离得到的细胞”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指从原始发现的生物中取出的细胞或这样的细胞的后代。这样的细胞可以是在体外、例如其他细胞的存在下培养的细胞。此外，这样的细胞或作为其后代的细胞之后也可以导入到第二生物中。
本公开中，“分离得到的细胞群”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，是指从异质细胞群中取出并分离的细胞群。在一些方式中，与分离或浓缩细胞的原始异质细胞群相比，分离得到的群可以是实质上纯的细胞群，并且可以仍然是异质的细胞群。
细胞群对于确定的细胞种是“实质上纯的”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，在该细胞群中，是指相对于构成细胞群整体的细胞，至少约50％，更优选至少约60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％，最优选为至少约95％、96％、97％、98％、99％的细胞由该确定的细胞种的细胞构成。例如，“实质上纯的”干细胞群是指，包含低于约50％，更优选低于约40％、30％、20％、15％、10％、8％、7％，最优选低于约5％、4％、3％、2％或1％的不是干细胞的细胞的细胞群。因此，例如，本公开中的分离得到的造血干细胞可以是包含至少约50％，更优选至少约60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％，最优选至少约95％、96％、97％、98％、99％的由本公开确定的标志物鉴定的细胞的细胞群。
本公开中，“浓缩”或“富集”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，在含有多个生物、细胞、物质、数据的群中，使具有作为目标的确定性质的生物、细胞、物质、数据等的含有比例增加。例如，用于浓缩长期造血干细胞的标志物是指，当包含长期造血干细胞的细胞群被该标志物分级为两个部分时，长期造血干细胞偏向于任一部分而存在。
本公开中，“鉴定”、“选出”、“分离”、“纯化”或“筛选”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，用确定的操作/评价方法从包含多个的群中选出具有作为目标的确定性质的生物、细胞、物质、数据等靶标。选出的靶标可以从群中物理分离，也可以不分离。例如，用于分离长期造血干细胞的标志物是指，通过该标志物将包含长期造血干细胞的细胞群分级为两个部分时，长期造血干细胞偏向任一部分一定程度以上而存在，其他部分中存在的长期造血干细胞在一定程度以下。例如，当包含长期造血干细胞的细胞群被分级为部分A和B时，部分A中存在的长期造血干细胞/(部分A中存在的长期造血干细胞+部分B中存在的长期造血干细胞)×2的值为1.4、1.5、1.6、1.7或1.8以上。
本公开中，长期造血干细胞的“促进增殖”具有在本领域中通常使用的意义，典型性而言，意味着：长期造血干细胞缩短了细胞分裂所需的时间；使长期造血干细胞的细胞数增加；或者在含有长期造血干细胞和其他细胞的细胞组合物中，抑制增殖所伴随的长期造血干细胞的含有比例降低、或保持或增加该含有比例。
1.本公开的造血干细胞标志物
一般来说，就生物体的各种细胞而言，在由各基因表达的蛋白质的细胞内含量、暴露于细胞表面的蛋白质的种类、蛋白质翻译后修饰的状态、细胞形态等各种物理特性中具有固有的状态，可通过这些物理特性的组合，来确定具有固有的生物学功能的细胞。这些物理特性可以通过各种公知的方法基于一定的标准进行定量化，因此具有一定生物学功能的各种细胞可以通过其定量物理特性的数值数据的组合来确定。此外，通过组合该定量物理特性数据的组合和从生物学特性分析中获得的数值数据，可以更详细地确定细胞。
另一方面，据了解，细胞分化具有层次性，并且在细胞分化层次中关系越密切的细胞在其定量物理特性数据中越相似。
因此，通过基于从定量物理特性的数值数据和/或生物学特性的数值数据中选择的多个数值数据的相似性来生成细胞配置空间结构，可以得到在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构。并且，通过利用已知的分化标志物等，可以确定该细胞配置空间结构上的分化方向。
另一方面，在这样构成的细胞配置空间结构中，通过利用已知的分化标志物等对确定分化阶段的细胞存在的区域进行确定，得到用于确定该分化阶段的细胞的物理特性的数值数据和/或生物学确定的数值数据的范围的组合。
本公开的发明人等通过使用利用了该构成的细胞配置空间结构的分析并结合在一个细胞水平上的细胞功能分析，成功地极其迅速且高精度地确定标志物分子的组合，所述标志物分子确定具有更未分化的细胞特性的长期造血干细胞。
具有本公开的更未分化的细胞特性的长期造血干细胞可以根据所需的精度使用所述标志物进行各种浓缩或分离。在一个例子中，具有本公开的更未分化的细胞特性的长期造血干细胞可以通过单个标志物分子的表达量来浓缩或分离，并且在另一个例子中，可以通过多个标志物分子的表达量的组合来浓缩或分离。本公开中，当通过确定标志物分子的表达量来对细胞进行分级时，有时将表达量为一定以下的部分称为该标志物分子的表达为“阴性”的部分，将表达量为一定以上的部分称为该标志物分子的表达为“阳性”的部分。区分“阴性”“阳性”的阈值通常由本领域技术人员根据所使用的设备、工作目的等决定。在一个方式中，可以基于更详细的表达量差异来对细胞进行分级，例如，“阳性”部分可以进一步区分为：在标志物分子的表达量中，将表达量较少的部分作为“弱阳性”的部分，将表达量较少的部分作为“强阳性”的部分。基于单个标志物分子的表达量被分类为“阴性”、“阳性”、“弱阳性”、“强阳性”或更详细的范围，或者基于多个标志物分子的分类的组合而对长期造血干细胞进行浓缩或分离。
在一个方式中，本公开的具有更未分化细胞特性的长期造血干细胞通过使用以下物质作为长期造血干细胞分离标志物或浓缩标志物而进行分离或浓缩，所述物质为选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
此外，另一方式中，本公开的具有更未分化的细胞特性的长期造血干细胞通过使用选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上作为长期造血干细胞分离标志物来进行分离。特别是，通过使用CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合作为长期造血干细胞分离标志物，能够以极高的纯度分离长期造血干细胞。
此外，另一方式中，本公开的具有更未分化的细胞特性的长期造血干细胞，除了上述基因表达形式的组合，还可通过组合选自CD84(+)、CD111(+)、CD150(-)、GPR56(-)、Notch-1(-)、CD52(-)、CD62L(+)、CD71(+)、CD93(-)、CD122(-)、CD133(-)、CD275(-)、CD131(-)、CD326(+)、CD200(-)、CD200R(-)、CD324(+)、CD40(-)、CD11c(-)、CD318(-)中的一种以上，来以更高的纯度浓缩长期造血干细胞。
优选地，追加并组合的基因表达形式选自CD111(+)、CD133(-)、CD131(-)、CD93(-)、CD122(-)、CD200(-)、CD324(+)。更优选地，追加并组合的基因表达形式选自CD111(+)、CD133(-)、CD131(-)。
当使用用于分离本公开的长期造血干细胞的标志物或用于浓缩本公开的长期造血干细胞的标志物时，可以从预处理对象的细胞群中排除分化的细胞。为了排除该分化的细胞，可以使用对分化的细胞进行特异性鉴定的标志物，通常称为Lineage标志物。例如，可以使用CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a的组合作为Lineage标志物，但不限于此。
作为所述标志物分子的检测对象，可以使用编码该标志物分子的基因的各种产物。在一个方式中，使用在细胞表面表达的标志物分子作为检测对象。作为其他非限制性的例子，可以使用从基因转录的mRNA或其前体，由该mRNA翻译的肽、蛋白质或它们的中间产物、片段、修饰物等。
用于确定本公开的造血干细胞的基因产物不限于上述具体描述的基因的基因产物。为了进一步分类本公开的造血干细胞，可以使用一种以上的追加的基因产物的表达或不表达作为指标。此外，上述基因组合的一部分可以由其他基因代替。这样的基因可以从功能上或统计上与上述基因组合中包含的基因的表达模式相似的基因中选择。如后所述，也可通过分析本公开的造血干细胞中的基因表达状态，来确定上位追加或代替的基因。
在一个方式中，本公开提供选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的、作为长期造血干细胞分离标志物或浓缩标志物的使用。在一个方式中，本公开提供选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的、作为长期造血干细胞分离标志物或浓缩标志物的使用。
此外，另一方式中，除了上述基因表达形式的组合之外，还可以通过组合选自CD84(+)、CD111(+)、CD150(-)、GPR56(-)、Notch-1(-)、CD52(-)、CD62L(+)、CD71(+)、CD93(-)、CD122(-)、CD133(-)、CD275(-)、CD131(-)、CD326(+)、CD200(-)、CD200R(-)、CD324(+)、CD40(-)、CD11c(-)、CD318(-)中的一种以上作为长期造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，而以更高的纯度浓缩长期造血干细胞。
优选地，追加并组合的基因表达形式选自CD111(+)、CD133(-)、CD131(-)、CD93(-)、CD122(-)、CD200(-)、CD324(+)。更优选地，追加并组合的基因表达形式选自CD111(+)、CD133(-)、CD131(-)。
2.本公开的长期造血干细胞
本公开还提供，具有更未分化的细胞特性的、分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群。一方式中，这样的造血干细胞或细胞群由选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1、2、3、4或5种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达形式确定。一方式中，这样的造血干细胞或细胞群由选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的表达形式确定。典型性而言，该细胞或细胞群表达或不表达作为细胞表面蛋白质的所述分子。作为其他非限定性的实例，该细胞或细胞群表达所述分子作为由基因转录的mRNA或其前体，由该mRNA翻译的肽、蛋白质或这些的中间产物、片段、修饰物等。
3.制造分离或浓缩得到的长期造血干细胞或包含长期造血干细胞的细胞群的方 法
本公开提供，基于分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达形式，制造分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的方法。
一个实例中，所述方法可以基于本公开中发现的确定长期造血干细胞的标志物分子的细胞表面表达，通过使与流式细胞仪(Flowcytometer)连接的细胞分选仪运作而实施，但不限于此。
4.评价长期造血干细胞的含量和/或含量的变化的方法
本公开提供：对于含有长期造血干细胞的细胞组合物，将本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，评价长期造血干细胞的含量和/或含量的变化的方法。典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，对于该细胞群中包含的细胞，测定分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量，将该表达量与对象样品中的标志物分子的表达量比较、或与所述含有长期造血干细胞的细胞组合物的另一时间点中的标志物分子的表达量进行比较，从而评价长期造血干细胞的含量和/或含量的变化。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
该标志物分子的表达量可使用本领域技术人员公知的方法进行，例如可使用流式细胞仪、抗体panel等进行，不限于这些。
5.检测或评价含造血干细胞的组合物的性质的方法
本公开提供：对于含有长期造血干细胞的细胞组合物，将本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，检测或评价该细胞组合物的性质的方法。典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，对于该细胞群中包含的细胞，对分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量进行测定，将该表达量与对照样品中的标志物分子的表达量进行比较，从而检测或评价细胞组合物的性质。该对照样品可以是通过体内或体外检测而确认了作为含长期造血干细胞的细胞群的性质的样品，也可以是检测或评价对象的细胞群的另一时间点中的样品。
例如，该细胞组合物可以是用于造血干细胞移植的检查样本，例如脐带血、骨髓液、含有外周血的组合物，但不限于此。例如，在含有长期造血干细胞的细胞组合物中，对于细胞培养前后、一定期间保存前后的细胞组合物，以分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量为指标，在培养前后或保存前后的细胞群中，可以测试或评价作为长期造血干细胞的性质在多大程度上变化或没有变化。
在一个方式中，含造血干细胞的组合物的性质可以是根据一定基准评价的品质，例如可以评价造血能力保持能力、移植适合性或保存稳定性。例如，通过以分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量为指标，比较含有长期造血干细胞的受试移植用组合物与确认了对移植的适合性的标准组合物，而能够检测或评价受试移植用组合物的移植适合性。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞，可以是通过培养脐带血、骨髓细胞、外周血等而得到的细胞组合物，但不限于此。此外，对标志物分子表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
该标志物分子的表达量可以使用本领域技术人员公知的方法进行，例如可以使用流式细胞仪、抗体panel等进行，但不限于此。
6.检测含造血干细胞的组合物以进行受试者的疾病预后预想或健康情况预想的 方法
本公开提供：将本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，检测含造血干细胞的组合物以进行受试者的疾病预后预想或健康情况预想的方法。典型性而言，对于包含从患者或健康人取得的造血干细胞的细胞群中包含的细胞，或对于患者或健康人体内的含造血干细胞的细胞群中包含的细胞，对分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量进行测定，将该测定得到的表达量作为指标，预想受试者的疾病预后或将来的健康情况。例如，为了确认患者的预后预测或治疗效果，而从治疗前和治疗后的患者取得含造血干细胞的细胞群，检测长期造血干细胞的比例的增减，长期造血干细胞的比例增加时或减少得到抑制时，可以预测患者的良好的预后。另一方式中，通过同种异体移植含生物体来源的造血干细胞的组合物来进行治疗的情况下，为了进行患者的预后预想，也可以检测供体体内的含造血干细胞的细胞群、包含从供体中得到的造血干细胞的细胞群、移植前或移植后的患者体内的含造血干细胞的细胞群、或包含从患者得到的造血干细胞的细胞群。另一方式中，对于包含从患者或健康人取得的造血干细胞的细胞群中包含的细胞，可进行分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子的表达量检测以进行患者或健康人的健康状态、例如造血系统中的健康状态的掌握或将来的健康情况的预测。
作为所述包含长期造血干细胞的细胞群，可以使用骨髓组织、脐带血、外周血等任意含有长期造血干细胞的细胞群。对标志物分子表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
该标志物分子的表达量可以使用本领域技术人员公知的方法进行，例如可以使用流式细胞仪、抗体panel等进行，但不限于此。
7.修饰含有长期造血干细胞的细胞群的方法
本发明提供：修饰通过分离或浓缩长期造血干细胞的标志物而分离或浓缩得到的、分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的方法。该修饰包含：对进行了所述分离或浓缩的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群进行各种分化诱导。例如，可通过基于确定培养条件的培养、基于确定药剂或药剂的组合的处理、基因组编辑、基因导入、mRNA、反义寡核苷酸、适体等的细胞内导入、与其他细胞的融合等处理，可以修饰含有长期造血干细胞的细胞群，但不限于此。该培养条件包含：培养基的组成、培养基组成的变更、培养基中包含的确定添加物、添加物的添加方法、培养温度或其变更方式、培养湿度或其变更方式、大气压或其变更方式、培养容器的结构或原材料或其变更方式、培养支架的结构或原材料或其变更方式等，但不限于此。该药剂包含无机化合物、有机低分子化合物、高分子化合物、蛋白质、核酸，但不限于此。所述基因组编辑包含通过本领域技术人员公知的方法进行的基因组编辑，例如包含使用CRISPR-Cas系统、TALEN系统等的基因组编辑技术，但不限于此。含有长期造血干细胞的细胞群的修饰可以通过细胞表面表达的分子的种类或量的变化、细胞内转录的基因的种类或量的变化、细胞的基因组碱基序列的变化、或者这些所伴随的细胞形态、功能的变化等来确认，但不限于此。例如，与修饰前相比，在修饰后的细胞表面表达的任意分子或细胞内转录的基因的种类或量相差0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％以上的情况下，可将该细胞定为进行了修饰的细胞。另外，该基因导入包含本领域技术人员公知的方法，包含使用病毒载体的基因导入技术、使用电穿孔法的基因导入法等，但不限于此。另外，与其他细胞的融合也包含通过本领域技术人员公知的方法进行的，融合的细胞可以使用从人或灵长类体细胞、ES细胞、人工多能干细胞或Muse细胞等体细胞群中以确定方法分离得到的多能干细胞等，但不限于此。该进行了修饰的细胞群除了可以作为研究细胞分化机制等的样品使用之外，还可以根据其特性用于各种用途。在一个例子中，从患者的活体组织中分离或浓缩长期造血干细胞，通过基因组编辑或基于载体的基因导入等，对该细胞进行基因的导入或缺失、表达量的调节等修饰后，作为功能被修饰的长期造血干细胞返回患者体内，从而可以用于疾病治疗等。此外，在另一个例子中，通过本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物而鉴定生物体内存在的长期造血干细胞，通过基因组编辑、基因导入对该细胞进行生物体内基因的导入或缺失、表达量的调节等修饰，从而产生功能添加或改变的长期造血干细胞，提供基于此的疾病治疗或健康保持、增进方法等。在一个方式中，这些细胞的修饰可以是永久性的，也可以是暂时性的。例如，可以在体内的确定部位，仅对确定期间的细胞进行修饰。
8.分析含有长期造血干细胞的细胞群的方法
本发明提供：分析通过分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分离或浓缩得到的含长期造血干细胞的细胞群，并获得与该细胞群的物理、化学或生物学特征有关的信息的方法。分离或浓缩得到的造血干细胞或造血干细的物理特征、化学特征、生物学特征可以通过使用本领域技术人员公知的方法来评价、分析。获得的信息可以用于例如基于物理特征、化学特征、生物学特征或它们的组合来确定含长期造血干细胞的细胞群的方法。
9.基于长期造血干细胞的物理特征、化学特征、生物学特征，制成造血干细胞或用 于分离或浓缩造血干细胞的分类器的方法
在一个例子中，所述物理特征、化学特征、生物学特征可以用作开发分离或浓缩造血干细胞的方法的阳性对照。例如，仅基于细胞的生物学特征、例如对确定化学物质的增殖应答等特征来分离或浓缩造血干细胞时，可通过比较通过该方法分离或浓缩得到的细胞或细胞群的物理特征、化学特征、生物学特征与利用本公开的标志物而得到的造血干细胞的物理特征、化学特征、生物学特征，来评价或表征基于该生物学特征的分离或浓缩造血干细胞的方法。通过这样的评价、表征，在一个方式中，提供一种将利用本公开的标志物而得到的造血干细胞的物理特征、化学特征、生物学特征作为指标来鉴定造血干细胞，并制造含有造血干细胞的细胞群的方法。
10.基于长期造血干细胞的物理特征、化学特征、生物学特征，制成造血干细胞或 用于分离或浓缩造血干细胞的分类器的方法
在一个例子中，所述物理特征、化学特征、生物学特征被用于制成造血干细胞或用于分离或浓缩造血干细胞的分类器。例如，当分类器由机器学习构成时，本公开的分离或浓缩得到的造血干细胞或从造血干细胞获得的物理特征、化学特征、生物学特征或它们的组合或其一部分可以用作机器学习的教师数据(teaching data)。
11.使用长期造血干细胞评价受试物质或环境要因对造血干细胞的生理作用的方 法
本发明提供：使用分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群或对其进行修饰而得到的各种细胞来评价化合物和药剂等受试物质或温度和营养条件等环境要因对造血干细胞的生理作用的方法。
在该方法中，通过公知的方法使本公开的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群或对其进行修饰而得到的各种细胞与化合物、药剂等受试物质接触，或者，对温度和营养条件等环境要因给细胞带来的生理作用、例如细胞功能的变化、增殖状态的变化、对生存的影响等进行评价。
12.评价培养条件对长期造血干细胞的增殖的影响的方法
本公开提供：以本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标来评价培养条件对长期造血干细胞的增殖的影响的方法。本公开的评价方法中，典型性而言，包含准备含造血干细胞的细胞群，根据评价对象的培养条件培养含造血干细胞的细胞群，检测培养后的细胞群中的本公开的确定长期造血干细胞的标志物分子的表达量的工序，并且对评价对象的培养条件中的培养前后的所述标志物分子的表达量进行比较，或者对评价对象的培养条件中的培养后的所述标志物分子的表达量与对照的培养条件中的培养后的所述标志物分子的表达量进行比较。比较的结果，在促进长期造血干细胞的增殖的情况下，将该评价对象培养条件作为促进长期造血干细胞的增殖的培养条件进行评价，在培养条件变更后长期造血干细胞的增殖得到抑制的情况下，将该评价对象培养条件作为抑制长期造血干细胞的增殖的培养条件进行评价。
评价长期造血干细胞是否被特异性修饰的方法没有限制，本领域技术人员可以使用公知的方法。例如，当获得以下结果时，长期造血干细胞被评价为进行了特异性修饰，上述结果为：缩短或延长了由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子确定的长期造血干细胞进行细胞分裂所需的时间；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的细胞数增加；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的含有比例减少、保持或增加等。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
作为构成细胞培养条件的因子，可以将本领域中通常考虑的因子作为评价对象，例如可以通过改变培养基成分、温度、湿度、空气构成、培养基质等进行检测，但不限于此。
13.对长期造血干细胞的特性进行修饰的化合物的筛选方法
本公开提供将分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，筛选对长期造血干细胞的特性进行修饰的化合物的方法。本公开的筛选方法中，典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，将通过候补化合物进行了处理的细胞或细胞群与未处理的细胞或细胞群进行比较，取得对由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子确定的长期造血干细胞的特性进行修饰的化合物。例如，可取得：缩短或延长长期造血干细胞进行细胞分裂所需时间的化合物、增加长期造血干细胞的细胞数的化合物、在含有长期造血干细胞的细胞组合物中使长期造血干细胞的含有比例减少、保持或增加的化合物、延长或缩短长期造血干细胞的生存期的化合物、抑制或促进长期造血干细胞细胞死亡的化合物、促进或抑制长期造血干细胞的修饰(基因导入、基因组编辑、药剂处理效率等)的化合物、使长期造血干细胞向确定细胞种分化的化合物、抑制向确定细胞种的分化的化合物、抑制或促进长期造血干细胞的分化的化合物、抑制向确定细胞种的分化的化合物等。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
14.诱导长期造血干细胞的化合物的筛选方法
本公开提供：将分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，来筛选诱导长期造血干细胞的化合物的方法。本公开的筛选方法中，典型性而言，准备长期造血干细胞以外的细胞，通过候补化合物处理所述细胞或细胞群，将处理后的细胞或细胞群中的、分离或浓缩长期造血干细胞的标志物作为指标，取得诱导长期造血干细胞的化合物。作为长期造血干细胞以外的细胞没有特别限定，例如可以使用生物来源的细胞、人工获得了多能性的细胞、受到基因导入等修饰的细胞等。例如，可以使用ES细胞、iPS细胞等人工获得了多能性的细胞等，但不限于此。
对所述标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
15.对长期造血干细胞的特性进行修饰的培养培养基
本公开提供：将分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标而特异性地修饰长期造血干细胞的特性的培养培养基或培养辅助添加物的制造方法和通过该方法制造的培养培养基或培养辅助添加物。典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，通过具有评价对象的构成的培养基或包含评价对象的培养辅助添加物的培养基，培养含造血干细胞的细胞群，以本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标，对培养条件变更前后的细胞的增殖状态进行评价，决定特异性地修饰长期造血干细胞的特性的培养培养基或培养辅助添加物的构成，制造具有该构成的培养培养基或培养辅助添加物。培养培养基和培养辅助添加物例如构成为固体或液体组合物。培养培养基还可以在其构成中包含确定的物理性结构、例如形状、原材料、容量等。
评价长期造血干细胞特性是否被特异性修饰的方法没有限制，本领域技术人员可以使用公知的方法。例如，当获得以下结果时，评价为促进了长期造血干细胞的增殖，所述结果为缩短或延长由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子确定的长期造血干细胞进行细胞分裂所需的时间；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的细胞数增加；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的含有比例减少、保持或增加等。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
16.促进长期造血干细胞的增殖的培养方法
本公开提供：将本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子作为指标来调节促进长期造血干细胞的增殖的培养条件的方法。本公开的调节方法中，典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，通过进行了调节的培养条件培养含造血干细胞的细胞群，将所述标志物分子作为指标，评价培养条件变更前后的细胞的增殖状态，以促进长期造血干细胞的增殖的方式调节培养条件。
作为构成细胞的培养条件的因子，可以将本领域中通常考虑的因子作为评价对象。例如可将培养基成分、培养辅助添加物、温度、湿度、空气构成、培养基质的形状、原材料、表面处理、培养容器的容量、形状、原材料、表面处理、培养容器、培养基或施加于细胞本身的物理性刺激、这些的随时间推移的变更等作为因子进行评价，但不限于此。
评价长期造血干细胞的增殖是否被促进的方法没有限制，本领域技术人员可以使用公知的方法。例如，当获得以下的结果的情况下，评价为长期造血干细胞的增殖得到促进，所述结果为由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子确定的长期造血干细胞进行细胞分裂所需要的时间缩短；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的细胞数增加；含有长期造血干细胞的细胞组合物中由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的含有比例保持或增加等。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
17.利用经过调节的培养条件的、分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞 的细胞群的制造方法
本公开提供：包含将本公开的长期造血干细胞分离或浓缩标志物分子作为指标来调节培养条件的工序的、分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法。典型性而言，准备含造血干细胞的细胞群，通过预先以促进长期造血干细胞增殖的方式进行了调节的培养条件，例如，通过上述培养条件的调节方法以促进长期造血干细胞的增殖的方式进行了调节的培养条件，来培养含造血干细胞的细胞群，从而制造分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群。
另一方式中，涉及：培养分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群时，通过本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子监测细胞的增殖状态，以促进长期造血干细胞的增殖的方式调节培养条件，从而制造分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的方法。
评价长期造血干细胞的增殖是否被促进的方法没有限制，本领域技术人员可以使用公知的方法。例如，当获得以下结果的情况下，评价为长期造血干细胞的增殖得到促进，所述结果为由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子确定的长期造血干细胞进行细胞分裂所需的时间缩短；由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的细胞数增加；含有长期造血干细胞的细胞组合物中由本公开的标志物分子确定的长期造血干细胞的含有比例保持或增加等。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
作为构成细胞的培养条件的因子，可以将本领域中通常考虑的因子作为评价对象，例如可以通过改变培养基成分、温度、湿度、空气构成、培养基质等进行检测，但不限于此。在一个方式中，可以从生物体中采集的细胞群的培养开始时间点开始，以促进长期造血干细胞的增殖的方式调节培养条件，并且也可以在一定期间内，在长期造血干细胞的培养未被最优化的条件下进行培养后，调节培养条件，以使得在细胞数增加一定程度后促进长期造血干细胞的增殖。
此外，在另一个方式中，在培养一定期间后，使用细胞分选仪等公知的方法，以本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的分子标志物为指标选出细胞，并且如果需要，可以连续进行经过调节的培养条件的培养。培养条件的调节工序和细胞的选出工序可以分别组合多种不同的方法，并且可以重复应用相同或不同的方法。
18.鉴定对细胞赋予长期造血干细胞的特性的基因修饰的方法。
本公开提供以分离或浓缩长期造血干细胞的标志物作为指标，对细胞赋予长期造血干细胞的特性的基因修饰方法。典型性而言，对于进行检测的细胞的一部分，准备修饰了候补基因的基因修饰细胞，将所述基因修饰细胞中的本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物与未进行基因修饰的细胞中的本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物进行比较。此外，另一方式中，将相同细胞中的基因修饰前后的本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物进行比较。比较的结果，将对于本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物赋予了更阳性的结果的基因修饰鉴定为对细胞赋予长期造血干细胞的特性的基因修饰。
所述基因修饰可通过本领域技术人员公知的各种方法进行，可利用例如利用核酸或其他载体的永久性或暂时性的基因导入、基于基因组编辑的基因组上的基因或对基因表达进行控制的因子的缺失、添加、变异等。该变异包含构成基因或对基因表达进行控制的因子的碱基序列中的碱基的缺失、添加、替换等，但不限于此。
所述基因修饰的细胞可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物进行检测的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
19.用于鉴定、分离或浓缩长期造血干细胞的组合物或试剂盒
本公开提供：包含对鉴定、分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分子进行定量或检测的试剂的、用于鉴定、分离或浓缩长期造血干细胞的组合物或试剂盒。作为对标志物分子进行定量或检测的试剂，可使用该领域中通常使用的试剂，例如可使用由荧光色素标记的抗体、核酸、低分子化合物、高分子化合物等，但不限于此。本公开的用于鉴定、分离或浓缩长期造血干细胞的组合物或试剂盒除了包含可用于在从生物体中采集的细胞群中鉴定、分离或浓缩长期造血干细胞的组合物或试剂盒之外，还包含在生物体内用于鉴定长期造血干细胞的组合物或试剂盒。用于鉴定长期造血干细胞的组合物或试剂盒还可包含用于修饰长期造血干细胞的功能的药剂等，提供通过修饰长期造血干细胞的功能而治疗的疾病的治疗药或治疗方法。
20.包含长期造血干细胞或对其进行修饰而得到的细胞的药物
本公开提供：含有通过分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分离或浓缩得到的长期造血干细胞或对其进行修饰而得到的各种细胞的、用于通过施用于患者而治疗疾病的药物、疾病前期的先制医疗(Preemptive Medicine)中使用的药物或针对健康人的预防医疗或健康保持(改善)中使用的药物或使用该药物的治疗法或疗法。在使用本公开的长期造血干细胞或对其进行修饰而得到的各种细胞作为药物的情况下，可以将从患者来源的细胞群得到的长期造血干细胞或对其进行修饰而得到的各种细胞施用于该患者，也可以将从其他提供者来源的细胞群中得到的长期造血干细胞或对其进行修饰而得到的各种细胞施用于该患者。此外，可组合使用其他药剂或治疗方法。例如，可对具有造血障碍的患者施用以下长期造血干细胞作为用于治疗该障碍的药物，所述长期造血干细胞为通过本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物而从患者或提供者分离或浓缩得到的长期造血干细胞、或通过本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物而从含由人工多能化细胞诱导而成的造血干细胞的细胞群中分离或浓缩的长期造血干细胞，所述人工多能化细胞是由患者或提供者中得到的体细胞生成的人工多能化细胞。作为另一例，从含有从患者的生物体组织中经过人工多能化工序或不经过人工多能化工序而得到的造血干细胞的细胞群中，通过本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物而分离或浓缩长期造血干细胞，对该长期造血干细胞进行对治疗有益的基因导入、基因组编辑等修饰后，可作为用于治疗疾病的药物而对患者施用。
所述含造血干细胞的细胞群可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物分子的表达量进行测定的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
作为通过施用所述长期造血干细胞来改善或预防的疾病或障碍，例如包含：慢性肉芽肿病(CGD)、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、异染性脑白质营养不良(MLD)、戈谢病、法布瑞氏病、粘多糖症、HIV、ADA-SCID、X-SCID、地中海贫血，但不限于此。
所述基因修饰细胞的制造可通过本领域技术人员公知的各种方法进行，可利用例如利用核酸或其他载体的永久性或暂时性的基因导入、基于基因组编辑的基因组上的基因或对基因表达进行控制的因子的缺失、添加、变异等。该变异包含构成基因或对基因表达进行控制的因子的碱基序列中的碱基的缺失、添加、替换等，但不限于此。
所述基因修饰的细胞可以是从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。此外，对标志物进行检测的细胞可以是细胞群中包含的全部或一部分细胞。
实施例
在下文中使用实施例更详细地说明本公开，但这些实施例是用于说明的示例，本公开不限于这些实施例。
方法和材料
(1)细胞来源
作为脐带血，使用新鲜脐带血(由神户市立医疗中心中央市民病院和足立病院(神户市)提供)。作为骨髓液，使用冷冻细胞，人骨髓CD34+祖细胞，2M-101A(Lonza Group AG，Basel，Switzerland)。作为外周血，使用冷冻细胞，Mobilized人外周血CD34+造血干细胞，阳性选择，4Y-101C(Lonza Group AG，Basel，Switzerland)。
(2)有核细胞的回收(红细胞的除去)
使用上述得到的细胞来源，进行使用EasySep RBC Depletion Reagent(STEMCELLTechnologies公司制)的红细胞除去，进行浓缩处理，得到含造血干细胞的细胞群。
(3)CD34阳性细胞的浓缩
对于上述得到的含造血干细胞的细胞群，使用EASYSep Human Cord Blood CD34Positive Selection Kit II(STEMCELL Technologies公司制)，进行CD34阳性细胞分级的粗纯化。
(4)细胞染色
对于浓缩有上述得到的造血干细胞和祖细胞的细胞群(CD34阳性浓缩细胞分级)，进行添加以下的抗体的细胞染色。基于抗体的细胞染色在冰上进行30分钟孵育。CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a、CD34、CD38、CD90、CD45RA、CD49f和LEGENDScreen Human PE Kit(BioLegend公司制)中包含的抗体。
(5)细胞解析和细胞分选(sort)
使用带有细胞筛网的FACS管(FALCON公司制)过滤细胞染色后的样品后，进行死细胞染色。死细胞染色使用碘化丙啶溶液(Propidium Iodide Solut ion)(BioLegend公司制)、SYTOX-Red(ThermoFisher SCIENTIFIC公司制)等。细胞的解析和分选使用FACSAriaII或者III(BD公司制)。采集的数据使用Fl owJo(BD公司制)或申请人开发的算法(也公开于PCT/JP2019/051270、PCT/JP2020/025915等中)进行解析。需要说明的是，该算法是，基于从通过细胞染色等而得到的定量物理特性的数值数据和/或生物学特性的数值数据中选择的多个数值数据的相似性，生成细胞配置空间结构，从而生成在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构，通过利用已知的分化标志物等，而确定该细胞配置空间结构上的分化方向的算法。
(6)CFU测定
根据细胞染色的解析结果，确定可能包含长期造血干细胞的候补分级，在各孔接种有MethoCult H4435 Enriched(STEMCELL Technologies公司制)25ul的96孔板中进行每1个细胞的分选。对于进行了细胞分选的孔，添加Iscove’s MDM with 2％ FBS(STEMCELLTechnologies公司制)12.5ul。在板的最外的孔中添加用于防止干燥的灭菌水200ul。然后，细胞在CO2培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下进行2周培养，形成得到的集落使用光学显微镜(KEYENCE公司制)拍摄，通过肉眼观察计数集落数，通过肉眼观察判别集落形态。根据集落的形态，判别骨髓类祖细胞来源的ColonyFormationUnit-Gr anulocyte，Erythroid，Macrophage，Megakaryocyte(CFU-GEMM)、和红系爆式集落形成细胞BurstFormingUnit-Erythroid(BFU-E)，粒细胞·巨噬细胞集落形成细胞ColonyFormationgUnit-Granulocyte，Macrophage(CFU-GM)并计数。
(7)向免疫缺陷小鼠的移植实验
将新鲜或者培养后的细胞通过下述方法，进行向免疫缺陷小鼠的移植，评价造血能力。将用BD FACSAriaIII进行了分选的细胞分级尾静脉或者骨髓内给药于进行了2.5Gy放射线照射的NOG小鼠(NOD/Shi-scid，IL-2RyKO Ji c)。移植后，每隔4周采集外周血或者骨髓细胞，根据需要使用Lysing Buff er(BD公司制)破碎红细胞后，通过FACS Canto测定来源于供体的嵌合体。细胞染色使用了针对下述的抗体：人CD56、人CD3、人CD16、人CD19、人CD14、人CD45、小鼠Gr-1、小鼠CD45，死细胞染色使用了碘化丙啶溶液(BioLegend公司制)。
(8)细胞培养
在添加有200ul的IMDM(GIBCO公司制)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)(Gibco公司制)、1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco公司制)、50ng/ml人干细胞因子(human Stem Cell Factor)(PeproTech公司制)、人血小板生成素(humanThrombopoietin)(PeproTech公司制)的U底96孔板(CORNING公司制)中，使用FACSAriaIII分选为候补细胞分级300细胞/孔。进行了分选的细胞在CO2培养箱中在37℃、5％CO2的条件下培养1周。培养后，将CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a、CD34、CD38、CD117、CD48作为标志物，使用FlowJo(BD)对活细胞数、CD34+CD117+分级数、CD34+CD117CD48-分级数、CD34+CD117+CD48+数、活细胞率、CD34+CD117+分级率、CD34+CD117CD48-分级率、CD34+CD117+CD48+率等进行解析。CD34+CD117CD48-分级是以长期造血干细胞为主的分级。
(9)基因导入
使用包含报告基因的慢病毒Lenti-LabelerTM virus(FUNAKOSHI公司制)进行感染实验。向涂布有RetroNectin(Clontech公司制)的96孔板(CORNING公司制)中添加具有1×10e8IFU/ml的滴度的病毒液，制备涂布有病毒的板。在各孔中根据候补细胞分级以1000细胞以上进行分选并接种。在IMDM/5ng/ml SCF/5ng/ml TPO/1％ Pen/St/Glu 200ul中进行24小时感染。经过感染的细胞随后进行细胞培养、CFU测定、移植实验等。
实施例1：在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构 的生成
对于从生物体中得到的新鲜脐带血进行红细胞除去、浓缩处理，得到含造血干细胞的细胞群。对于该含造血干细胞的细胞群，使用EASYSep Huma n Cord Blood CD34Positive Selection Kit II(STEMCELLTechnologies公司制)，将CD34阳性细胞分级粗纯化。对于该CD34阳性细胞分级，使用CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a、CD34、CD38、CD90、CD45RA、CD49f和LEGENDScreen Human PE Kit(BioLegend公司制)中包含的抗体进行死细胞染色，对于各细胞，将各抗体的染色强度定量化。使用该定量化数据，生成在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构。图1、图2例示了该结构的一部分可视化的结构。图1显示了2维图像，其中死细胞染色后，将活细胞的位置分配在由定量化数据的组合生成的合成轴1、合成轴2、合成轴3构成的3维空间。图2表示，对于在该空间结构分配了位置的各细胞，将已知在造血干细胞中表示特征性的表达形式的CD34的表达量可视化的结果。CD34阳性的细胞偏向存在于该空间结构的一部分。
实施例2：长期造血干细胞和CD34的表达形式的关联
为了调查长期造血干细胞与CD34的表达形式的关联，而将人从脐带血中分离的CD3(-)CD34(-)(CD3阴性，CD34阴性)细胞或CD3(-)CD34(+)(CD3阴性，CD34阳性)细胞移植至免疫缺陷小鼠，检测移植后的嵌合率。在移植后4周、8周和12周后检测嵌合率时，其结果，CD3(-)CD34(+)细胞与CD3(-)CD34(-)细胞相比，显示出显著高的生存率和嵌合率。将结果示于图3。需要说明的是，各标志物的阴性、阳性的区分依据使用的BD FACSAriaIII的细胞分选结果。本结果表示长期造血干细胞与CD34(+)的表达形式相关联。
为了更详细地分析在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构中的、CD34(+)部分的细胞配置，在使用适用于展开CD34(+)部分的合成轴而生成的空间内，配置CD34(+)部分的细胞。将一个实例示于图4。
以往，报告了人长期造血干细胞存在于CD38(-)的部分，作为用于确定人长期造血干细胞的标志物组，提出了包含CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(-)和CD90(+)的标志物组等(Science，2011，Vol333，pp.218-221，Cell Stem Cell，2007年，Vol.1，pp.635-645)。
因此，再次确认了CD34(+)部分中的CD38(+)和CD38(-)部分的未分化特性。具体而言，对于作为CD38(+)的部分P6(CD34(+)、CD38(+))，与以往提出的CD38(-)部分有关的部分P7(CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(-)、CD90(+))、部分P8(CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(-)、CD90(-))和部分P9(CD34(+)、CD38(-)、CD45RA(+)和CD90(-))，进行CFU测定，检测各个部分中的造血干细胞的增殖·分化能力。其结果，由以往提出的CD38(-)标志物分级的P7和P9表现出极低的造血干细胞的增殖·分化能力(图5)。另一方面，据了解，作为CD38(+)的部分P6的细胞也表现出较高的造血干细胞的增殖·分化能力，因此不仅在以往报告的CD34(+)、CD38(-)部分，而且在CD34(+)部分整体，分布有长期造血干细胞。因此，认识到需要进行能够分离、浓缩存在于CD34(+)部分的长期造血干细胞的新标志物的探索。
实施例3：1个细胞水平的细胞功能解析
为了确认由用于确定人长期造血干细胞的标志物确定的细胞的未分化性，而在1个细胞水平上进行CFU测定。将一个实例示于图6。通过将该1个细胞水平上的细胞功能解析结果与索引排序(index sort)分析组合，能够将每1个细胞的未分化性和各标志物的表达形式相关联。通过将由该分析得到的标志物与未分化特性的关联配置在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构上，来确定该细胞配置空间结构上的细胞分化方向。将以CD34阳性细胞为对象进行了该分析的结果的一个实例示于图7。
实施例4：用于浓缩或分离长期造血干细胞的标志物
对于CD34阳性细胞，确定了在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构上沿确定的分化方向表达分布不均匀的分子标志物。图8表示一例。确定了更偏向未分化方向而表达的标志物分子、更偏向分化方向而表达的标志物分子。
通过CFU测定确认了由这些标志物确定的细胞的造血干细胞的增殖·分化能力，其结果，由这些标志物确定的细胞显示出比对照(CD34(+)细胞)更高的造血干细胞的增殖·分化能力(图9)。
这些标志物包含：
CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD18、CD244、CD275、CD328、CD48、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD105、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD92、CD318、CD49f、c-Kit、CD34。
需要说明的是，如在实施例2中确认的那样，由于CD34(-)部分中几乎不存在长期造血干细胞，因此在以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群中浓缩长期造血干细胞的所述标志物，即使在应用于未以CD34(+)进行预浓缩的细胞群时，它们也可以分别单独用作用于浓缩长期造血干细胞的标志物。
实施例5：用于更详细地确定长期造血干细胞的标志物
所述确定的标志物中，更详细地分析由包含c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)的组合的标志物确定的细胞的特性。
以c-Kit(+)和CD34(+)对从脐带血中以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群设门(部分P1)，进一步以CD48(-)设门(部分P2)时的FACS图表的一个实例示于图10。部分P1中，大半的细胞被分级(部分non-P2)为CD48(+)，仅一部分被分级为P2。
此外，使用骨髓细胞样品进行同样的分级时，其结果，显示与脐带血样品极其相似的分级图案(图11)。即使用动员外周血样品也同样，显示与脐带血样品极其相似的分级图案(图12)。
将脐带血1ml中包含的CD34阳性分级与P2部分的细胞数比较的结果示于图12。确认了分级为P2部分的细胞是以CD34(+)进行了预浓缩的细胞群的一小部分。需要留意的是，脐带血的大半为CD34(-)，因此脐带血样品整体中的P2部分的细胞的比例极低。
通过CFU测定将以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)确定的细胞部分(P2)与以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(+)确定的细胞部分(non-P2)的造血干细胞的增殖·分化能力进行比较。其结果，确认了P2部分具有极高的造血干细胞的增殖·分化能力(图14)。
通过移植试验对细胞部分P2与细胞部分non-P2的未分化性进行比较。在放射线照射后12小时或者24小时后进行细胞移植，对移植后第20周时的骨髓中的人血液细胞(人CD45阳性细胞)中的嵌合率和人粒细胞(hGra)中的嵌合率进行检测，其结果，任一结果都确认了细胞部分P2显示出极高的嵌合率(图15)。
使用骨髓细胞样品和动员外周血样品，取得与上述同样地以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)确定的细胞部分(P2)和以c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(+)确定的细胞部分(non-P2)，通过CFU测定对造血干细胞的增殖·分化能力进行比较。其结果，确认了P2部分具有极高的造血干细胞的增殖·分化能力。将骨髓细胞样品的结果示于图16，将动员外周血样品示于图17。同时显示作为以c-Kit(+)、CD34(+)确定的部分的P1部分的结果。
本结果表示，通过利用包含c-Kit(+)、CD34(+)、CD48(-)的组合的标志物，能够极高效地浓缩或分离长期造血干细胞。此外，如图10和11的左侧的图表所示，CD34(+)分级的细胞的几乎为c-Kit(+)。此外，如图5所示，可以理解：长期造血干细胞被选择性地分级为CD34(+)的部分，因此c-Kit(+)的标志物与CD34(+)的标志物同样地能够浓缩长期造血干细胞。
实际上，对于脐带血样品，将CD34(+)部分分级为c-Kit(+)部分和c-Kit(-)部分，通过CFU测定分别对造血干细胞的增殖·分化能力进行比较，其结果，c-Kit(+)部分显示出与CD34(+)部分基本相同的造血干细胞的增殖·分化能力，而c-Kit(-)部分几乎不显示造血干细胞的增殖·分化能力(图18)。因此可以理解：包含CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合的标志物也可用作能够高效地浓缩或分离长期造血干细胞的标志物。
实施例6：追加性的标志物
通过利用所述在分化系统上处于接近位置的细胞占据接近位置的细胞配置空间结构的分析，确定用于更详细地分级P2部分的追加性的标志物。具体而言，在所述分析中，将偏向分布在分化方向或未分化方向上的标志物作为候补，基于该标志物的表达量，将P2部分的细胞分为受试部分和对照部分，通过CFU测定对各个部分的造血干细胞的增殖·分化能力进行比较。
根据得到的结果，通过以下的式对在受试部分浓缩长期造血干细胞的效率定量化。
浓缩倍率＝由受试部分产生的集落中CFU-GEMM所占的比例/由对照部分产生的集落中CFU-GEMM所占的比例
在由受试部分和对照部分产生的集落中CFU-GEMM所占的比例相同的情况下，浓缩倍率为1。
将所述分析结果示于图19。需要说明的是，就各标志物的(+)(-)而言，在将所述P2分为两份时，将表达量较多的表示为(+)，将较少的表示为(-)，需要留意的是，其与细胞分选仪提示的阴性、阳性等具有不同的意义。
这些追加性的标志物包含以下标志物。
CD84(+)、CD111(+)、CD150(-)、GPR56(-)、Notch-1(-)、CD52(-)、CD62L(+)、CD71(+)、CD93(-)、CD122(-)、CD133(-)、CD275(-)、CD131(-)、CD326(+)、CD200(-)、CD200R(-)、CD324(+)、CD40(-)、CD11c(-)、CD318(-)。
实施例7：基于体外培养后的长期造血干细胞的标志物的确定
进行用于确认本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物是否能够鉴定体外培养后的长期造血干细胞。对于使用已知促进造血干细胞的增殖的化合物UM171而培养的细胞群，对以c-Kit(+)、CD34(+)和CD48(-)的标志物组鉴定的细胞的比例进行检测。对于P2部分或non-P2部分中包含的300细胞，在添加或不添加UM171的条件下培养，对7天后的总细胞数和未分化细胞(P1)的比率进行检测。将P2部分的结果示于图20，将non-P2部分的结果示于图21。通过本检测，可理解本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物能够鉴定体外培养后的长期造血干细胞。本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物能够鉴定体外培养后的长期造血干细胞，这一点可进一步通过CFU测定等功能检测进行确认。将从脐带血样品中以c-Kit(+)、CD34(+)和CD48(-)的标志物组分级的P2部分的细胞培养7天后，使用c-Kit(+)、CD34(+)和CD48(-)的标志物组将培养后的细胞群分级为P2部分(培养后)和non-P2部分(培养后)，分别进行CFU测定。其结果，培养后细胞群中全部被分级为P2部分(培养后)，未确认到被分级为non-P2部分(培养后)的细胞。对P2部分(培养后)进行CFU测定时，其结果，从P2部分(培养后)中，也与培养前的P2部分同样，确认到未分化细胞(CFU-GEMM细胞)较高的含有比例(图22)。
这些结果表示，本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物能够鉴定体外培养后的长期造血干细胞。
实施例8：对分离或浓缩得到的长期造血干细胞的基因导入
为了确认由本公开的分离或浓缩长期造血干细胞的标志物分离或浓缩的长期造血干细胞是否能够在基因导入后也保持长期造血干细胞的特性，而进行基于CFU测定的功能检测。具体而言，对于P2部分、non-P2部分或DC34阳性部分中包含的细胞，通过慢病毒载体进行GFP报告基因的基因导入，对这些进行了基因导入的细胞进行CFU测定，确认了P2部分来源的基因导入细胞保持了增殖·分化能力。
工业实用性
本公开提供长期造血干细胞、长期造血干细胞的分离或浓缩方法、分离或浓缩得到的长期造血干细胞或包含长期造血干细胞的细胞群的制造方法、分离或浓缩得到的长期造血干细胞或包含长期造血干细胞的细胞群的评价方法、用于检测、分离或浓缩分离或浓缩得到的长期造血干细胞或包含长期造血干细胞的细胞群的组合物或试剂盒、对长期造血干细胞的特性进行修饰的化合物的筛选方法、培养条件的评价、调节方法，并且有助于利用了长期造血干细胞的药物的开发等。

Claims (23)

1.一种造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，其包含：
选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的造血干细胞分离标志物或浓缩标志物，其包含：
选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上。
3.一种分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群，其由以下表达形式确定，所述表达形式为选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的分离得到的造血干细胞或造血干细胞浓缩得到的含造血干细胞的细胞群，其由选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的表达形式确定。
5.一种分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达形式作为指标，对细胞进行分离或浓缩的工序。
6.根据权利要求5所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群的制造方法，其中，
将选自CD48(-)和CD34(+)的组合、CD48(-)和c-Kit(+)的组合以及CD48(-)、CD34(+)和c-Kit(+)的组合中的1种以上的表达形式作为指标。
7.由权利要求1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或权利要求3或4所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过权利要求5或6中任一项所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群，其进一步包含修饰。
8.一种对细胞群中的造血干细胞的含量和/或含量的变化进行评价的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
对各细胞中的各细胞的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量进行测定的工序。
9.一种含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；和
将所述含造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD48、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，检测所述细胞群的品质的工序。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，
所述品质是造血能力保持能力、移植适合性或保存稳定性。
11.一种含造血干细胞的细胞群的检测方法，其包含：
取得包含源自受试者的造血干细胞的细胞群中包含的细胞表达的选自C D10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量的工序；和
将所述标志物的表达量与对照进行比较，以进行受试者的疾病预后预测或健康情况预想的工序。
12.一种对造血干细胞的特性进行修饰的化合物的筛选方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过候补化合物对含造血干细胞的细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notc h1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
13.一种对造血干细胞的特性进行修饰的培养条件的调节方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过经过调节的培养条件而培养含造血干细胞的细胞群的工序；和
将通过经过调节的培养条件而培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养条件的工序。
14.一种制造对造血干细胞的特性进行修饰的培养培养基或培养辅助添加物的方法，其包含：
准备含造血干细胞的细胞群的工序；
通过具有评价对象的构成的培养基或包含评价对象的培养辅助添加物的培养基对含造血干细胞的细胞群进行培养的工序；
将培养得到的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Sigle c-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，决定培养培养基或培养辅助添加物的构成的工序；和
制造具有上述决定的构成的培养培养基或培养辅助添加物的工序。
15.根据权利要求5～14中任一项所述的方法，其中，
所述含造血干细胞的细胞群为从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。
16.一种通过权利要求5～7中任一项所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群，其中，
所述含造血干细胞的细胞群为从生物体来源的细胞或人工获得了多能性的细胞诱导而成的细胞。
17.一种诱导造血干细胞的化合物的筛选方法，其包含：
准备细胞群的工序；
通过受试化合物对细胞群进行处理的工序；和
将通过候补化合物进行了处理的细胞表达的选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notc h1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的标志物的表达量作为指标，选择候补化合物的工序。
18.一种用于鉴定、检测、分离或浓缩造血干细胞的组合物或试剂盒，其包含：
对选自CD10、CD111、CD112、CD131、CD143、CD244、CD275、CD328、CD62L、GPR56、CD133、CD36、CD370、CD84、CD326、CD114、CD116、CD135、CD172a/b、CD200、CD226、CD245、CD31、CD317、CD40、CD41、CD61、CD93、Notch1、CD352、Siglec-10、CD45RO、CD11c、CD52、CD318、CD49f、c-Kit和CD48中的1种以上、或选自CD48和CD34的组合、CD48和c-Kit的组合以及CD48、CD34和c-Kit的组合中的1种以上、或它们的组合的表达量进行定量或检测的试剂。
19.一种对通过分析由权利要求1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或权利要求3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过权利要求5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合进行确定的方法。
20.一种制造对造血干细胞进行鉴定的分类器的方法，其中，
将通过分析由权利要求1或2所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或权利要求3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过权利要求5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群而得到的物理特征、化学特征、生物学特征的组合作为指标，来确定造血干细胞。
21.一种通过施用造血干细胞来预防或治疗待改善或预防的疾病或障碍的药物，其包含：
由权利要求1或2中任一项所述的标志物而鉴定、分离或浓缩得到的造血干细胞、或权利要求3、4和7中任一项所述的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群、或通过权利要求5或6所述的方法制造的分离或浓缩得到的造血干细胞或含造血干细胞的细胞群。
22.根据权利要求21所述的药物，其中，
通过施用造血干细胞来改善或预防的疾病或障碍为异染性脑白质营养不良(MLD)、戈谢病、法布瑞氏病、粘多糖症、HIV、ADA-SCID、X-SCID或地中海贫血。
23.根据权利要求21所述的药物，其中，
通过施用造血干细胞来改善或预防的疾病或障碍为慢性肉芽肿病(CGD)或肾上腺脑白质营养不良(ALD)。
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