KR20230034299A - 인간 장기 조혈 간세포 마커 - Google Patents

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KR20230034299A
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마사노리 미야니시
이사오 미야츠카
마이 안 리
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네쿠스젠 가부시키가이샤
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Abstract

본 개시는, 조혈 간세포를 농축하거나 또는 단리(單離)하기 위한 마커 및 이것을 이용하는 방법, 상기 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 세포 또는 세포 집단, 상기 세포 또는 세포 집단을 이용하는 방법, 상기 세포 또는 세포 집단을 함유하는 의약, 상기 세포 또는 세포 집단을 이용하여 얻어지는 분류기에 관한 것이다.

Description

인간 장기 조혈 간세포 마커
본 개시는, 조혈 간세포를 농축하거나 또는 단리(單離)하기 위한 마커 및 이것을 이용하는 방법, 상기 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 세포 또는 세포 집단, 상기 세포 또는 세포 집단을 이용하는 방법, 상기 세포 또는 세포 집단을 함유하는 의약, 상기 세포 또는 세포 집단을 이용하여 얻어지는 분류기(分類器)에 관한 것이다.
간세포, 예를 들어 조혈 간세포(HSC)는, 자기 복제능과 다분화능이라고 하는 생물학적 기능을 가지는 것이 알려져 있다. 자기 복제능과 다분화능을 가지는 간세포 중에서도, 이것들의 간세포를 특징짓는 생물학적 기능을 장기에 걸쳐 유지하는 세포와, 비교적 단기간에 그 기능을 잃는 간세포가 존재하는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 1).
장기간, 예를 들어 생물 개체의 생애에 걸쳐 자기 복제능과 다분화능을 유지하는 간세포는, 그 자기 복제능을 이용하여 대량 배양을 행하는 것이 가능하고, 또한, 그 다분화능을 이용하여, 다양한 세포로 분화시킬 수 있다. 이와 같은 특성을 가지는 간세포는 재생 의료를 실용화할 때의 해결책이 될 수 있는 세포라고 생각되고 있다. 그렇지만, 이것들의 간세포는 모두 생체 내에 있어서의 존재량이 극히 희소한 세포이고, 생체로부터 용이하게 동정(同定), 단리할 수 없다.
조혈 간세포(Hematopoietic stem cell: HSC)는, 주로 골수 내에 존재하고, 자기 복제능 및 다분화능을 가지는 혈액 세포라고 정의되고, 조혈 간세포 이식 등에 이용되고 있다. 장기에 걸쳐 간세포의 성질을 유지하는 장기 조혈 간세포 등의 질이 좋은 조혈 간세포를 적절히 단리할 수 있으면, 당해 조혈 간세포를 in vitro로 대량으로 증식시키는 것을 생각할 수 있지만, 인간에 있어서 장기 조혈 간세포(long-term HSC: LT-HSC)의 적절한 단리를 가능하게 하는 특이적 마커는 알려져 있지 않았다.
종래, 조혈 간세포의 세포 표면에 특이적으로 발현하는 분자를 동정하고, 특정의 특성을 가지는 조혈 간세포를 이것들 분자의 조합으로 동정하는 시도가 이루어지고 있다. 그렇지만, 이와 같은 수법에 있어서는, 특정의 특성을 가지는 조혈 간세포를 동정하기 위한 「최적인 모노클로널 항체의 조합」을, 시행착오를 통하여 찾아낼 필요가 있고, 매우 숙련된 기술이 필요하게 되어 왔다. 그리고, 시험해야 할 모노클로널 항체의 조합이 많은 것 등에 기인하여, 일반적으로 이와 같은 개발 수법에는 방대한 시간과 비용이 필요하게 된다. 실제로, 1988년에 마우스의 조혈 간세포(HSC)가 발견된 이후, 조혈 간세포의 특성을 가지는 세포 중에서도, 특히 마우스 개체가 생애에 걸쳐 자기 복제능 및 다분화능을 유지하는 특징을 가지는 장기 조혈 간세포가 발견, 동정될 때까지는, 30년이나 되는 세월이 필요하였다(비특허 문헌 2). 한편, 마우스와 인간에서는, 조혈 간세포 표면에 있어서 특이적으로 발현하는 분자 마커가 다른 것이 시사되어 있고, 인간에 있어서의 장기 조혈 간세포를 농축, 동정할 수 있는 마커를 찾아내는 것이 요망되고 있었다.
지금까지도, 장기 조혈 간세포를 동정, 단리하기 위하여, 장기 조혈 간세포 표면에 특이적으로 발현하고 있는 분자의 조합을 탐색하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들어, CD34 양성의 조혈 간세포 집단으로부터 조혈 간세포를 한층 더 농축하기 위하여, 제대혈 중의 CD34 양성, CD38 음성, CD45RA 음성 획분(劃分)으로부터 Thy1 양성의 획분을 단리하는 것이 제안되고 있지만, 당해 획분도 여전히, 조혈 간세포의 특성을 유지하는 능력에 있어서 다양하게 다른 세포를 함유하고 있는 것이 보고되고 있다(비특허 문헌 3). 이와 같은 세포 표면 분자의 조합의 탐색에는 일반적으로 세포 기능 시험을 행하기 위한 다대(多大)한 작업을 수반하는 시행착오가 필요로 되고 있다(비특허 문헌 4). 따라서, 장기 조혈 간세포를 특정하기 위한, 새로운 세포 표면 분자의 조합을 특정하는 것이 요망되고 있다.
일본 수혈 세포 치료 학회지, 2006년, Vol.52, No.5, pp.583-588 nature, 2016년, Vol.530, pp.223-227 Science, 2011년, Vol.333, pp.218-221 Cell Stem Cell, 2007년, Vol.1, pp.635-645
본 개시는, 조혈 간세포를 농축하거나 또는 단리하기 위한 마커 및 그 사용을 제공하는 것을 과제로 한다.
일 태양(態樣)에 있어서, 본 개시는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합으로 이루어지는, 장기 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커를 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 개시는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식에 의하여 특정되는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 개시는,
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식을 지표로 하여, 세포를 단리하거나 또는 농축하는 공정
을 포함하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
각 세포에 있어서의 각 세포의 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합 마커의 발현량을 측정하는 공정
을 포함하는, 상기 세포 집단에 있어서의 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 상기 세포 집단의 품질을 시험하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 상기 세포 집단의 이식 적합성을 시험하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
피험자의 질환 예후 예측 또는 건강 상황 예상을 위하여,
환자 유래의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 취득하는 공정과,
상기 마커의 발현량을 대조와 비교하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 시험하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
후보 화합물에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 처리하는 공정과
후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
조정된 배양 조건에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
조정된 배양 조건에 의하여 배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 배양 조건의 조정 방법을 결정하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 조건의 조정 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
상기 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현량을 지표로 하여, 조혈 간세포의 특성을 수식하도록 배양 조건을 조정하는 공정
을 포함하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
평가 대상의 구성을 가지는 배지, 또는 평가 대상의 배양 보조 첨가물을 포함하는 배지에 의하여, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합 마커의 발현량을 지표로 하여 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물의 구성을 결정하는 공정과,
상기 결정된 구성을 가지는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는,
세포 집단을 준비하는 공정과,
피험 화합물에 의하여 세포 집단을 처리하는 공정과,
후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 유도하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 정량 또는 검출하는 시약을 포함하는, 조혈 간세포를 동정하거나, 검출하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, 본 개시의 조혈 간세포를 수식하는 것으로, 수식된 조혈 간세포를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단 혹은 이것들을 수식한 세포를 함유하는, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해를 예방하거나 또는 치료하기 위한 의약을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단 또는 이것을 수식한 세포와 피험 물질을 접촉시키는 공정을 포함하는, 피험 물질의 생리 작용을 평가하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합에 의하여 조혈 간세포를 동정하고, 당해 조혈 간세포를 함유하는 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합에 의하여 조혈 간세포를 동정하는 분류기를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시는, CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커 분자의 발현 양식을 지표로 하여 제조된 세포를 포함하는, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해를 예방하거나 또는 치료하기 위한 의약을 제공한다.
본 발명은 일 태양에 있어서, 이하를 제공한다.
[항목 1]
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합으로 이루어지는, 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커.
[항목 2]
항목 1에 있어서, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상으로 이루어지는, 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커.
[항목 3]
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식에 의하여 특정되는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단.
[항목 4]
항목 3에 있어서, CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의 발현 양식에 의하여 특정되는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단.
[항목 5]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식을 지표로 하여 세포를 단리하거나 또는 농축하는 공정
을 포함하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법.
[항목 6]
항목 5에 있어서, CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의 발현 양식을 지표로 하는,
단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법.
[항목 7]
수식을 더 포함하는, 제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 항목 3 또는 4에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 항목 5 또는 6에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단.
[항목 8]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
각 세포에 있어서의 각 세포의 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 측정하는 공정
을 포함하는, 상기 세포 집단에 있어서의 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가하는 방법.
[항목 9]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD48, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 상기 세포 집단의 품질을 시험하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법.
[항목 10]
항목 9에 있어서, 상기 품질이 조혈능 유지 능력, 이식 적합성, 또는 보존 안정성인, 시험 방법.
[항목 11]
피험자 유래의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 취득하는 공정과,
피험자의 질환 예후 예측 또는 건강 상황 예상을 위하여, 상기 마커의 발현량을 대조와 비교하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법.
[항목 12]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
후보 화합물에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 처리하는 공정과,
후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물의 스크리닝 방법.
[항목 13]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
조정된 배양 조건에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
조정된 배양 조건에 의하여 배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여 배양 조건을 결정하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 조건의 조정 방법.
[항목 14]
조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
평가 대상의 구성을 가지는 배지, 또는 평가 대상의 배양 보조 첨가물을 포함하는 배지에 의하여, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물의 구성을 결정하는 공정과,
상기 결정된 구성을 가지는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 방법.
[항목 15]
항목 5 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단이, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포인, 방법.
[항목 16]
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단이, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포인, 항목 5 내지 7 중 어느 한 항목에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단.
[항목 17]
세포 집단을 준비하는 공정과,
피험 화합물에 의하여 세포 집단을 처리하는 공정과,
후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
을 포함하는, 조혈 간세포를 유도하는 화합물의 스크리닝 방법.
[항목 18]
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현량을 정량 또는 검출하는 시약을 포함하는, 조혈 간세포를 동정하거나, 검출하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트.
[항목 19]
제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 항목 3, 4 및 7 중 어느 한 항목에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 항목 5 또는 6에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합을 특정하는 방법.
[항목 20]
제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 항목 3, 4 및 7 중 어느 한 항목에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 항목 5 또는 6에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합을 지표로 하여 조혈 간세포를 동정하는 분류기를 제조하는 방법.
[항목 21]
제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 항목 3, 4 및 7 중 어느 한 항목에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 항목 5 또는 6에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해를 예방하거나 또는 치료하기 위한 의약.
[항목 22]
항목 21에 있어서, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해가, 이염성 백질디스트로피(MLD), 고셔병, 파브리병, 뮤코다당증, HIV, ADA-SCID, X-SCID 또는 탈라세미아인, 의약.
[항목 23]
항목 21에 있어서, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해가, 만성 육아종증(CGD) 또는 부신백질디스트로피(ALD)인, 의약.
본 개시는, 조혈 간세포를 농축하거나 또는 단리하기 위한 마커 및 그 사용을 제공한다고 하는 효과를 가지고 있다.
도 1은, 제대혈 샘플을 세포 염색한 데이터로부터 생성된, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조를 가시화한 화상이다.
도 2는, 제대혈 샘플을 세포 염색한 데이터로부터 생성된, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조에 있어서, 각 세포의 CD34의 발현량을 가시화한 화상이다.
도 3은, 제대혈로부터 얻어진 CD34(＋) 세포 및 CD34(－) 세포의 이식 시험에 있어서의 키메라율을 비교한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조에 있어서, CD34(＋) 획분의 세포 배치를 보다 상세하게 배치한 결과를 도시하는 화상이다.
도 5는, CD34(＋) 및 CD38(－/＋)로 특정되는 제대혈 획분의 조혈 간세포의 증식·분화능을 도시하는 도면이다. CD34(＋) 및 CD38(＋)로 이루어지는 획분(P6)과 CD34(＋), CD38(－), CD45RA(－) 및 CD90(＋)로 이루어지는 획분(P7), CD34(＋), CD38(－), CD45RA(－) 및 CD90(－)로 이루어지는 획분(P8), 및 CD34(＋), CD38(－), CD45RA(＋) 및 CD90(－)로 이루어지는 획분(P9)의 CFU 어세이(assay) 결과를 도시한다.
도 6은, 1세포 레벨에서의 CFU 어세이의 개요를 도시하는 도면이다.
도 7은, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조 상에서, CD34 양성 세포 분획을 대상으로, 미분화 세포의 위치하는 방향을 도시하는 도면이다.
도 8은, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조 상에서, 분화 방향을 따라 발현이 편재(偏在)하는 분자 마커를 탐색한 결과의 일례를 도시하는 도면이다.
도 9는, 각 마커에 의하여 특정되는 세포의 CFU 어세이에 있어서, CFU-GEMM을 나타내는 세포의 비율(미분화 세포의 농축 정도와 상관)을 도시하는 도면이다.
도 10은, 제대혈로부터 CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단을, c-Kit(＋) 및 CD34(＋)로 게이팅하고(획분 P1), 한층 더 CD48(－)(P2 획분) 또는 CD48(＋)(non-P2 획분)로 게이팅하였을 때의 FACS 플롯의 일례를 도시하는 도면이다.
도 11은, 골수로부터 CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단을, c-Kit(＋) 및 CD34(＋)로 게이팅하고(획분 P1), 한층 더 CD48(－)(P2 획분) 또는 CD48(＋)(non-P2 획분)로 게이팅하였을 때의 FACS 플롯의 일례를 도시하는 도면이다.
도 12는, 동원 말초혈로부터 CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단을, c-Kit(＋) 및 CD34(＋)로 게이팅하고(획분 P1), 한층 더 CD48(－)(P2 획분) 또는 CD48(＋)(non-P2 획분)로 게이팅하였을 때의 FACS 플롯의 일례를 도시하는 도면이다.
도 13은, 제대혈 1ml당에 포함되는 CD34 양성 세포수와, P2 획분의 세포수를 비교한 결과를 도시하는 도면이다.
도 14는, 제대혈로부터 분리된, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)로 특정되는 세포 획분(P2)과, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(＋)로 특정되는 세포 획분(non-P2)의 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교한 결과를 도시하는 도면이다.
도 15는, 제대혈로부터 분리된 세포 획분 P2와, 세포 획분 non-P2의 미분화성을, 이식 시험에 의하여 비교한 결과를 도시하는 도면이다.
도 16은, 골수로부터 분리된, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)로 특정되는 세포 획분(P2)과, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(＋)로 특정되는 세포 획분(non-P2)의 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교한 결과를 도시하는 도면이다. c-Kit(＋), CD34(＋)로 특정되는 획분인 P1 획분의 결과도 아울러 도시한다.
도 17은, 동원 말초혈로부터 분리된, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)로 특정되는 세포 획분(P2)과, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(＋)로 특정되는 세포 획분(non-P2)의 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교한 결과를 도시하는 도면이다. c-Kit(＋), CD34(＋)로 특정되는 획분인 P1 획분의 결과도 아울러 도시한다.
도 18은, 제대혈 샘플에 관하여 CD34(＋) 획분을 c-Kit(＋) 획분과 c-Kit(－) 획분으로 분획으로 분획하고, 각각에 관하여 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교한 결과를 도시하는 도면이다. CD34(＋) 획분 전체의 결과도 아울러 도시한다.
도 19는, 추가적인 마커의 농축 배율을 도시하는 도면이다. 농축 배율이 10을 넘는 데이터는 10으로서 도시하고 있다.
도 20은, P2 획분의 세포를, UM171 첨가 또는 비첨가의 조건으로 배양하고, 7일 후의 총 세포수 및 미분화 세포(P1)의 비율을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 21은, non-P2 획분의 세포를, UM171 첨가 또는 비첨가의 조건으로 배양하고, 7일 후의 총 세포수 및 미분화 세포(P1)의 비율을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 22는, 제대혈 샘플로부터 c-Kit(＋), CD34(＋) 및 CD48(－)의 마커 세트로 분획한 P2 획분의 세포를 7일간 배양한 후, 배양 후의 세포 집단을 c-Kit(＋), CD34(＋) 및 CD48(－)의 마커 세트를 이용하여 P2 획분(배양 후) 및 non-P2 획분(배양 후)으로 분획하고, 각각에 관하여, CFU 어세이를 행한 결과를 도시하고 있다.
이하, 본 개시의 실시 형태에 관하여 설명한다. 이하의 설명은 단순한 예시이고, 본 개시의 범위는 이것들의 설명에 구속되는 일은 없고, 본 개시의 취지를 해치지 않는 범위에서 적의(適宜) 변경하여 실시할 수 있다.
(정의)
본 개시에 있어서, 복수의 수치의 범위가 나타내졌을 경우, 그것들 복수의 범위의 임의의 하한값 및 상한값의 조합으로 이루어지는 범위도 마찬가지로 의미한다.
본 개시에 있어서, 「분화」란 당 분야에 있어서 통상(通常) 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 특수화의 정도가 낮은 세포가, 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포 등의 보다 특수화한 세포로 변화하는 프로세스를 의미한다. 「분화하였다」 또는 「분화하고 있다」는, 상대적인 용어이고, 「분화한 세포」 또는 「분화 세포」는, 그것이 비교되어 있는 세포보다도 발생 경로의 한층 더 앞으로 진행되고, 보다 특수화되어 있는 것을 의미한다.
본 개시에 있어서, 「간세포」란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 단일 세포 레벨에 있어서 자기 복제 능력을 가지고, 또한 2종 이상의 다른 분화 세포를 산생(産生)하는 능력을 가지는 미분화 세포를 의미한다. 즉, 간세포는, 비대칭적으로 분열할 수 있고, 그 때 일방(一方)의 낭세포는 간세포 상태를 보지(保持)하고, 타방(他方)의 낭세포는 어떤 별개의 다른 특정의 생물학적 기능 및 표현형을 발현한다. 혹은, 간세포는, 2개의 간세포로 대칭적으로 분열할 수 있고, 따라서, 간세포를 가지는 세포 집단 중에는, 몇 개의 간세포가 유지되고, 한편, 집단 중의 다른 세포는 분화된 후대만을 생기게 한다.
본 개시에 있어서, 「조혈 간세포」란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 모든 혈구(적혈구, 백혈구, 및 혈소판 등)에 최종적으로 분화할 수 있는 다분화능을 가지는 세포를 의미한다. 조혈 간세포는, 전구 세포 혹은 아세포로의 분화의 중간 단계를 포함할 수 있다. 「전구 세포」 혹은 「아세포」는, 본 개시에 있어서 교환 가능하게 사용되고, 저하한 분화능을 가지지만, 특정의 계열(예를 들어, 골수 계통 혹은 림프액 계통)이 다른 세포로 더욱 성숙하는 능력이 있는, 성숙하고 있는 세포를 의미한다.
본 개시에 있어서, 「장기 조혈 간세포」란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 세포 분열을 거쳐도 자기 복제능을 장기로 유지하는 조혈 간세포를 의미한다. 장기 조혈 간세포로부터 세포 분열에 의하여 만들어내어지는 2개의 낭세포의 적어도 일방은, 분열 전의 세포와 마찬가지의 조혈 간세포의 형질을 유지한다. 일 태양에 있어서, 장기 조혈 간세포는 생체 내의 통상의 배양 환경 또는 생체 외의 배양 환경에 있어서, 세포 분열에 의하여 자기 복제능을 전혀 잃지 않는다. 또한, 일 태양에 있어서, 장기 조혈 간세포는 100회, 50회, 20회 또는 10회의 세포 분열을 거쳐도, 자기 복제능을 유지한다.
당해 자기 복제능이 유지되어 있는 것은, 다양한 공지의 방법에 의하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 일정 기간 배양한 후의 세포군에 포함되는 미분화 세포 집단의 함유율을 측정하는 것으로, 자기 복제능이 유지되어 있는 것을 확인할 수 있다. 미분화 세포 집단은, 예를 들어 세포 표면에 발현하는 공지의 마커의 양성·음성의 조합에 의하여 동정할 수 있다. 또한, 일 태양에 있어서, 조혈 간세포가 세포 분열을 거쳐도 자기 복제능을 장기로 유지하고 있는 것은, 골수 재구축능을 장기로 유지하는 것에 의하여도 확인할 수 있다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포는 공지의 이식법에 있어서, 1차 이식 레시피엔트에 있어서 골수 재구축을 유지하는 것 외에, 특히 바람직한 태양에 있어서는 2차 이식에 있어서도 골수를 재구축할 수 있다. 단기간밖에 자기 복제능을 유지하지 않는 조혈 간세포는, in vitro 또는 1차 이식에서는 골수를 재구축할 수 있지만, 1차 이식 레시피엔트에 있어서 골수 재구축을 유지할 수 없고, 또한 2차 이식에서는 골수를 재구축 유지할 수 없다. 여기서, 2차 이식이란, 1차 이식에 의하여 재구축된 골수 유래의 조혈 간세포를, 한층 더 다른 개체에 이식하는 것을 의미한다. 일 태양에 있어서, 조혈 간세포가 세포 분열을 거쳐도 자기 복제능을 장기로 유지하고 있는 것은, 당해 세포를 다른 생체에 이식하였을 경우에, 4일간, 5일간, 6일간, 7일간, 8일간, 9일간, 또는 10일간 이상에 걸쳐 계속하여 혈액을 산생하고, 전형적으로는, 백혈구의 일종인 호중구를 상기 기간에 걸쳐 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개/μL(mm3) 이상 산생하는 것에 의하여 확인할 수 있다.
본 개시의 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포는, 다양한 동물 유래의 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를 포함한다. 예를 들어, 각종 포유동물, 영장류에 속하는 동물, 원숭이목에 속하는 동물, 또는 인간 유래의 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를, 본 개시에 대하여 사용할 수 있고, 또는, 이것들의 세포에 본 개시를 적용할 수 있다. 또한, 본 개시의 조혈 간세포는, 생체로부터 얻어지는 체세포 집단으로부터 단리할 수 있는 것 외에, ES 세포 또는 인공 다능성 간세포로부터 분화 유도된 세포군으로부터 단리할 수 있다.
본 개시에 있어서 「단리된 세포」란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 그것이 본래 찾아내지는 생물로부터 꺼내진 세포 또는 그와 같은 세포의 자손을 의미한다. 이와 같은 세포는, 인 비트로(in vitro)이고, 예를 들어 다른 세포의 존재 하에서 배양된 것이어도 무방하다. 또한, 이와 같은 세포 혹은 그 자손인 세포는, 후에, 제2 생물로 도입되어도 무방하다.
본 개시에 있어서 「단리된 세포 집단」이란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 불균질한 세포 집단으로부터 꺼내지고 분리된 세포의 집단을 의미한다. 몇 가지의 태양에 있어서, 단리된 집단은, 세포를 단리하거나 또는 농축하는 근원이 된 불균질 세포 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 세포 집단이어도 무방하고, 또한, 여전히 불균질한 세포 집단이어도 무방하다.
세포 집단이 특정의 세포종에 관하여 「실질적으로 순수」하다는 것은 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 당해 세포 집단에 있어서, 세포 집단 전체를 구성하는 세포에 대하여 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 92%, 93%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 세포가, 당해 특정의 세포종의 세포로부터 구성되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 「실질적으로 순수」한 간세포 집단이란, 간세포가 아닌 세포를 약 50% 미만, 보다 바람직하게는 약 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만 포함하는 세포의 집단을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 본 개시에 있어서의 단리된 조혈 간세포란, 본 개시에 의하여 특정되는 마커에 의하여 동정되는 세포를 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 92%, 93%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 포함하는 세포 집단이어도 무방하다.
본 개시에 있어서 「농축」 또는 「부화(富化)」란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 복수의 생물, 세포, 물질, 데이터를 함유하는 집단에 있어서, 목적으로 하는 어떤 특정의 성질을 가지는 생물, 세포, 물질, 데이터 등의 함유 비율을 증가시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포를 농축하기 위한 마커란, 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 당해 마커에 의하여 2개의 획분으로 분획하였을 경우, 어느 하나의 획분에 장기 조혈 간세포가 치우쳐 존재하는 것을 의미한다.
본 개시에 있어서 「동정」, 「분리」, 「선별」, 「단리」, 「순화」 또는 「스크리닝」이란 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 목적으로 하는 어떤 특정의 성질을 가지는 생물, 세포, 물질, 데이터 등의 표적을, 특정의 조작/평가 방법으로 다수를 포함하는 집단 중에서 선별하는 것을 말한다. 선별된 표적은, 집단으로부터 물리적으로 분리되어도 무방하고, 분리되지 않아도 무방하다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포를 단리하기 위한 마커란, 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 당해 마커에 의하여 2개의 획분으로 분획하였을 경우, 어느 하나의 획분에 장기 조혈 간세포가 일정 정도 이상 치우쳐 존재하고, 다른 획분에 존재하는 장기 조혈 간세포가 일정 정도 이하가 되는 것을 의미한다. 예를 들어 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 획분 A 및 B로 분획하였을 경우에, 획분 A에 존재하는 장기 조혈 간세포/(획분 A에 존재하는 장기 조혈 간세포＋획분 B에 존재하는 장기 조혈 간세포)×2의 값이, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8 이상이 되는 것을 의미한다.
본 개시에 있어서, 장기 조혈 간세포의 「증식을 촉진한다」는 것은 당 분야에 있어서 통상 이용되는 의미를 가지고, 전형적으로는, 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간을 단축하는 것, 장기 조혈 간세포의 세포수를 증가시키는 것, 또는 장기 조혈 간세포와 다른 세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 증식에 수반하는 장기 조혈 간세포의 함유 비율 저하를 억제하고, 또는 당해 함유 비율을 유지 혹은 증가시키는 것을 의미한다.
1. 본 개시의 조혈 간세포 마커
일반적으로 생체의 각종 세포는, 각 유전자로부터 발현되는 단백질의 세포 내 함량, 세포 표면에 노출되는 단백질의 종류, 단백질의 번역 후 수식의 상태, 세포 형태 등의 다양한 물리적 특성에 있어서 고유의 상태를 가지고 있고, 이것들의 물리적 특성의 조합에 의하여, 고유의 생물학적 기능을 가지는 세포를 특정하는 것이 가능하다. 이것들의 물리적 특성은 공지의 각종 방법에 의하여 일정한 기준에 기초하여 정량화하는 것이 가능하고, 따라서, 일정한 생물학적 기능을 가지는 각종 세포는, 그 정량 물리적 특성에 관한 수치 데이터의 조합으로 특정할 수 있다. 나아가, 당해 정량 물리적 특성 데이터의 조합과, 생물학적 특성에 관한 분석으로부터 얻어진 수치 데이터를 조합하는 것에 의하여, 보다 상세하게 세포를 특정할 수 있다.
한편, 세포 분화는 계층성을 가지고 있고, 세포 분화 계층 중에 있어서 보다 근연의 세포는, 그 정량 물리적 특성 데이터에 있어서도 보다 유사하다고 이해된다.
따라서, 정량 물리적 특성에 관한 수치 데이터 및/또는 생물학적 특성에 관한 수치 데이터로부터 선택되는 복수의 수치 데이터의 유사성에 기초하여 세포 배치 공간 구조를 생성하는 것에 의하여, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조를 얻을 수 있다. 그리고, 기지(旣知)의 분화 마커 등을 이용하는 것에 의하여, 당해 세포 배치 공간 구조 상의 분화 방향을 특정할 수 있다.
한편, 이와 같이 구성된 세포 배치 공간 구조에 있어서, 기지의 분화 마커 등을 이용하여 특정의 분화 단계의 세포가 존재하는 영역을 특정하는 것에 의하여, 당해 분화 단계의 세포를 특정하기 위한 물리적 특성의 수치 데이터 및/또는 생물학적 특정의 수치 데이터의 범위의 조합이 얻어진다.
본 개시의 발명자들은, 당해 구성된 세포 배치 공간 구조를 이용한 분석을 이용하고, 한층 더 1세포 레벨에서의 세포 기능 해석을 조합하는 것에 의하여, 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포를 특정하는 마커 분자의 조합을 극히 신속하고 또한 고정도(高精度)로 특정하는 것에 성공하였다.
본 개시의 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포는, 소망하는 정도(精度)에 따라, 상기 마커를 이용하여 다양하게 농축하거나 또는 단리할 수 있다. 일례에 있어서, 본 개시의 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포는, 단일의 마커 분자의 발현량에 의하여 농축하거나 또는 단리할 수 있고, 다른 예에 있어서, 복수의 마커 분자의 발현량의 조합에 의하여, 농축하거나 또는 단리할 수 있다. 본 개시에 있어서, 특정의 마커 분자의 발현량에 의하여 세포를 분획하는 경우, 발현량이 일정 이하의 획분을, 당해 마커 분자의 발현에 관하여 「음성」의 획분, 발현량이 일정 이상 획분을, 당해 마커 분자의 발현에 관하여 「양성」의 획분이라고 하는 일이 있다. 「음성」 「양성」을 구별하는 역치는, 사용하는 기기, 작업의 목적 등에 따라, 통상 당업자에 의하여 결정된다. 일 태양에 있어서, 한층 더 상세한 발현량의 차이에 기초하여 세포를 분획할 수 있고, 예를 들어, 「양성」 획분을 한층 더 마커 분자의 발현량 중, 보다 발현량이 적은 획분을 「약양성」의 획분, 보다 발현량이 적은 획분을 「강양성」의 획분으로서 구별할 수 있다. 장기 조혈 간세포는, 단일의 마커 분자의 발현량이 「음성」, 「양성」, 「약양성」, 「강양성」 또는 한층 더 상세한 범위에서 분류되는 것에 기초하여, 혹은, 복수의 마커 분자의 분류의 조합에 기초하여 농축되거나 또는 단리된다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포는, CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합을, 장기 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커로서 사용하는 것으로 단리되거나 또는 농축된다.
또한, 다른 태양에 있어서, 본 개시의 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포는, CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상을, 장기 조혈 간세포 단리 마커로서 사용하는 것으로 단리된다. 특히, CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합을 장기 조혈 간세포 단리 마커로서 이용하는 것으로, 극히 높은 순도로 장기 조혈 간세포를 단리하는 것이 가능하게 된다.
또한, 다른 태양에 있어서, 본 개시의 보다 미분화된 세포 특성을 가지는 장기 조혈 간세포는, 상기 유전자 발현 양식의 조합에 더하여, CD84(＋), CD111(＋), CD150(－), GPR56(－), Notch-1(－), CD52(－), CD62L(＋), CD71(＋), CD93(－), CD122(－), CD133(－), CD275(－), CD131(－), CD326(＋), CD200(－), CD200R(－), CD324(＋), CD40(－), CD11c(－), CD318(－)로부터 선택되는 1개 이상을 조합하는 것으로, 보다 높은 순도로 장기 조혈 간세포를 농축하는 것이 가능하게 된다.
바람직하게는, 추가하여 조합되는 유전자 발현 양식은, CD111(＋), CD133(－), CD131(－), CD93(－), CD122(－), CD200(－), CD324(＋)로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 추가하여 조합되는 유전자 발현 양식은, CD111(＋), CD133(－), CD131(－)로부터 선택된다.
본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하기 위한 마커 또는 농축하기 위한 마커를 사용하는 경우, 미리 처리 대상의 세포 집단으로부터, 분화한 세포를 배제하여도 무방하다. 당해 분화한 세포를 배제하기 위하여, 일반적으로 Lineage 마커라고 불리는 분화한 세포를 특이적으로 동정하는 마커를 사용할 수 있다. 예를 들어, Lineage 마커로서 CD11b, CD14, CD19, CD20, CD235ab, CD3, CD4, CD56, CD8a의 조합을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
상기 마커 분자의 검출 대상으로서는, 당해 마커 분자를 코드하는 유전자의 다양한 산물을 사용할 수 있다. 일 태양에 있어서, 검출 대상으로서 세포 표면에 발현되는 마커 분자를 사용한다. 다른 비한정적인 예로서, 유전자로부터 전사되는 mRNA 혹은 그 전구체, 당해 mRNA로부터 번역되는 펩티드, 단백질, 또는 이것들의 중간 산물, 단편, 수식물 등을 사용할 수 있다.
본 개시의 조혈 간세포를 특정하기 위하여 사용되는 유전자 산물은, 상기에 구체적으로 설명한 유전자의 유전자 산물에 한정되는 것은 아니다. 본 개시의 조혈 간세포를 한층 더 분류하기 위하여, 1개 이상의 추가의 유전자 산물의 발현, 또는 불발현을 지표로서 이용할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 조합의 일부는, 다른 유전자에 의하여 대체할 수 있다. 그와 같은 유전자는, 상기 유전자의 조합에 포함되는 유전자의 발현 패턴과 기능적 혹은 통계상 유사하고 있는 유전자로부터 선택할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 본 개시의 조혈 간세포에 있어서의 유전자 발현 상태를 분석하는 것으로, 상위 추가 또는 대체의 유전자를 특정할 수도 있다.
일 태양에 있어서, 본 개시는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의, 장기 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커로서의 사용을 제공한다. 일 태양에 있어서, 본 개시는 CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의, 장기 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커로서의 사용을 제공한다.
또한, 다른 태양에 있어서, 상기 유전자 발현 양식의 조합에 더하여, CD84(＋), CD111(＋), CD150(－), GPR56(－), Notch-1(－), CD52(－), CD62L(＋), CD71(＋), CD93(－), CD122(－), CD133(－), CD275(－), CD131(－), CD326(＋), CD200(－), CD200R(－), CD324(＋), CD40(－), CD11c(－), CD318(－)로부터 선택되는 1개 이상을 장기 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커로서 조합하는 것으로, 보다 높은 순도로 장기 조혈 간세포를 농축하는 것이 가능하게 된다.
바람직하게는, 추가하여 조합되는 유전자 발현 양식은, CD111(＋), CD133(－), CD131(－), CD93(－), CD122(－), CD200(－), CD324(＋)로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 추가하여 조합되는 유전자 발현 양식은, CD111(＋), CD133(－), CD131(－)로부터 선택된다.
2. 본 개시의 장기 조혈 간세포
본 개시는 또한, 보다 미분화된 세포 특성을 가지는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단을 제공한다. 일 태양에 있어서, 이와 같은 조혈 간세포 또는 세포 집단은, CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식에 의하여 특정된다. 일 태양에 있어서, 이와 같은 조혈 간세포 또는 세포 집단은, CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의 발현 양식에 의하여 특정된다. 전형적으로는, 당해 세포 또는 세포 집단은, 세포 표면 단백질로서 상기 분자를 발현하고 있거나 또는 발현하고 있지 않다. 다른 비한정적인 예로서, 당해 세포 또는 세포 집단은, 유전자로부터 전사되는 mRNA 혹은 그 전구체, 당해 mRNA로부터 번역되는 펩티드, 단백질, 또는 이것들의 중간 산물, 단편, 수식물 등으로서, 상기 분자를 발현하고 있다.
3. 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현 양식에 기초하여, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.
일례에 있어서, 상기 방법은, 본 개시에 있어서 발견된 장기 조혈 간세포를 특정하는 마커 분자의 세포 표면 발현에 기초하여, 플로 사이토미터에 연결된 셀 소터를 동작시키는 것에 의하여 실시할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
4. 장기 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가하는 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 관하여, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여, 장기 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가하는 방법을 제공한다. 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 당해 세포 집단에 포함되는 세포에 관하여, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량을 측정하고, 당해 발현량을 대상 샘플에 있어서의 마커 분자의 발현량과 비교하고, 혹은, 상기 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물의 다른 시점에 있어서의 마커 분자의 발현량과 비교하는 것에 의하여, 장기 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가한다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
당해 마커 분자의 발현량은, 당업자에게 공지의 방법을 이용하여 행하는 것이 가능하고, 예를 들어 플로 사이토미터나 항체 패널 등을 이용하여 행할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
5. 조혈 간세포 함유 조성물의 성질을 시험하거나 또는 평가하는 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 관하여, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여, 당해 세포 조성물의 성질을 시험하거나 또는 평가하는 방법을 제공한다. 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 당해 세포 집단에 포함되는 세포에 관하여, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량을 측정하고, 당해 발현량을 대조 샘플에 있어서의 마커 분자의 발현량과 비교하는 것에 의하여, 세포 조성물의 성질을 시험하거나 또는 평가한다. 당해 대조 샘플은, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로 시험에 의하여 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단으로서의 성질이 확인된 샘플이어도 무방하고, 시험 또는 평가 대상의 세포 집단의 다른 시간점에 있어서의 샘플이어도 무방하다.
예를 들어 당해 세포 조성물은 조혈 간세포 이식에 이용하는 검체, 예를 들어 제대혈, 골수액, 말초혈 함유 조성물이어도 무방하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 세포의 배양 전후, 일정 기간의 보존 전후의 세포 조성물에 관하여, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량을 지표로 하여, 배양 전후 또는 보존 전후의 세포 집단에 있어서, 장기 조혈 간세포로서의 성질이 어느 정도 변화하고 있는지 또는 변화하고 있지 않는지를 시험하거나 또는 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 조혈 간세포 함유 조성물의 성질은 일정한 기준에 따라 평가되는 품질이어도 무방하고, 예를 들어, 조혈능 유지 능력, 이식 적합성, 또는 보존 안정성이라고 하는 품질을 평가할 수 있다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량을 지표로 하여, 장기 조혈 간세포를 함유하는 피험 이식용 조성물과, 이식으로의 적합성이 확인되어 있는 표준 조성물을 비교하는 것에 의하여, 피험 이식용 조성물의 이식 적합성을 시험하거나 또는 평가할 수 있다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하고, 제대혈, 골수 세포, 말초혈 등을 배양하는 것으로 얻어진 세포 조성물이어도 무방하지만 이것들에 한정되지 않는다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
당해 마커 분자의 발현량은, 당업자에게 공지의 방법을 이용하여 행하는 것이 가능하고, 예를 들어 플로 사이토미터나 항체 패널 등을 이용하여 행할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
6. 피험자의 질환 예후 예상 또는 건강 상황 예상을 위하여, 조혈 간세포 함유 조성물을 시험하는 방법
본 개시는, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여, 피험자의 질환 예후 예상 또는 건강 상황 예상을 위하여, 조혈 간세포 함유 조성물을 시험하는 방법을 제공한다. 전형적으로는, 환자 또는 정상인으로부터 취득된 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 관하여, 혹은, 환자 또는 정상인 체내의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 관하여, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량을 측정하고, 당해 측정된 발현량을 지표로 하여, 피험자의 질환 예후 또는 장래의 건강 상황을 예상한다. 예를 들어, 환자의 예후 예측 또는 치료 효과의 확인을 위하여, 치료 전 및 치료 후의 환자로부터 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 취득하고, 장기 조혈 간세포의 비율의 증감을 시험하고, 장기 조혈 간세포의 비율이 증가하고 있을 때, 혹은 감소가 억제되어 있을 때에, 환자의 양호한 예후를 예측할 수 있다. 다른 태양에 있어서, 생체 유래 조혈 간세포 함유 조성물을 타가 이식하는 것으로 치료를 행하는 경우에, 환자의 예후 예상을 위하여, 도너 체내의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 도너로부터 얻어진 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 이식 전 혹은 이식 후의 환자 체내의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는, 환자로부터 얻어진 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 시험할 수도 있다. 다른 태양에 있어서, 환자 또는 정상인으로부터 취득된 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 관하여, 환자 또는 정상인의 건강 상태, 예를 들어 조혈계에 있어서의 건강 상태의 파악, 또는 장래의 건강 상황의 예측을 위하여, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자의 발현량 시험할 수 있다.
상기 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단으로서, 골수 조직, 제대혈, 말초혈 등 임의의 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단을 사용할 수 있다. 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
당해 마커 분자의 발현량은, 당업자에게 공지의 방법을 이용하여 행하는 것이 가능하고, 예를 들어 플로 사이토미터나 항체 패널 등을 이용하여 행할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
7. 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 집단을 수식하는 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 수식하는 방법을 제공한다. 당해 수식은, 상기 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 각종 분화 유도하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정의 배양 조건에 의한 배양, 특정의 약제 또는 약제의 조합에 의한 처리, 게놈 편집, 유전자 도입, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 등의 세포 내 도입, 다른 세포와의 융합 등의 처리에 의하여, 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단을 수식할 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다. 당해 배양 조건은, 배지의 조성, 배지 조성의 변경, 배지에 포함되는 특정의 첨가물, 첨가물의 첨가 방법, 배양 온도 또는 그 변경 양식, 배양 습도 또는 그 변경 양식, 대기압 또는 그 변경 양식, 배양 용기의 구조 혹은 소재 또는 그것들의 변경 양식, 배양 기반의 구조 혹은 소재 또는 그것들의 변경 양식 등을 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 당해 약제는, 무기 화합물, 유기 저분자 화합물, 고분자 화합물, 단백질, 핵산을 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 상기 게놈 편집은 당업자에게 공지의 방법에 의한 것을 포함하고, 예를 들어, CRISPR-Cas계, TALEN계 등을 이용한 게놈 편집 기술을 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단이 수식된 것은, 세포 표면에 발현하는 분자의 종류 또는 양의 변화, 세포 내에서 전사되는 유전자의 종류 또는 양의 변화, 세포의 게놈 염기 배열의 변화, 또는, 이것들에 수반하는 세포 형태, 기능의 변화 등에 의하여 확인할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 수식 후의 세포 표면에 발현하는 임의의 분자 또는 세포 내에서 전사되는 유전자의 종류 또는 양이, 수식 전의 것과 비하여 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상 다른 경우에, 당해 세포가 수식된 세포로 할 수 있다. 또한, 당해 유전자 도입은 당업자에게 공지의 방법에 의한 것을 포함하고, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입 기술, 전기 천공법을 이용한 유전자 도입법 등 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 또한, 당해 다른 세포와의 융합은 당업자에게 공지의 방법에 의한 것을 포함하고, 융합하는 세포는, 인간 또는 영장류의 체세포, ES 세포, 인공 다능성 간세포 또는 Muse 세포 등 체세포 집단으로부터 특정의 방법으로 단리된 다능성 간세포 등을 사용할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 당해 수식된 세포 집단은, 세포의 분화 메커니즘 등을 연구하기 위한 시료로서 이용할 수 있는 것 외에, 그 특성에 맞추어, 다양한 용도로 사용할 수 있다. 일례에 있어서, 환자의 생체 조직으로부터 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하고, 당해 세포에 대하여 게놈 편집 또는 벡터에 의한 유전자 도입 등에 의하여, 유전자의 도입 혹은 결손, 발현량의 조정 등의 수식을 행한 후에, 기능이 수식된 장기 조혈 간세포로서 환자 체내로 되돌리는 것에 의하여, 질환 치료 등에 이용할 수 있다. 또한, 다른 예에 있어서, 생체 내에 존재하는 장기 조혈 간세포를 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 동정하고, 게놈 편집이나 유전자 도입에 의하여 당해 세포에 대하여 생체 내에서 유전자의 도입 혹은 결손, 발현량의 조정 등의 수식을 더하는 것에 의하여, 기능이 부가되거나 또는 개편된 장기 조혈 간세포를 생기게 하는 것에 의한, 질환 치료 혹은 건강 유지, 증진 방법 등을 제공한다. 일 태양에 있어서, 이것들 세포의 수식은, 항상적인 것이어도 무방하고, 일시적인 것이어도 무방하다. 예를 들어, 체내의 특정의 부위에 있어서, 특정의 기간만 세포를 수식하는 것이어도 무방하다.
8. 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 집단을 분석하는 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단을 분석하고, 당해 세포 집단의 물리적, 화학적 또는 생물학적 특징에 관한 정보를 얻는 방법을 제공한다. 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징은, 당업자에게 공지의 방법을 이용하는 것에 의하여 평가, 분석할 수 있다. 얻어진 정보는, 예를 들어 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징 또는 이것들의 조합에 기초하여 장기 조혈 간세포 함유 세포 집단을 특정하기 위한 방법에 사용할 수 있다.
9. 장기 조혈 간세포의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징에 기초하여, 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하기 위한 분류기를 작성하는 방법
일례에 있어서, 상기의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징은, 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 방법을 개발할 때의 양성 대조로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 세포의 생물학적 특징, 예를 들어 특정의 화학 물질에 대한 증식 응답 등의 특징에만 기초하여 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 경우에, 당해 방법에 의하여 단리되거나 또는 농축된 세포 또는 세포 집단의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징과, 본 개시의 마커를 이용하여 얻어진 조혈 간세포의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징을 비교하는 것에 의하여, 당해 생물학적 특징에 기초하는 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 방법을 평가 또는 특징지울 수 있다. 이와 같은 평가, 특징짓기를 통하여, 일 태양에 있어서, 본 개시의 마커를 이용하여 얻어진 조혈 간세포의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징을 지표로 하여 조혈 간세포를 동정하고, 조혈 간세포를 함유하는 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
10. 장기 조혈 간세포의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징에 기초하여, 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하기 위한 분류기를 작성하는 방법
상기의 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징은, 일례에 있어서, 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하기 위한 분류기를 작성하기 위하여 사용된다. 예를 들어, 분류기를 기계 학습에 의하여 구성하는 경우, 본 개시의 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포로부터 얻은 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징 또는 이것들의 조합 또는 그 일부를, 기계 학습을 위한 교사 데이터로서 사용할 수 있다.
11. 장기 조혈 간세포를 이용하여 피험 물질 또는 환경 요인의 조혈 간세포에 대한 생리 작용을 평가하는 방법
본 개시는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포를 이용하여, 화합물 및 약제 등의 피험 물질, 또는 온도 및 영양 조건 등의 환경 요인이 조혈 간세포에 미치는 생리 작용을 평가하는 방법을 제공한다.
당해 방법에서는, 본 개시의 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포와, 화합물, 약제 등의 피험 물질을 공지의 방법에 의하여 접촉시키고, 또는, 온도 및 영양 조건 등의 환경 요인이 세포에 초래하는 생리 작용, 예를 들어, 세포 기능의 변화, 증식 상태의 변화, 생존에 주는 영향 등을 평가한다.
12. 장기 조혈 간세포의 증식에 대한 배양 조건의 영향을 평가하는 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포의 증식에 대한 배양 조건의 영향을, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여 평가하는 방법을 제공한다. 본 개시의 평가 방법에서는, 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 평가 대상의 배양 조건에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하고, 배양 후의 세포 집단에 있어서의 본 개시의 장기 조혈 간세포를 특정하는 마커 분자의 발현량을 시험하는 공정을 포함하고, 평가 대상의 배양 조건에 있어서의 배양 전후의 상기 마커 분자의 발현량을 비교, 또는, 평가 대상의 배양 조건에 있어서의 배양 후의 상기 마커 분자의 발현량과, 대조가 되는 배양 조건에 있어서의 배양 후의 상기 마커 분자의 발현량을 비교한다. 비교의 결과, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되어 있었을 경우에, 당해 평가 대상 배양 조건을, 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진하는 배양 조건으로서 평가하고, 배양 조건의 변경 후에 있어서 장기 조혈 간세포의 증식이 억제되어 있었을 경우에, 당해 평가 대상 배양 조건을, 장기 조혈 간세포의 증식을 억제하는 배양 조건으로서 평가한다.
장기 조혈 간세포가 특이적으로 수식되었는지 여부를 평가하는 방법은 한정되지 않고, 당업자는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간이 단축되거나 또는 연장되는 것, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 세포수가 증가하는 것, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 함유 비율이 감소하거나, 유지하거나 또는 증가하는 것, 등의 결과가 얻어졌을 경우에, 장기 조혈 간세포가 특이적으로 수식되었다고 평가한다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
세포의 배양 조건을 구성하는 인자로서는, 당 분야에 있어서 통상 고려되는 인자를 평가 대상으로 할 수 있고, 예를 들어, 배지 성분, 온도, 습도, 대기 구성, 배양 기질 등을 변경하여 시험할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
13. 장기 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물의 스크리닝 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여 장기 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 개시의 스크리닝 방법에서는, 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 후보 화합물에 의하여 처리한 세포 또는 세포 집단과, 미처리의 세포 또는 세포 집단을 비교하고, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물을 취득한다. 예를 들어, 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간을 단축하거나 또는 연장하는 화합물, 장기 조혈 간세포의 세포수를 증가시키는 화합물, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 장기 조혈 간세포의 함유 비율을, 감소시키거나, 유지시키거나 또는 증가시키는 화합물, 장기 조혈 간세포의 생존 기간을 연장하거나 또는 단축하는 화합물, 장기 조혈 간세포의 세포사를 억제하거나 또는 촉진하는 화합물, 장기 조혈 간세포의 수식(유전자 도입, 게놈 편집, 약제 처리 효율 등)을 촉진하거나 또는 억제하는 화합물, 장기 조혈 간세포를 특정의 세포종으로 분화시키는 화합물, 특정의 세포종으로의 분화를 억제하는 화합물, 장기 조혈 간세포의 분화를 억제하거나 또는 촉진하는 화합물, 특정의 세포종으로의 분화를 억제하는 화합물 등을 취득할 수 있다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
14. 장기 조혈 간세포를 유도하는 화합물의 스크리닝 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여, 장기 조혈 간세포를 유도하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 개시의 스크리닝 방법에서는, 전형적으로는, 장기 조혈 간세포 이외의 세포를 준비하고, 상기 세포 또는 세포 집단을 후보 화합물에 의하여 처리하고, 처리 후의 세포 또는 세포 집단에 있어서의, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커를 지표로 하여, 장기 조혈 간세포를 유도하는 화합물을 취득한다. 장기 조혈 간세포 이외의 세포로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 생체 유래의 세포, 인공적으로 다능성을 획득한 세포, 유전자 도입 등의 수식을 받은 세포 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, ES 세포, iPS 세포 등의 인공적으로 다능성을 획득한 세포 등을 이용할 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다.
상기 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
15. 장기 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 배지
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여 장기 조혈 간세포의 특성을 특이적으로 수식하는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물의 제조 방법 및 당해 방법에 의하여 제조된 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제공한다. 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 평가 대상의 구성을 가지는 배지, 또는 평가 대상의 배양 보조 첨가물을 포함하는 배지에 의하여, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하고, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여, 배양 조건 변경 전후의 세포의 증식 상태를 평가하고, 장기 조혈 간세포의 특성을 특이적으로 수식하는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물의 구성을 결정하고, 당해 구성을 가지는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조한다. 배양 배지 및 배양 보조 첨가물은 예를 들어 고체 또는 액체 조성물로서 구성된다. 배양 배지는 또한, 특정의 물리적 구조, 예를 들어, 형상, 소재, 용량 등을 그 구성에 포함할 수 있다.
장기 조혈 간세포의 특성이 특이적으로 수식되었는지 여부를 평가하는 방법은 한정되지 않고, 당업자는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간이 단축되거나 또는 연장되는 것, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 세포수가 증가하는 것, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 함유 비율이 감소하거나, 유지하거나 또는 증가하는 것, 등의 결과를 얻어졌을 경우에, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되었다고 평가한다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
16. 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키는 배양 방법
본 개시는, 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키는 배양 조건을, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 지표로 하여 조정하는 방법을 제공한다. 본 개시의 조정 방법에서는, 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 조정된 배양 조건에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하고, 상기 마커 분자를 지표로 하여, 배양 조건 변경 전후의 세포의 증식 상태를 평가하고, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되도록 배양 조건을 조정한다.
세포의 배양 조건을 구성하는 인자로서는, 당 분야에 있어서 통상 고려되는 인자를 평가 대상으로 할 수 있다. 예를 들어, 배지 성분, 배양 보조 첨가물, 온도, 습도, 대기 구성, 배양 기질의 형상, 소재, 표면 처리, 배양 용기의 용량, 형상, 소재, 표면 처리, 배양 용기, 배지, 또는 세포 자체에 더하는 물리적 자극, 이것들의 경시적(經時的)인 변경 등을 인자로서 평가할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되었는지 여부를 평가하는 방법은 한정되지 않고, 당업자는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간이 단축되는 것, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 세포수가 증가하는 것, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 함유 비율이 유지하거나 또는 증가하는 것, 등의 결과가 얻어졌을 경우에, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되었다고 평가한다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
17. 조정된 배양 조건을 이용하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법
본 개시는, 본 개시의 장기 조혈 간세포 단리 또는 농축 마커 분자를 지표로 하여 배양 조건을 조정하는 공정을 포함하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법을 제공한다. 전형적으로는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하고, 미리 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키도록 조정된 배양 조건, 예를 들어, 상기의 배양 조건의 조정 방법에 의하여, 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키도록 조정되어 있는 배양 조건에 의하여, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 것으로, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 제조한다.
다른 태양에 있어서, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양할 때에, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 세포의 증식 상태를 모니터하고, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되도록 배양 조건을 조정하는 것으로, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 제조한다.
장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되었는지 여부를 평가하는 방법은 한정되지 않고, 당업자는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포가 세포 분열에 필요로 하는 시간이 단축되는 것, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 세포수가 증가하는 것, 장기 조혈 간세포를 함유하는 세포 조성물에 있어서, 본 개시의 마커 분자에 의하여 특정되는 장기 조혈 간세포의 함유 비율이 유지하거나 또는 증가하는 것, 등의 결과가 얻어졌을 경우에, 장기 조혈 간세포의 증식이 촉진되었다고 평가한다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
세포의 배양 조건을 구성하는 인자로서는, 당 분야에 있어서 통상 고려되는 인자를 평가 대상으로 할 수 있고, 예를 들어, 배지 성분, 온도, 습도, 대기 구성, 배양 기질 등을 변경하여 시험할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 일 태양에 있어서, 생체로부터 채취된 세포 집단의 배양 개시 시점으로부터, 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키도록 배양 조건을 조정하여도 무방하고, 또한, 일정 기간 장기 조혈 간세포의 배양에 관하여 최적화되어 있지 않은 조건으로 배양을 행한 후, 세포수가 일정 정도 증가한 후에 장기 조혈 간세포의 증식을 촉진시키도록 배양 조건을 조정하여도 무방하다.
또한 다른 태양에 있어서, 일정 기간의 배양 후에, 셀 소터 등 공지의 방법을 이용하여, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 분자 마커를 지표로 하여 세포를 선별하고, 한층 더 필요하면 조정된 배양 조건에 의한 배양을 계속할 수 있다. 배양 조건의 조정 공정 및 세포의 선별 공정은, 각각 다른 방법을 복수 조합할 수 있고, 또한, 같은 방법 혹은 다른 방법을 반복하여 적용할 수 있다.
18. 세포에 장기 조혈 간세포의 특성을 부여하는 유전자 개변을 동정하는 방법.
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커를 지표로 하여, 세포에 장기 조혈 간세포의 특성을 부여하는 유전자 개변 방법을 제공한다. 전형적으로는, 시험하는 세포의 일부에 관하여, 후보 유전자를 개변한 유전자 개변 세포를 준비하고, 상기 유전자 개변 세포에 있어서의 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커와, 유전자 개변을 행하지 않은 세포에 있어서의 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커를 비교한다. 또한, 다른 태양에 있어서, 동일 세포에 있어서의 유전자 개변 전후에 있어서의 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커를 비교한다. 비교의 결과, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 관하여 보다 양성의 결과를 주는 유전자 개변을, 세포에 장기 조혈 간세포의 특성을 부여하는 유전자 개변으로서 동정한다.
상기 유전자 개변은, 당업자에게 공지의 다양한 방법에 의하여 행할 수 있고, 예를 들어, 핵산 또는 다른 벡터를 이용한 항구적 또는 일과성의 유전자 도입, 게놈 편집에 의한 게놈 상의 유전자 또는 유전자 발현을 제어하는 인자의 결실(缺失), 추가, 변이(變異) 등을 이용할 수 있다. 당해 변이는 유전자 또는 유전자 발현을 제어하는 인자를 구성하는 염기 배열에 있어서의 염기의 결실, 추가, 치환 등을 포함하지만 이것들에 한정되지 않는다.
상기 유전자 개편되는 세포는, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커를 시험하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
19. 장기 조혈 간세포를 동정하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 동정하거나, 단리하거나 또는 농축하는 마커 분자를 정량하거나 또는 검출하는 시약을 포함하는, 장기 조혈 간세포를 동정하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다. 마커 분자를 정량하거나 또는 검출하는 시약으로서는, 당 분야에 있어서 통상 이용되는 시약을 이용할 수 있고, 예를 들어 형광 색소로 표지(標識)된 항체, 핵산, 저분자 화합물, 고분자 화합물 등을 이용할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 본 개시의 장기 조혈 간세포를 동정하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트는, 생체로부터 채취된 세포 집단에 있어서, 장기 조혈 간세포를 동정하거나, 단리하거나 또는 농축하는데 이용할 수 있는 것 외에, 생체 내에 있어서, 장기 조혈 간세포를 동정하기 위한 조성물 또는 키트를 포함한다. 장기 조혈 간세포를 동정하기 위한 조성물 또는 키트는, 한층 더 장기 조혈 간세포의 기능을 수식하기 위한 약제 등을 포함할 수 있고, 장기 조혈 간세포의 기능을 수식하는 것으로 치료되는 질환의 치료약, 혹은, 치료 방법을 제공한다.
20. 장기 조혈 간세포 또는 이것을 수식하여 얻어지는 세포를 포함하는 의약
본 개시는, 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포, 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포를 함유하는, 환자에게 투여하는 것에 의하여 질환을 치료하기 위한 의약, 질환 예비군으로의 선제 의료에 이용하는 의약, 혹은 정상인에 대한 예방 의료 혹은 건강 유지(개선)에 이용하는 의약 또는 당해 의약을 이용하는 치료법 또는 요법을 제공한다. 본 개시의 장기 조혈 간세포 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포를 의약으로서 사용하는 경우, 환자 유래의 세포 집단으로부터 얻은 장기 조혈 간세포 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포를 당해 환자에게 투여하여도 무방하고, 다른 제공자 유래의 세포 집단으로부터 얻은 장기 조혈 간세포 또는 이것을 수식하여 얻어지는 각종 세포를 당해 환자에게 투여하여도 무방하다. 또한, 다른 약제, 또는 치료 방법을 병용할 수 있다. 예를 들어, 환자 또는 제공자로부터, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포, 혹은, 환자 또는 제공자로부터 얻어진 체세포로부터 생성된 인공 다능화 세포로부터 유도된 조혈 간세포 함유 세포 집단으로부터, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포를, 조혈 장해를 가지는 환자에게, 당해 장해를 치료하기 위한 의약으로서 투여할 수 있다. 다른 예로서, 환자의 생체 조직으로부터, 인공 다능화 공정을 거쳐, 또는 거치지 않고 얻어진 조혈 간세포 함유 세포 집단으로부터, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하고, 당해 장기 조혈 간세포에 치료에 유익한 유전자의 도입, 게놈 편집 등의 수식을 행한 후에, 질환을 치료하기 위한 의약으로서 환자에게 투여할 수 있다.
상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단은, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커 분자의 발현량을 측정하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
상기 장기 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해로서는, 예를 들어, 만성 육아종증(CGD), 부신백질디스트로피(ALD), 이염성 백질디스트로피(MLD), 고셔병, 파브리병, 뮤코다당증, HIV, ADA-SCID, X-SCID, 탈라세미아가 포함되지만, 이것들에 한정되지 않는다.
상기 유전자 개변 세포의 제조는, 당업자에게 공지의 다양한 방법에 의하여 행할 수 있고, 예를 들어, 핵산 또는 다른 벡터를 이용한 항구적 또는 일과성의 유전자 도입, 게놈 편집에 의한 게놈 상의 유전자 또는 유전자 발현을 제어하는 인자의 결실, 추가, 변이 등을 이용할 수 있다. 당해 변이는 유전자 또는 유전자 발현을 제어하는 인자를 구성하는 염기 배열에 있어서의 염기의 결실, 추가, 치환 등을 포함하지만 이것들에 한정되지 않는다.
상기 유전자 개편되는 세포는, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포여도 무방하다. 또한, 마커를 시험하는 세포는, 세포 집단에 포함되는 세포 전부 또는 일부여도 무방하다.
실시예
이하에 실시예를 이용하여 본 개시를 보다 상세하게 설명하지만, 이것들 실시예는 설명을 위한 예시이고, 본 개시는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
방법과 재료
(1) 세포 소스
제대혈로서, 신선 제대혈(코베 시리츠 이료 센터 츄오 시민 뵤인(Kobe City Medical Center General Hospital), 및 아다치 뵤인(ADACHI HOSPITAL)(코베시)에서 제공)을 사용하였다. 골수액으로서, 동결 세포, 인간 골수 CD34＋전구 세포, 2M-101A(Lonza Group AG, Basel, Switzerland)를 사용하였다. 말초혈로서, 동결 세포, Mobilized 인간 말초혈 CD34＋조혈 간세포, 포지티브 선택, 4Y-101C(Lonza Group AG, Basel, Switzerland)를 사용하였다.
(2) 유핵 세포의 회수(적혈구의 제거)
상기로부터 얻어진 세포 소스를 이용하여, EasySep RBC Depletion Reagent(STEMCELL Technologies사제)를 이용하여 적혈구 제거, 농축 처리를 행하고, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 얻었다.
(3) CD34 양성 세포의 농축
상기에서 얻어진 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을, EASYSep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II(STEMCELL Technologies사제)를 이용하여, CD34 양성 세포 분획을 조정제(粗精製)하였다.
(4) 세포 염색
상기에서 얻어진 조혈 간세포 및 전구 세포를 농축한 세포 집단(CD34 양성 농축 세포 분획)에 대하여, 이하의 항체를 더하여 세포 염색을 행하였다. 항체에 의한 세포 염색은 빙상에서 30분간 인큐베이트로 행하였다. CD11b, CD14, CD19, CD20, CD235ab, CD3, CD4, CD56, CD8a, CD34, CD38, CD90, CD45RA, CD49f 및 LEGENDScreen Human PE Kit(BioLegend사제)에 포함되는 항체.
(5) 세포 해석 및 세포 소트
세포 염색 후의 샘플을, 셀 스트레이너가 달린 FACS 튜브(FALCON사제)를 이용하여 여과한 후, 죽음 세포 염색을 행하였다. 사세포 염색은, Propidium Iodide Solution(BioLegend사제), SYTOX-Red(ThermoFisher SCIENTIFIC사제) 등을 이용하였다. 세포의 해석 및 소트는, FACSAria II 혹은 III(BD사제)을 사용하였다. 채취된 데이터는, FlowJo(BD사제), 혹은 출원인이 개발한 알고리즘(PCT/JP2019/051270, PCT/JP2020/025915 등에도 개시)을 이용하여 해석하였다. 덧붙여, 당해 알고리즘은, 세포 염색 등에 의하여 얻어지는 정량 물리적 특성에 관한 수치 데이터 및/또는 생물학적 특성에 관한 수치 데이터로부터 선택되는 복수의 수치 데이터의 유사성에 기초하여, 세포 배치 공간 구조를 생성하는 것에 의하여, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조를 생성하고, 기지의 분화 마커 등을 이용하는 것에 의하여, 당해 세포 배치 공간 구조 상의 분화 방향을 특정하는 알고리즘이다.
(6) CFU 어세이
세포 염색의 해석 결과로부터, 장기 조혈 간세포를 포함한다고 생각되는 후보 분획을 특정하고, MethoCult H4435 Enriched(STEMCELL Technologies사제) 25ul를 각 웰에 파종한 96웰 플레이트에 1세포씩 소트를 행하였다. 세포 소트를 행한 웰에 대하여, Iscove′s MDM with 2% FBS(STEMCELL Technologies사제)를 12.5ul 첨가하였다. 플레이트의 최외의 웰에는 건조 방지로 멸균수를 200ul 첨가하였다. 그 후, 세포는 CO2 인큐베이터에서, 37℃, 5% CO2의 조건으로 2주간 배양하고, 형성된 콜로니는 광학 현미경(KEYENCE사제)으로 촬상(撮像)하고, 콜로니수를 육안으로 카운트하고, 콜로니 형태를 육안으로 판별하였다. 콜로니의 형태로부터, 골수계 전구 세포 유래의 Colony Formation Unit-Granulocyte, Erythroid, Macrophage, Megakaryocyte(CFU-GEMM) 및, 적아구 버스트 콜로니 형성 세포 Burst Forming Unit-Erythroid(BFU-E), 과립구·매크로파지 콜로니 형성 세포 Colony Formationg Unit-Granulocyte, Macrophage(CFU-GM)를 판별하여 카운트하였다.
(7) 면역 부전 마우스로의 이식 실험
신선 혹은 배양 후의 세포를 하기 방법으로, 면역 부전 마우스로 이식을 행하고, 조혈능을 평가하였다. BD FACSAria III으로 소트한 세포 분획을 2.5Gy 방사선 조사한 NOG 마우스(NOD/Shi-scid, IL-2RyKO Jic)에 꼬리 정맥 혹은 골수 내 투여하였다. 이식 후, 4주간마다 말초혈 혹은 골수 세포를 채취하고, 필요에 따라 Lysing Buffer(BD사제)를 이용하여 적혈구를 파쇄한 후, FACS Canto로 도너 유래 키메리즘을 측정하였다. 세포 염색에 하기에 대한 항체를 이용하였다: 인간 CD56, 인간 CD3, 인간 CD16, 인간 CD19, 인간 CD14, 인간 CD45, 마우스 Gr-1, 마우스 CD45, 사세포 염색에는 Propidium Iodide Solution(BioLegend사제)을 이용하였다.
(8) 세포 배양
200ul의 IMDM(GIBCO사제), 1% Insulin-Transferrin-Selenium_Ethanolamine(ITS-X)(Gibco사제), 1% Penicillin-Streeptomycin-Glutamin)(Gibco사제), 50ng/ml human Stem Cell Factor(PeproTech사제), human Thrombopoietin(PeproTech사제)을 첨가한 U 바닥 96웰 플레이트(CORNING사제)에, FACSAria III을 이용하여 후보 세포 분획 300세포/웰이 되도록 소트하였다. 소트한 세포는, CO2 인큐베이터에서, 37℃, 5% CO2의 조건으로 1주간 배양하였다. 배양 후, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD235ab, CD3, CD4, CD56, CD8a, CD34, CD38, CD117, CD48을 마커로서, 생세포수, CD34＋CD117＋분획수, CD34＋CD117CD48-분획수, CD34＋CD117＋CD48＋수, 생세포율, CD34＋CD117＋분획율, CD34＋CD117CD48-분획율, CD34＋CD117＋CD48＋율 등을, FlowJo(BD)를 이용하여 해석하였다. CD34＋CD117CD48-분획은, 장기 조혈 간세포를 주로 하는 분획이다.
(9) 유전자 도입
리포터 유전자를 포함하는 렌티바이러스 Lenti-LabelerTM virus(후나코시(Funakoshi Co., Ltd.)사제)를 이용하여 감염 실험을 행하였다. 레트로넥틴(Clontech사제)으로 코팅 한 96웰 플레이트(CORNING사제)에 1×10e8IFU/ml의 타이터를 가지는 바이러스액을 첨가하고, 바이러스가 코팅된 플레이트를 제작한다. 각 웰에 후보 세포 분획보다 1000세포 이상 소트하여 파종한다. IMDM/5ng/ml SCF/5ng/ml TPO/1% Pen/St/Glu 200ul 중에서 24시간 감염시킨다. 감염시킨 세포는, 그 후 세포 배양, CFU 어세이, 이식 실험 등을 행한다.
실시예 1: 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조의 생성
생체로부터 얻어진 신선 제대혈에 대하여 적혈구 제거, 농축 처리를 행하고, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 얻었다. 당해 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 대하여, EASYSep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II(STEMCELL Technologies사제)를 이용하여 CD34 양성 세포 분획을 조정제하였다. 당해 CD34 양성 세포 분획에 관하여, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD235ab, CD3, CD4, CD56, CD8a, CD34, CD38, CD90, CD45RA, CD49f 및 LEGENDScreen Human PE Kit(BioLegend사제)에 포함되는 항체를 이용하여 사세포 염색을 행하고, 각 세포에 관하여, 각 항체의 염색 강도를 정량화하였다. 당해 정량화 데이터를 이용하여, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조를 생성하였다. 당해 구조의 일부를 가시화한 것을 도 1, 도 2에 예시한다. 도 1은, 사세포 염색 후, 생세포의 위치를, 정량화 데이터의 조합으로부터 생성된 합성축 1, 합성축 2, 합성축 3으로 이루어지는 3차원 공간에 할당한 것을 2차원 화상으로서 도시한 것이다. 도 2는, 당해 공간 구조에 위치를 할당된 각 세포에 관하여, 조혈 간세포에 있어서 특징적인 발현 양식을 나타내는 것이 알려진 CD34의 발현량을 가시화한 것이다. CD34 양성의 세포는, 당해 공간 구조의 일부에 편재하고 있다.
실시예 2: 장기 조혈 간세포와 CD34의 발현 양식의 관련
장기 조혈 간세포와 CD34의 발현 양식의 관련을 조사하기 위하여, 인간 제대혈로부터 분리된 CD3(－) CD34(－)(CD3 음성, CD34 음성) 세포 또는 CD3(－) CD34(＋)(CD3 음성, CD34 양성) 세포를 면역 부전 마우스에 이식하고, 이식 후의 키메라율을 시험하였다. 이식 후 4주간, 8주간 및 12주일 후에 키메라율을 시험하였는데, CD3(－) CD34(＋) 세포는 CD3(－) CD34(－) 세포에 비하여, 현저하게 높은 생존율 및 키메라율을 나타내었다. 결과를 도 3에 도시한다. 덧붙여, 각 마커의 음성, 양성의 구분은, 사용한 BD FACSAria III의 세포 소트 결과에 따랐다. 본 결과는, 장기 조혈 간세포와 CD34(＋)의 발현 양식이 관련하고 있는 것을 나타내고 있다.
분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조에 있어서의, CD34(＋) 획분의 세포 배치를 보다 상세하게 분석하기 위하여, CD34(＋) 획분을 전개하는데 적합한 합성축을 이용하여 생성한 공간 내에, CD34(＋) 획분의 세포를 배치하였다. 일례를 도 4에 도시한다.
종전, 인간 장기 조혈 간세포는 CD38(－)의 획분에 존재하는 것이 보고되어 있고, 인간 장기 조혈 간세포를 특정하기 위한 마커 세트로서, CD34(＋), CD38(－), CD45RA(－) 및 CD90(＋)로 이루어지는 마커 세트 등이 제안되어 왔다(Science, 2011, Vol333, pp. 218-221, Cell Stem Cell, 2007년, Vol.1, pp.635-645).
그래서 다시 CD34(＋) 획분에 있어서의 CD38(＋) 및 CD38(－) 획분의 미분화 특성을 확인하였다. 구체적으로는, CD38(＋)인 획분 P6(CD34(＋), CD38(＋)), 종래 제안된 CD38(－) 획분에 관계하는 획분 P7(CD34(＋), CD38(－), CD45RA(－), CD90(＋)), 획분 P8(CD34(＋), CD38(－), CD45RA(－), CD90(－)), 및 획분 P9(CD34(＋), CD38(－), CD45RA(＋) 및 CD90(－))에 관하여, CFU 어세이를 행하고, 각각의 획분에 있어서의 조혈 간세포의 증식·분화능을 시험하였다. 그 결과, 종래 제안된 CD38(－) 마커에 의하여 획분되는 P7 및 P9는, 극히 낮은 조혈 간세포의 증식·분화능을 나타내었다(도 5). 한편, CD38(＋)인 획분 P6의 세포도 높은 조혈 간세포의 증식·분화능을 나타낸 것으로부터, 종래 보고된 CD34(＋), CD38(－) 획분 뿐만 아니라, CD34(＋) 획분 전체에 장기 조혈 간세포가 분포하는 것이 이해되었다. 따라서, CD34(＋) 획분에 존재하는 장기 조혈 간세포를 단리, 농축할 수 있는 새로운 마커의 탐색을 할 필요가 인정되었다.
실시예 3: 1세포 레벨에서의 세포 기능 해석
인간 장기 조혈 간세포를 특정하기 위한 마커로 특정되는 세포의 미분화성을 확인하기 위하여, 1세포 레벨로 CFU 어세이를 행하였다. 일례를 도 6에 도시한다. 당해 1세포 레벨에서의 세포 기능 해석 결과를, 인덱스 소트 분석과 조합하는 것에 의하여, 각 1세포의 미분화성과 각 마커의 발현 양식을 서로 연결시키는 것이 가능하게 된다. 당해 분석에 의하여 얻어진 마커와 미분화 특성의 관련을, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조 상에 배치하는 것에 의하여, 당해 세포 배치 공간 구조 상의 세포 분화 방향을 확정하였다. CD34 양성 세포를 대상으로, 당해 분석을 행한 결과의 일례를 도 7에 도시한다.
실시예 4: 장기 조혈 간세포를 농축하거나 또는 단리하기 위한 마커
CD34 양성 세포에 관하여, 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조 상 확정된 분화 방향을 따라 발현이 편재하는 분자 마커를 특정하였다. 일례를 도 8에 도시한다. 보다 미분화 방향으로 편재하여 발현하는 마커 분자, 보다 분화 방향으로 편재하여 발현하는 마커 분자를 특정하였다.
이것들의 마커에 의하여 특정되는 세포의 조혈 간세포의 증식·분화능을 CFU 어세이에 의하여 확인하였는데, 이것들 마커에 의하여 특정되는 세포는, 대조(CD34(＋) 세포)보다도 높은 조혈 간세포의 증식·분화능을 나타내었다(도 9).
이것들 마커는 하기를 포함하고 있었다.
CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD18, CD244, CD275, CD328, CD48, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD105, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD92, CD318, CD49f, c-Kit, CD34
덧붙여, 실시예 2에서 확인한 대로, CD34(－) 획분에는 장기 조혈 간세포는 거의 존재하지 않기 때문에, CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단에 있어서 장기 조혈 간세포를 농축하는 상기 마커는, CD34(＋)로 예비 농축되어 있지 않은 세포 집단에 적용하였을 경우에도, 각각 단독으로 장기 조혈 간세포를 농축하기 위한 마커로서 이용할 수 있다.
실시예 5: 장기 조혈 간세포를 보다 상세하게 특정하기 위한 마커
상기 특정된 마커 중, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)의 조합으로 이루어지는 마커로 특정되는 세포의 특성을 보다 상세하게 분석하였다.
제대혈로부터 CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단을, c-Kit(＋) 및 CD34(＋)로 게이팅하고(획분 P1), 한층 더 CD48(－)로 게이팅(획분 P2)하였을 때의 FACS 플롯의 일례를 도 10에 도시한다. 획분 P1 중, 대부분의 세포는 CD48(＋)로 획분(획분 non-P2)되고, 일부만이 P2로 획분되었다.
또한, 골수 세포 샘플을 이용하여 마찬가지의 분획을 행하였는데, 제대혈 샘플과 극히 매우 유사한 획분 패턴을 나타내었다(도 11). 동원 말초혈 샘플에서도 마찬가지로, 제대혈 샘플과 극히 매우 유사한 획분 패턴을 나타내었다(도 12).
제대혈 1ml에 포함되는 CD34 양성 분획과 P2 획분의 세포수를 비교한 결과를 도 12에 도시한다. P2 획분으로 분획되는 세포는, CD34(＋)로 예비 농축된 세포 집단의 극히 일부인 것이 확인된다. 덧붙여, 제대혈의 대부분은 CD34(－)이기 때문에, 제대혈 샘플 전체 중에 있어서의 P2 획분의 세포의 비율은 극히 낮은 것에 유의해야 한다.
c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)로 특정되는 세포 획분(P2)과, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(＋)로 특정되는 세포 획분(non-P2)의 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교하였다. 그 결과, P2 획분은 극히 높은 조혈 간세포의 증식·분화능을 가지고 있는 것이 확인되었다(도 14).
세포 획분 P2와 세포 획분 non-P2의 미분화성을, 이식 시험에 의하여 비교하였다. 방사선 조사 후 12시간 혹은 24시간 후에 세포 이식을 행하고, 이식 후 20주째의 시점에서의 골수 중의 인간 혈액 세포(human CD45 양성 세포)에 있어서의 키메라율, 및 인간 과립구 세포(hGra)에 있어서의 키메라율을 시험하였는데, 어느 결과도 세포 획분 P2가 극히 높은 키메라율을 나타내는 것이 확인되었다(도 15).
골수 세포 샘플 및 동원 말초혈 샘플을 이용하여, 상기와 마찬가지로 c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)로 특정되는 세포 획분(P2)과, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(＋)로 특정되는 세포 획분(non-P2)을 취득하고, 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교하였다. 그 결과, P2 획분은 극히 높은 조혈 간세포의 증식·분화능을 가지고 있는 것이 확인되었다. 골수 세포 샘플의 결과를 도 16에, 동원 말초혈 샘플의 도 17에 도시한다. c-Kit(＋), CD34(＋)로 특정되는 획분인 P1 획분의 결과도 아울러 도시하였다.
본 결과는, c-Kit(＋), CD34(＋), CD48(－)의 조합으로 이루어지는 마커를 이용하는 것으로, 장기 조혈 간세포를 극히 효율적으로 농축하고, 혹은 단리할 수 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 도 10 및 11의 좌측의 플롯에 도시되는 바와 같이, CD34(＋) 분획의 세포의 대부분은 c-Kit(＋)였다. 또한, 도 5에 도시한 바와 같이, 장기 조혈 간세포는 CD34(＋)의 획분으로 선택적으로 분획되는 것으로부터, c-Kit(＋)의 마커는 CD34(＋)의 마커와 마찬가지로 장기 조혈 간세포를 농축할 수 있는 것이 이해된다.
실제로, 제대혈 샘플에 관하여 CD34(＋) 획분을 c-Kit(＋) 획분과 c-Kit(－) 획분으로 분획하고, 각각에 관하여 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교하였는데, c-Kit(＋) 획분은 CD34(＋) 획분과 거의 마찬가지의 조혈 간세포의 증식·분화능을 나타낸 것에 대하여, c-Kit(－) 획분은 조혈 간세포의 증식·분화능을 거의 나타내지 않았다(도 18). 따라서, CD48(－)와 CD34(＋)의 조합, CD48(－)와 c-Kit(＋)의 조합으로 이루어지는 마커도, 장기 조혈 간세포를 효율적으로 농축하고, 혹은 단리할 수 있는 마커로서 사용할 수 있는 것이 이해된다.
실시예 6: 추가적인 마커
상기 분화 계통 상 근접한 위치에 있는 세포가 근접한 위치를 차지하는 세포 배치 공간 구조를 이용한 분석에 의하여, P2 획분을 한층 더 상세하게 획분하기 위한 추가적인 마커를 특정하였다. 구체적으로는, 상기 분석에 있어서 분화 방향 또는 미분화 방향으로 편재하는 마커를 후보로 하고, 동(同) 마커의 발현량에 기초하여 P2 획분의 세포를 피험 획분과 대조 획분으로 2분하고, 각각의 획분의 조혈 간세포의 증식·분화능을, CFU 어세이에 의하여 비교하였다.
얻어진 결과로부터, 피험 획분에 장기 조혈 간세포가 농축되는 효율을 이하의 식에 의하여 정량화하였다.
농축 배율=피험 획분으로부터 생긴 콜로니 중 CFU-GEMM이 차지하는 비율/대조 획분으로부터 생긴 콜로니 중 CFU-GEMM이 차지하는 비율
피험 획분과 대조 획분으로부터 생긴 콜로니 중 CFU-GEMM이 차지하는 비율이 동일한 경우, 농축 배율은 1이 된다.
상기 분석 결과를 도 19에 도시한다. 덧붙여, 각 마커의 (＋) (－)는, 상기 P2를 2분하였을 때에 비교적 발현량이 많은 쪽을 (＋), 적은 쪽을 (－)로 하여 도시한 것이고, 셀 소터가 제시하는 음성, 양성 등과는 다른 의미를 가지는 것에 유의해야 한다.
이것들 추가적인 마커는 이하를 포함한다.
CD84(＋), CD111(＋), CD150(－), GPR56(－), Notch-1(－), CD52(－), CD62L(＋), CD71(＋), CD93(－), CD122(－), CD133(－), CD275(－), CD131(－), CD326(＋), CD200(－), CD200R(－), CD324(＋), CD40(－), CD11c(－), CD318(－).
실시예 7: 체외 배양 후의 장기 조혈 간세포의 마커에 의한 특정
본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커가, 체외 배양 후의 장기 조혈 간세포를 동정할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 시험을 행하였다. 조혈 간세포의 증식을 촉진하는 것이 알려진 화합물 UM171을 이용하여 배양한 세포 집단에 관하여, c-Kit(＋), CD34(＋) 및 CD48(－)의 마커 세트로 동정되는 세포의 비율을 시험하였다. P2 획분 또는 non-P2 획분에 포함되는 300세포에 관하여, UM171 첨가 또는 비첨가의 조건으로 배양하고, 7일 후의 총 세포수 및 미분화 세포(P1)의 비율을 시험하였다. P2 획분의 결과를 도 20에, non-P2 획분의 결과를 도 21에 도시한다. 본 시험에 의하여, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커는, 체외 배양 후의 장기 조혈 간세포를 동정할 수 있는 것이 이해된다. 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커가, 체외 배양 후의 장기 조혈 간세포를 동정할 수 있는 것은, 한층 더 CFU 어세이 등의 기능 시험에 의하여도 확인할 수 있다. 제대혈 샘플로부터 c-Kit(＋), CD34(＋) 및 CD48(－)의 마커 세트로 분획한 P2 획분의 세포를 7일간 배양한 후, 배양 후의 세포 집단을 c-Kit(＋), CD34(＋) 및 CD48(－)의 마커 세트를 이용하여 P2 획분(배양 후) 및 non-P2 획분(배양 후)으로 분획하고, 각각에 관하여, CFU 어세이를 행하였다. 그 결과, 배양 후 세포 집단 중은 모두 P2 획분(배양 후)으로 분획되고, non-P2 획분(배양 후)으로 분획되는 세포는 확인되지 않았다. P2 획분(배양 후)에 관하여 CFU 어세이를 행하였는데, P2 획분(배양 후)으로부터는 배양 전의 P2 획분과 마찬가지로, 미분화 세포(CFU-GEMM 세포)의 높은 함유 비율이 확인되었다(도 22).
이것들의 결과는, 본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커가, 체외 배양 후의 장기 조혈 간세포를 동정할 수 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 8: 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포에 대한 유전자 도입
본 개시의 장기 조혈 간세포를 단리하거나 또는 농축하는 마커에 의하여 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포가, 유전자 도입 후도 장기 조혈 간세포의 특성을 유지하고 있는지 여부를 확인하기 위하여, CFU 어세이에 의한 기능 시험을 행한다. 구체적으로는, P2 획분, non-P2 획분, 또는 DC34 양성 획분에 포함되는 세포에 대하여, 렌티바이러스 벡터에 의하여 GFP 리포터 유전자를 유전자 도입하고, 이것들 유전자 도입된 세포에 관하여 CFU 어세이를 행하고, P2 획분 유래의 유전자 도입 세포가 증식·분화능을 유지하고 있는 것을 확인한다.
본 개시는, 장기 조혈 간세포, 장기 조혈 간세포의 단리 또는 농축 방법, 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법, 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 평가 방법, 단리되거나 또는 농축된 장기 조혈 간세포 또는 장기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 검출, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트, 장기 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물의 스크리닝 방법, 배양 조건의 평가, 조정 방법을 제공하고, 장기 조혈 간세포를 이용한 의약의 개발 등에 기여한다.

Claims (23)

  1. CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합으로 이루어지는, 조혈 간세포 단리(單離) 마커 또는 농축 마커.
  2. 제1항에 있어서,
    CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상으로 이루어지는, 조혈 간세포 단리 마커 또는 농축 마커.
  3. CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식에 의하여 특정되는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단.
  4. 제3항에 있어서,
    CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의 발현 양식에 의하여 특정되는, 단리된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포가 농축된 조혈 간세포 함유 세포 집단.
  5. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현 양식을 지표로 하여 세포를 단리하거나 또는 농축하는 공정
    을 포함하는, 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    CD48(－) 및 CD34(＋)의 조합, CD48(－) 및 c-Kit(＋)의 조합, 및 CD48(－), CD34(＋) 및 c-Kit(＋)의 조합으로부터 선택되는 1 이상의 발현 양식을 지표로 하는,
    단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 제조 방법.
  7. 수식을 더 포함하는, 제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정(同定)되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 제3항 또는 제4항에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 제5항 또는 제6항에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단.
  8. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    각 세포에 있어서의 각 세포의 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 측정하는 공정
    을 포함하는, 상기 세포 집단에 있어서의 조혈 간세포의 함유량 및/또는 함유량의 변화를 평가하는 방법.
  9. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD48, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 상기 세포 집단의 품질을 시험하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 품질이 조혈능 유지 능력, 이식 적합성, 또는 보존 안정성인, 시험 방법.
  11. 피험자 유래의 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단에 포함되는 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 취득하는 공정과,
    피험자의 질환 예후 예측 또는 건강 상황 예상을 위하여, 상기 마커의 발현량을 대조와 비교하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단의 시험 방법.
  12. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    후보 화합물에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 처리하는 공정과,
    후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 화합물의 스크리닝 방법.
  13. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    조정된 배양 조건에 의하여 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
    조정된 배양 조건에 의하여 배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여 배양 조건을 결정하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 조건의 조정 방법.
  14. 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 준비하는 공정과,
    평가 대상의 구성을 가지는 배지, 또는 평가 대상의 배양 보조 첨가물을 포함하는 배지에 의하여, 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 공정과,
    배양된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물의 구성을 결정하는 공정과,
    상기 결정된 구성을 가지는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포의 특성을 수식하는 배양 배지 또는 배양 보조 첨가물을 제조하는 방법.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단이, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포인, 방법.
  16. 상기 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단이, 생체 유래의 세포 또는 인공적으로 다능성을 획득한 세포로부터 유도된 세포인, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단.
  17. 세포 집단을 준비하는 공정과,
    피험 화합물에 의하여 세포 집단을 처리하는 공정과,
    후보 화합물에 의하여 처리된 세포에 발현하는 CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 마커의 발현량을 지표로 하여, 후보 화합물을 선택하는 공정
    을 포함하는, 조혈 간세포를 유도하는 화합물의 스크리닝 방법.
  18. CD10, CD111, CD112, CD131, CD143, CD244, CD275, CD328, CD62L, GPR56, CD133, CD36, CD370, CD84, CD326, CD114, CD116, CD135, CD172a/b, CD200, CD226, CD245, CD31, CD317, CD40, CD41, CD61, CD93, Notch1, CD352, Siglec-10, CD45RO, CD11c, CD52, CD318, CD49f, c-Kit 및 CD48로부터 선택되는 1 이상, 혹은, CD48 및 CD34의 조합, CD48 및 c-Kit의 조합, 및 CD48, CD34 및 c-Kit의 조합으로부터 선택되는 1 이상, 또는 이것들의 조합의 발현량을 정량 또는 검출하는 시약을 포함하는, 조혈 간세포를 동정하거나, 검출하거나, 단리하거나 또는 농축하기 위한 조성물 또는 키트.
  19. 제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 제5항 또는 제6항에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합을 특정하는 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 제5항 또는 제6항에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 분석하는 것으로 얻어진 물리적 특징, 화학적 특징, 생물학적 특징의 조합을 지표로 하여 조혈 간세포를 동정하는 분류기를 제조하는 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 기재된 마커에 의하여 동정되거나, 단리되거나, 또는 농축된 조혈 간세포, 또는, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단, 또는 제5항 또는 제6항에 기재된 방법으로 제조된 단리되거나 또는 농축된 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는, 조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해를 예방하거나 또는 치료하기 위한 의약.
  22. 제21항에 있어서,
    조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해가, 이염성 백질디스트로피(MLD), 고셔병, 파브리병, 뮤코다당증, HIV, ADA-SCID, X-SCID 또는 탈라세미아인, 의약.
  23. 제21항에 있어서,
    조혈 간세포를 투여하는 것으로 개선되거나 또는 예방되는 질환 또는 장해가, 만성 육아종증(CGD) 또는 부신백질디스트로피(ALD)인, 의약.
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