CN116064844A - 一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，属于分子生物学技术领域。本发明首次提出了灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变是灰茶尺蠖对联苯菊酯产生抗药性的分子标记，建立了快速检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性的分子标记方法。本发明特异性引物分别位于两个外显子区域，既可用于检测DNA模板，又可用于检测RNA模板。本发明所述标记的特异性强，稳定性高，可以快速区分灰茶尺蠖田间种群是否存在C3037T突变及该位点突变是否纯合，为灰茶尺蠖对拟除虫菊酯类的田间抗性提供一种快速的分子检测手段，同时为茶园合理使用杀虫剂提供科学依据。

Description

一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法。
背景技术
灰茶尺蠖隶属于鳞翅目尺蛾科，该虫适生区范围广，在我国各主要茶区均有分布。由于其食性强、繁殖速度快，经常在局部茶园暴发成灾，对茶叶产量、品质和茶园生态造成严重影响，也是茶园中主要的食叶性害虫。目前，化学防治是该害虫的主要防治方法。我国有效期内茶园用农药，联苯菊酯为登记数量最高的有效成分。联苯菊酯是一类新型拟除虫菊酯类农用杀虫剂品种，具有击倒作用强、广谱、高效、快速、长残效等特点，以触杀作用和胃毒作用为主，无内吸作用。由于该类药剂对鳞翅目害虫具有较强的杀虫活性，且多且对哺乳动物和非目标动物安全，因而在多个农业国家和地区的灰茶尺蠖防治中得到了广泛的应用。
在茶园害虫防治过程中合理选择农药产品并减量使用是非常必要的。同时，由于长期、大量不合理使用农药，导致昆虫产生严重的抗药性，进一步增加了该虫防治难度。因此，监测灰茶尺蠖的抗药性情况，并对灰茶尺蠖制定耐药性管理，指导茶园科学合理使用杀虫剂，对于控制茶园灰茶尺蠖暴发至关重要。然而，目前灰茶尺蠖抗药性检测一般采用传统的杀虫剂毒力测定方法。该法需要在田间采集大量的昆虫样品并在室内饲养后方可进行，该方法实施难度大、不易操作且所需周期长。因此，开发灵敏可靠的分子检测进行抗药性诊断是十分必要的。
联苯菊酯主要作用于昆虫的神经系统，通过延长电压门控钠离子通道基因(voltage gated sodium channel gene，VGSC)的开放，使靶标害虫兴奋、痉挛、麻痹而死亡。有研究报道，VGSC基因中许多位点存在单核苷酸多态性(SNP)，这些位点的非同义突变与拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的直接关系。目前还未有灰茶尺蠖VGSC基因抗性突变报道。
随着分子生物技术的发展及其广发应用，分子标记已被广泛使用，该方法也适用于抗性突变位点检测。找到灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性的分子标记，对于监测茶园灰茶尺蠖抗性水平和茶园害虫防治具有重要科学意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与联苯菊酯杀虫剂抗性相关的灰茶尺蠖分子标记。本发明的目的还在于提供用于扩增上述分子标记的引物，以及利用该引物检测上述分子标记的方法。
本发明中可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供了灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)VGSC基因C3037T突变作为分子标记在灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测中的应用。
本发明还提供了用于检测灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的试剂在制备灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测的试剂盒中的应用。
一种与联苯菊酯杀虫剂抗性相关的灰茶尺蠖分子标记，该分子标记位点位于如SEQ ID NO.1所示灰茶尺蠖电压门控钠离子通道基因cDNA序列的第3037位，该分子标记位点存在C→T突变，氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，位于如SEQ ID NO.2所示灰茶尺蠖电压门控钠离子通道基因氨基酸序列的第1013位。
本发明还提供了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的引物对，包括上游引物和下游引物，序列为：
上游引物：5’-ATTATGTGGACCGATTCCCTGAC-3’；
下游引物：5’-TTTACCAATATCTATGAGCAAGC-3’。
本发明还提供了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的试剂盒，包含所述引物对。
本发明还提供了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，包括以下步骤：
(1)提取灰茶尺蠖DNA或RNA模板，
(2)以步骤(1)所得灰茶尺蠖DNA或RNA模板作为PCR扩增模板，使用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，
(3)将步骤(2)PCR扩增产物进行测序，如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为C，则为野生型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为T，则为耐药型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列包含C和T两种，则为杂合型。该检测方法也适用于灰茶尺蠖RNA模板检测，制备灰茶尺蠖RNA模板；RNA模板反转录；PCR扩增：采用所述引物对在PCR扩增体系中对cDNA模板进行PCR扩增，获得所述VGSC基因的cDNA序列。
步骤(1)中提取灰茶尺蠖DNA的方法包括：
先将采集的灰茶尺蠖消毒和清洗，与裂解液混合研磨至灰茶尺蠖组织研磨充分；65℃金属浴消化60min。随后沸水浴10min使裂解液中的蛋白酶K失活；12000rpm离心1min，所获得的上清液即为灰茶尺蠖DNA；
所述裂解液组成为：10mmol/L Tirs，pH 8.4；50mmol/L KCl，0.45％Tween-20，0.2％Gelatin，0.45％NP 40，60μg/mL蛋白酶K。
步骤(2)中PCR扩增体系为20μl，包括：Kod Mix 10μl，待测DNA模板20ng，10μM正反向引物各0.8μl，ddH2O补足至20μl。
步骤(2)中PCR扩增程序为：预变性95℃ 1min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸3min。
步骤(3)中PCR产物克隆与测序分析方法具体包括以下步骤：
S1.对PCR产物进行纯化，得到纯化产物；
S2.将S1步骤中得到的纯化产物连接至载体pCE2 TA/Blunt-Zero vector，得到连接产物；
S3.将S2步骤中得到的连接产物通过热激法转化到感受态细胞中，得到转化细胞；
S4.将S3步骤中得到的转化细胞扩大培养，得到菌液；
S5.筛选阳性菌液克隆进行测序，并进行核苷酸突变分析。
本发明还提供了一种用于检测灰茶尺蠖种群对联苯菊酯抗性是敏感种群还是抗性种群的方法，对一定区域内的灰茶尺蠖采样，各样品分别使用所述方法检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性，根据检测结果计算该区域内灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的频率，突变频率越高且纯合突变越高表示该区域内灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性越强。
本发明的有益效果在于：
本发明首次提出了灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变(对应氨基酸突变为L1013F)是灰茶尺蠖对联苯菊酯产生抗药性的分子标记，建立了快速检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性的分子标记方法。本发明特异性引物分别位于两个外显子区域，既可用于检测DNA模板，又可用于检测RNA模板。本发明所述标记的特异性强，稳定性高，可以快速区分灰茶尺蠖田间种群是否存在C3037T突变及该位点突变是否纯合，为灰茶尺蠖对拟除虫菊酯类的田间抗性提供一种快速的分子检测手段，同时为茶园合理使用杀虫剂提供科学依据。
附图说明
图1为灰茶尺蠖电压门控钠离子通道蛋白L1013F突变位点示意图。I～IV：分别为电压门控钠离子通道蛋白四个跨膜结构，每个结构域包含1～6六个跨膜域(圆柱形表示)。星号表示突变位点。
图2为不同灰茶尺蠖种群DNA电泳图。ZJYQ：浙江乐清；ZJSX：浙江绍兴；HNNY：河南南阳；ZJJH：浙江金华；ZJJH(G4)：联苯菊酯连续三代后的浙江金华种群；M1和M2：DNAmarker
图3为与联苯菊酯杀虫剂抗性相关的灰茶尺蠖VGSC基因突变位点测序图谱；a.野生型和突变型灰茶尺蠖VGSC测序峰图比较，黑框标示为突变位点；b.不同种群VGSC基因测序结果。ZJYQ：浙江乐清；ZJSX：浙江绍兴；HNNY：河南南阳；ZJJH：浙江金华；ZJJH(G4)：联苯菊酯连续三代后的浙江金华种群。
具体实施方式
实施例1：灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测
敏感种群：室内敏感种群系为2018年在浙江乐清茶园采集，室内不接触药剂连续饲养30代以上，其对联苯菊酯的LC50值保持较低水平，为0.28mg/L。田间种群采集信息见表1。于室内用新鲜茶叶枝条饲养扩繁，饲养条件：温度28±1℃，相对湿度RH为60％，光周期为14L/10D。待灰茶尺蠖幼虫第2代(G1)孵化后，选择个体大小一致的3龄幼虫作为试虫。
表1供试灰茶尺蠖种群的来源
种群 采样地点(经纬度) 采集日期
浙江金华 E119°24′，N29°0′36″ 2021-08-13
浙江绍兴 E120°41′24″，N29°55′51.6″ 2021-05-11
河南南阳 E113°25′48″，N32°22′48″ 2021-05-13
采用浸叶法测定了联苯菊酯对不同地理种群灰茶尺蠖3龄幼虫的室内毒力。具体步骤如下：丙酮溶解，再用0.1％Triton X-100水溶液将联苯菊酯原药配制成母液，最后用水溶液分别稀释成0.16、0.8、4、20、100mg/L等5个系列浓度，混匀备用。0.1％Triton X-100水溶液作为空白对照。每个浓度设置3次重复，每个重复处理30头试虫。用清水将茶园采摘的新鲜茶树嫩梢冲洗干净，晾干备用。之后，将洁净晾干的嫩梢浸入药液中充分接触，取出后置于滤纸上晾干，放入干净培养盒，然后接入30头大小一致的3龄灰茶尺蠖幼虫，置于养虫室内饲养。24h后分别检查茶尺蠖存活情况，以毛笔轻触虫体不能正常活动即判断为死亡。对照死亡率低于10％为有效试验，若对照死亡率在10％以上，则需重复试验。以校正死亡率在5％～95％的浓度范围作为药剂的浓度范围，然后将供试药剂按等比级数稀释法配成5个系列浓度，供正式试验用。
结果如表2所示，与敏感种群相比，供试灰茶尺蠖已对联苯菊酯产生抗药性。浙江金华、河南南阳灰茶尺蠖种群对联苯菊酯的抗药性已达中等水平，抗性倍数分别为38.39倍、60.00倍。而浙江绍兴灰茶尺蠖种群抗性倍数(0.24倍)明显低于敏感品系，抗性水平极低。
在此基础上，以半致死浓度LC50为选择压力，对浙江金华灰茶尺蠖种群进行抗性筛选。筛选三代(G4)后，该种群对联苯菊酯抗性达到高抗水平(RR 224.25倍)，是第一代抗性倍数的4.2倍。
表2不同灰茶尺蠖种群对联苯菊酯的抗药性
种群 毒力回归方程 <![CDATA[LC<sub>50</sub>(mg/L)]]> χ2 95％置信区间 RR
浙江乐清 y＝0.61x+0.34 0.28 4.39 0.120-0.508 1.00
浙江绍兴 y＝0.70x+0.82 0.07 2.60 0.020-0.143 0.24
河南南阳 y＝1.30x-1.34 10.71 23.99 2.430-89.48 38.39
浙江金华 y＝1.36x-1.66 16.74 5.70 9.161-33.851 60.00
<![CDATA[浙江金华(G<sub>4</sub>)]]> y＝1.06x-1.90 62.79 13.58 19.25-344.103 224.25
实施例2：灰茶尺蠖联苯菊酯抗药性产生的分子标记筛选
通过人工查找，在灰茶尺蠖全基因组数据库中找到VGSC基因，野生型灰茶尺蠖VGSC基因CDS序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
利用二代测序技术对上述灰茶尺蠖不同种群进行全基因组重测序分析，对比参考基因组，用在参考基因组上有唯一比对位置的短序列鉴定候选SNP位点。使用最小等位基因型(MAF)大于5％作为参数过滤SNP。对获得的SNP数据进行同义突变和非同义突变分析，筛选发现在浙江金华及其G4代种群中检测到与联苯菊酯抗性相关的位点突变(表3)，突变位点(CTT→TTT)位于VGSC基因第3037位(18号外显子末端区域)，相应的氨基酸由1013亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)(图1)。可以看出，中低等抗性种群中该位点存在杂合子情况，且随着抗性程度的不断发展，该位点突变的频率增加，在高抗联苯菊酯种群中，该位点都为突变纯合子。
根据已知VGSC氨基酸结构分析，该实施案例中L1013F突变位于VGSC第二个结构域第六个跨膜结构上，研究表明该结构域形成的疏水性通道对于结合亲脂性拟除虫菊酯类杀虫剂起着非常重要的作用。
表3灰茶尺蠖VGSC第3037位核苷酸突变信息
ID 基因型
浙江乐清-1 C/C
浙江乐清-2 C/C
浙江乐清-3 C/C
浙江绍兴-1 C/C
浙江绍兴-2 C/T
浙江绍兴-3 C/C
浙江绍兴-1 T/T
河南南阳-2 C/C
河南南阳-3 C/T
浙江金华-1 T/T
浙江金华-2 T/T
浙江金华-3 C/T
浙江金华(G4)-1 T/T
浙江金华(G4)-2 T/T
浙江金华(G4)-3 T/T
实施例3：灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性检测
实施例2中得到不同地区茶园灰茶尺蠖，又根据上述案例中得到联苯菊酯抗性分子标记，选取目标基因3037位点上下游核苷酸序列，由于该位点位于第18号外显子区域末端，因此选取一段跨内含子区域片段进行扩增，其野生型VGSC基因片段DNA如SEQ ID No.3所示，突变型VGSC基因片段DNA序列如SEQ ID No.4所示。运用primer primer5引物设计软件，设计出能够快速克隆出包含突变区域碱基的特异性上下游引物，所述引物的正反向碱基序列如下：
上游引物：5’-ATTATGTGGACCGATTCCCTGAC-3’；
下游引物：5’-TTTACCAATATCTATGAGCAAGC-3’。
所述特异性引物分别位于两个外显子区域，既可用于检测DNA模板，又可用于检测RNA模板。对灰茶尺蠖进行联苯菊酯抗性检测：
1、制备灰茶尺蠖DNA模板
将采集的灰茶尺蠖(单头)置于1.5ml无核酶离心管中作为样本，加入1ml 75％酒精对虫体表面进行消毒，然后分别用1ml PBS清洗三次后，DNA：吸取300μL裂解液(10mmol/LTirs，pH 8.4；50mmol/L KCl，0.45％Tween-20，0.2％Gelatin，0.45％NP 40，60μg/mL蛋白酶K)使用电动匀浆机研磨至组织研磨充分。65℃金属浴消化60min。随后沸水浴10min使蛋白酶K失活。12000rpm离心1min，所获得上清用于凝胶电泳检测(图2)，并作为PCR扩增模板，或置于-20℃短期保存。
2、PCR扩增
PCR扩增体系为20μl，其中包含：Kod Mix 10μl，待测DNA模板1μl(约20ng)，正反向引物各0.8μl(10μM)，ddH2O7.4μl。
所述PCR扩增程序为：①预变性95℃ 1min。②PCR扩增：95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸3min，12℃保存。
3、PCR产物克隆与测序分析
1)产物纯化
产物纯化使用Vazyme公司生产的Gel DNA Extraction Mini Kit，方法如下：
a.短暂离心PCR产物，并转移至灭菌的1.5ml离心管中，用灭菌水补充至100μl。
b.加入5倍体积的Buffer GDP，颠倒或涡旋混匀。
c.将吸附柱套在收集管中。把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中。10000rpm离心30-60s。若混合液体积大于700μl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，弃滤液。
d.加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000rpm离心30-60s，弃滤液。
e.再次加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12000rpm离心30-60s，弃滤液。
f.12000rpm离心2min，弃滤液。
g.将吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μl Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12000rpm离心1min洗脱得到DNA溶液。
2)连接反应
克隆使用的载体为pCE2 TA/Blunt-Zero vector(Vazyme)。在微量离心管中配制反应体系：
5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix   1μl
PCR纯化产物                    1-4μl
ddH2O                          至5μl。
轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于离心管底，37℃反应5min。
3)转化
采取热激法进行转化。
a.从-80℃冰箱中取出感受态细胞立即置于冰上，融化约需要10min；
b.将5ul连接产物加入到100μl的感受态细胞中，并轻轻搅匀，15min冰浴；
c.42℃水浴，热激1min，取出置于冰上孵育10min；
d.加入600μl的无抗生素LB培养基，置于37℃摇床，180rpm，活化45-60min；
e.将适量体积的转化细胞涂在有相对应抗性的LB平板上，37℃倒置培养10-11h过夜；
4)扩大培养
分别挑取8个单菌落于1000μl无抗生素LB液体培养基中，置于37℃摇床，250rpm扩大培养约1h，以菌液浑浊为准。
5)阳性克隆测序及突变分析
PCR检测菌液阳性克隆后，将菌液送于浙江尚亚生物技术有限公司进行测序。利用Bioedit软件对测序数据进行比对，结果如图3所示，在浙江乐清、浙江绍兴、河南南阳的灰茶尺蠖种群中未检测到突变位点，在浙江金华及其G4代种群中均检测到CTT→TTT突变。

Claims (10)

1.灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)VGSC基因C3037T突变作为分子标记在灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测中的应用。
2.用于检测灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的试剂在制备灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为：
上游引物：5’-ATTATGTGGACCGATTCCCTGAC-3’；
下游引物：5’-TTTACCAATATCTATGAGCAAGC-3’。
4.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述引物对。
5.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取灰茶尺蠖DNA或RNA模板，
(2)以步骤(1)所得灰茶尺蠖DNA或RNA模板作为PCR扩增模板，使用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，
(3)将步骤(2)PCR扩增产物进行测序，如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为C，则为野生型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为T，则为耐药型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列包含C和T两种，则为杂合型。
6.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(1)中提取灰茶尺蠖DNA的方法包括：
先将采集的灰茶尺蠖消毒和清洗，与裂解液混合研磨至灰茶尺蠖组织研磨充分；65℃金属浴消化60min。随后沸水浴10min使裂解液中的蛋白酶K失活；12000rpm离心1min，所获得的上清液即为灰茶尺蠖DNA；
所述裂解液组成为：10mmol/L Tirs，pH 8.4；50mmol/L KCl，0.45％Tween-20，0.2％Gelatin，0.45％NP 40，60μg/mL蛋白酶K。
7.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为20μl，包括：Kod Mix 10μl，待测DNA模板20ng，10μM正反向引物各0.8μl，ddH2O补足至20μl。
8.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增程序为：预变性95℃1min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸3min。
9.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR产物克隆与测序分析方法具体包括以下步骤：
S1.对PCR产物进行纯化，得到纯化产物；
S2.将S1步骤中得到的纯化产物连接至载体pCE2 TA/Blunt-Zerovector，得到连接产物；
S3.将S2步骤中得到的连接产物通过热激法转化到感受态细胞中，得到转化细胞；
S4.将S3步骤中得到的转化细胞扩大培养，得到菌液；
S5.筛选阳性菌液克隆进行测序，并进行核苷酸突变分析。
10.一种用于检测灰茶尺蠖种群对联苯菊酯抗性是敏感种群还是抗性种群的方法，其特征在于，对一定区域内的灰茶尺蠖采样，各样品分别使用权利要求5所述方法检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性，根据检测结果计算该区域内灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的频率，突变频率越高且纯合突变越高表示该区域内灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性越强。
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