CN116064817A - 与pbrm1基因突变相关的分子标记、探针、引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与PBRM1基因突变相关的分子标记、探针、引物及应用，适用于针对PBRM1基因c.G4643A突变型的多种检测。利用本发明所提供的分子标记及试剂，检测PBRM1基因突变型，可以从LACC患者中筛选出NACT反应较差患者进行个体化治疗，将铂类药物+紫杉醇治疗方案替换为PDL1/PD1免疫治疗方案、PARP/ATR抑制剂或者放化疗，避免患者无效治疗，防止延误患者治疗，从而提高患者生存质量。本发明应用于临床，可以使LACC患者受益，社会意义和经济价值显著。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地指一种与PBRM1基因突变相关的分子标记、探针、引物及应用。
背景技术
宫颈癌(cervical cancer，CC)是一种发病率高的女性生殖系统恶性肿瘤，对全球女性健康构成重大威胁。目前通过HPV疫苗的接种及宫颈癌早期筛查在宫颈癌的发生及发展过程中进行了干预，以提高患者的生存率和生存质量。宫颈癌根治性手术是早期宫颈癌的主要治疗方法，而对于局部晚期宫颈癌(locally advanced cervical cancer,LACC)患者，新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NACT)是LACC患者综合治疗的重要部分。患者对NACT的反应性是影响生存的重要因素，部分对NACT反应较差的患者不仅要承受无效的治疗，还面临着NACT期间疾病进展的风险。
基因突变在肿瘤的发生发展中起到重要作用，多种基因突变会影响肿瘤对化疗的反应性。然而，对于基因突变对LACC的NACT反应性影响较少，大量NACT耐药相关基因仍未被鉴定。确定LACC的耐药相关基因突变并进行检测有助于为患者选取合适的宫颈癌治疗手段，更好提高LACC患者的生存质量
PBRM1突变是肾透明细胞癌中第二高突变基因，与肾透明细胞癌的发生及发展有着密切关系。有多个研究报道PBRM1缺失的细胞有高复制水平，下调PBRM1会抑制肾透明细胞癌的增殖。有研究报道在胃性宫颈腺癌复发患者中出现PBRM1突变。PBRM1的突变虽然可能会导致铂紫杉醇耐药，但是有报道PBRM1突变肾透明细胞癌患者免疫治疗预后更好，且在PBRM1缺失细胞中，PARP抑制剂与ATR抑制剂能促进细胞合成致死。
发明内容
本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种与PBRM1基因突变相关的分子标记、探针、引物及应用，适用于针对PBRM1基因突变型的多种检测。
发明人通过前期研究对LACC患者ctDNA测序分析发现，在NACT反应性较差的患者的ctDNA中，PBRM1发生高频突变，PBRM1突变可能导致LACC患者NACT反应差。从中发明人发现了一种宫颈癌新辅助化疗耐药相关基因PBRM1的突变基因，有4个突变。本申请中所示出的c.G4643A突变是指在野生型PBRM1基因的cDNA上第4643位G碱基突变为A碱基。
为方便查看，将c.G4643A突变对应野生型(野生型序列NCBI数据库编号为NCBIReference Sequemce:NM_001350075)发生突变部分的DNA序列提供如下(SEQ ID NO.1)，框出碱基即为发生点突变位置，原G碱基突变为A碱基。
相应地，PBRM1基因的c.G4643A突变导致氨基酸改变，该氨基酸可以表示为p.R1548Q，代表相较于野生型PBRM1基因所代表的氨基酸，经过突变的多肽的第1548位氨基酸由精氨酸(R，Arg)变为谷氨酰胺(Q，Gln)。
为检测上述突变和实现本发明的目的，本发明提供了一种核酸分子标记，所述核酸分子标记包含序列A和/或其互补序列；所述序列A为DNA序列由SEQ ID No.1中15～30个核苷酸的任意序列的一个或多个组成，且任意一个序列必须包含SEQ ID No.1中第31位到第44位的14个碱基。
上述方案中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2和/或其互补序列所示。
本发明还提供了上述的核酸分子标记在制备PBRM1基因突变检测试剂中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种PBRM1基因突变检测试剂，包含如SEQ ID No.2所示的探针，以及上下游引物对，所述上下游引物对选自SEQ ID No.3-4，SEQ ID No.5-6，SEQID No.7-8，SEQ ID No.9-10，SEQ ID No.11-12，SEQ ID No.13-14，SEQ ID No.15-16，SEQID No.17-18，SEQ ID No.19-20，或者SEQ ID No.21-22。
本发明还提供了上述核酸分子标记和PBRM1基因突变检测试剂在构建与宫颈癌新辅助化疗耐药相关生物模型中的应用；以及上述核酸分子标记和PBRM1基因突变检测试剂在检测突变PBRM1基因表达的p.R1548Q突变多肽中的应用。
本发明的有益效果：利用本发明所提供的分子标记及试剂，检测PBRM1基因c.G4643A突变型，可以从LACC患者中筛选出NACT反应较差患者进行个体化治疗，将铂类药物+紫杉醇治疗方案替换为PDL1/PD1免疫治疗方案、PARP/ATR抑制剂或者放化疗，避免患者无效治疗，防止延误患者治疗，从而提高患者生存质量。本发明应用于临床，可以使LACC患者受益，社会意义和经济价值显著。
附图说明
图1为细胞活性MTT实验结果图。
图2为细胞克隆形成实验图。
图3为细胞克隆形成结果统计图。
图4为PBRM1 c.G4643A突变耐药患者的荧光定量PCR检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1确定宫颈癌新辅助化疗耐药相关基因突变
1、样本搜集
发明人搜集到16例宫颈癌新辅助化疗病人，病人信息如表1，其中8例PD/SD患者，8例PR/CR患者(实验前病人是否存在基因突变未知，表中最后一列是在实验完成后测序验证的结果)。
表1.病人信息
发明人收集所有患者新辅助化疗前后外周血样，加入EDTA抗凝。所有血样均签署知情同意书。
2、ctDNA提取及文库构建
利用QIAamp Mini Kit(50)对血细胞样本进行gDNA提取，利用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(50)对血浆样本进行cfDNA提取。通过Qubit 3.0对提取的gDNA进行定量分析，利用NanoDrop 8000对提取的gDNA进行纯度分析，利用琼脂糖凝胶电泳对gDNA进行完整性分析。针对提取的cfDNA样本，利用Qubit 3.0对抽提的cfDNA进行定量，利用Agilent 2100生物分析仪对cfDNA的片段大小和纯度进行分析。
利用QIAseq Targeted DNA Panel对提取好的血细胞样本以及血浆样本进行文库构建。文库构建完成后，通过Qubit 3.0对文库进行定量分析，利用Agilent 2100生物分析仪对文库的片段大小和纯度进行分析。
3、捕获测序
利用芯片捕获技术，结合Illumina Hiseq 2500的高通量测序技术，对样本进行测序。
4、生物信息学分析
生物信息学的分析始于测序数据(Illumina的下机原始数据)。首先，对raw data的数据过滤产生了clean data，使用UMI技术有效减低测序背景噪音对后续数据分析的影响。每个样本的所有标记都被映射到人类参考基因组(GRCh37/hg19)。Burrows-WheelerAligner(BWA)软件用于进行alignment。使用bamdst基于alignment计算每个个体的测序深度和覆盖度。为保证准确的variant calling，我们应用strelka进行SNP分析。为了保证合格的测序数据，在整个pipeline中建立了严格的数据分析质量控制系统(QC)。所有的基因组变异，应用严格的过滤方法获得高可信度的variant calls。应用多重软件进行一系列变异注释。最后的variants和注释结果被用于下游的高级分析。
在宫颈癌新辅助化疗耐药患者化疗后CTDNA中发现PBRM1发生高频突变，且突变位点为c.G4643A。
实施例2细胞实验验证PBRM1基因影响宫颈癌细胞顺铂敏感性
1、构建PBRM1基因小干扰RNA序列。
2、宫颈癌细胞系转染小干扰RNA
转染前24h，在500μL完全培养基中接种0.5-2×105个Hela细胞，转染时细胞融合度为80-90％。用减血清培养基稀释小干扰RNA，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置15min。轻轻颠倒混匀转染试剂，用减血清培养基稀释2.0μL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置15min。混合转染试剂和小干扰RNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。转染复合物加入到24孔细胞板中，100μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。将细胞板置于37℃、5％ CO2培养箱中培养6h左右，进行换液，换成含10％血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右。
3、MTT实验检测宫颈癌细胞铂敏感性
收集对数期转染后细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度5000/孔。5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的顺铂。5％CO2，37℃孵育48小时，每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD562nm处测量各孔的吸光值。
4、克隆形成实验检测宫颈癌细胞铂敏感性
收集对数期转染后细胞，调整细胞悬液浓度,铺板使待测细胞调密度1000/孔。加入浓度梯度的顺铂。5％CO2，37℃培养14天，4％多聚甲醛固定30分钟后0.1％结晶紫染色10分钟后，计数。
5、结果分析
根据各孔吸光值计算细胞活性，MTT实验结果如图1，下调PBRM1基因的Hela细胞相较阴性对照组的Hela细胞铂敏感性更低。克隆形成实验结果如图2，图3，下调PBRM1基因的Hela细胞较阴性对照组在不同顺铂浓度下克隆形成能力更强，提示PBRM1基因与宫颈癌新辅助化疗耐药密切相关。
实施例3探针法检测PBRM1 c.G4643突变
对1例宫颈癌新辅助化疗耐药患者的PBRM1基因进行检测：针对PBRM1基因c.G4643A突变设计引物和探针，通过荧光定量PCR技术检测PBRM1基因突变情况，具体实施步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1所述的CTDNA提取方法，提取受试者外周静脉血中的基因组DNA备用。
2、引物及探针设计及PCR反应
首先，参考人类基因组参考序列GRCh37/hg19，针对PBRM1基因的c.G4643A，利用Beacon Designer 8.1.4进行引物设计及探针设计，引物对可选，具体序列如下：
然后，按照Animal Detection U+Probe qPCR Super PreMix说明书所述配置PCR反应体系(20μl)，引物对选用SEQ ID No.3-4
PCR反应条件：
| 污染消化 | 循环：1 | 37℃ | 2min |
| 预变性 | 循环：1 | 95℃ | 30sec |
| 循环反应 | 循环：45 | 95℃ | 10sec |
| 60℃ | 30sec |
3、实时荧光定量分析
将PCR反应体系使用Applied Biosystems StepOnePlus检测分析后，如图3，在宫颈癌新辅助化疗耐药患者中检测到PBRM1 c.G4643A突变，而在非耐药患者中未检测到。
Claims (8)
1.一种核酸分子标记，其特征在于：所述核酸分子标记包含序列A和/或其互补序列；所述序列A为DNA序列由SEQ ID No.1中15～30个核苷酸的任意序列的一个或多个组成，且任意一个序列必须包含SEQ ID No.1中第31位到第44位的14个碱基。
2.根据权利要求1所述的核酸分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2和/或其互补序列所示。
3.根据权利要求1所述的核酸分子标记在制备PBRM1基因突变检测试剂中的应用。
4.一种PBRM1基因突变检测试剂，包含如SEQ ID No.2所示的探针，以及上下游引物对，所述上下游引物对选自SEQ ID No.3-4，SEQ ID No.5-6，SEQ ID No.7-8，SEQ ID No.9-10，SEQ ID No.11-12，SEQ ID No.13-14，SEQ ID No.15-16，SEQ ID No.17-18，SEQ ID No.19-20，或者SEQ ID No.21-22。
5.权利要求1所述核酸分子标记在构建与宫颈癌新辅助化疗耐药相关生物模型中的应用。
6.权利要求4所述PBRM1基因突变检测试剂在构建与宫颈癌新辅助化疗耐药相关生物模型中的应用。
7.权利要求1所述核酸分子标记在检测突变PBRM1基因表达的p.R1548Q突变多肽中的应用。
8.权利要求4所述PBRM1基因突变检测试剂在检测突变PBRM1基因表达的p.R1548Q突变多肽中的应用。
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Citations (3)
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| CN110996971A (zh) * | 2017-06-02 | 2020-04-10 | 亚利桑那州立大学董事会 | 创建个性化犬癌症疫苗的方法 |
| JP2020089313A (ja) * | 2018-12-06 | 2020-06-11 | 国立大学法人 琉球大学 | ヒト組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法 |
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-
2022
- 2022-11-27 CN CN202211495592.XA patent/CN116064817A/zh active Pending
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