CN116064644A - SbAGO1b蛋白及其编码基因在调控植物抗虫性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SbAGO1b蛋白及其编码基因在植物抗虫性方面的应用。本发明的实验证明，SbAGO1b功能缺失的突变体表现出较野生型对抗虫性提高，过表达则对蚜虫敏感，表明SbAGO1b在高粱蚜虫应答中具有负调控作用。基于本发明能够用于制备抗虫性能提高的植物品种，具有较广泛的应用前景。

Description

SbAGO1b蛋白及其编码基因在调控植物抗虫性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及SbAGO1b蛋白及其编码基因在调控植物抗虫性方面的应用。
背景技术
蚜虫作为农业害虫和植物病毒的传播者，已经成为严重威胁全球农业生产发展的主要害虫之一，是农业生产面临的一个亟待解决的世界性难题。挖掘抗虫基因、解析抗虫机理已成为植物抗逆研究领域一个研究热点。随着生物化学与分子生物学、基因组学、遗传学、转基因遗传转化技术以及基因编辑技术的快速发展，使得作物抗逆基因挖掘、抗逆分子机制研究得以不断深入。
高粱（ Sorghum bicolor (L.) Moench）是世界上最重要的粮食、饲料、酿造和能源作物之一，因其基因组相对较小（约800 Mb）、遗传多样性丰富以及与其它C4禾本科作物基因组的共线性强，因此成为C4作物研究的重要模式作物之一（McCormick RF, Truong SK,Sreedasyam A, Jenkins J, Shu S, Sims D, Kennedy M, Amirebrahimi M, Weers BD,McKinley B, Mattison A, Morishige DT, Grimwood J, Schmutz J, Mullet JE. TheSorghum bicolor reference genome: improved assembly, gene annotations, atranscriptome atlas, and signatures of genome organization. Plant J., 2018,93(2): 338-354.）。高粱蚜（ Melanaphissacchari，简称SCA）是高粱生产中的一种毁灭性害虫，每年对全球的高粱产量和品质造成严重损失（Tetreault HM, Grover S, Scully ED,Gries T, Palmer NA, Sarath G, Louis J, Sattler SE. Global Responses ofResistant and Susceptible Sorghum (Sorghum bicolor) to Sugarcane Aphid(Melanaphissacchari). Front Plant Sci. 2019, 10:145.）。防治蚜虫成为高粱生产上亟待解决的一个问题。利用高粱自身抗性进行蚜虫防控是最为环保和经济的方式。然而目前可利用的高粱抗蚜资源尚不丰富，且对蚜虫抗性遗传机制尚缺乏深入了解，因此挖掘高粱抗性种质资源、明确高粱抗性材料的遗传构成及抗性基因（位点）等的特征特性，解析高粱抗蚜机制，对深入作物抗虫机制研究及抗虫品种遗传改良具有重要的理论和实践指导意义。
Argonaute（简称AGO）蛋白是生物体中普遍存在的一类相对分子量较大（约105）、成员数量众多的蛋白家族，该家族在不同物种中高度保守，由可变N 端、PAZ、MID 和PIWI等4 个结构域组成。根据系统进化学以及AGO基因结合的sRNAs类型可将真核生物的AGO家族分为4个类群：Trypanosoma AGO、WAGO、AGO-like和PIWI-like家族，目前植物中发现的AGO蛋白均属于AGO-like类群，现已经从244种植物中鉴定出了超过2900种AGO蛋白（Li Z,Li W, Guo M, Liu S, Liu L, Yu Y, Mo B, Chen X, Gao L. Origin, evolution anddiversification of plant ARGONAUTE proteins. Plant J. 2021 Nov 30. doi:10.1111/tpj.15615.）。由于AGO基因序列在进化过程中发生大量重复和缺失，导致其基因家族不断扩大，使得其功能呈现多样化（Ma Z, Zhang X. Actions of plant Argonautes:predictable or unpredictable CurrOpin Plant Biol. 2018, 45 (Pt A): 59-67.）。已有的研究表明AGOs蛋白作为一个涉及miRNA基因沉默、转录调控、转录后调控和翻译调控等水平的多效应功能蛋白家族，参与植物生长发育、形态建成、细胞增殖凋亡、病毒防御、逆境响应等多种生物学过程。然而不同AGO基因在不同物种、不同发育阶段、不同逆境胁迫（如冷、热、激素、盐、干旱等）下其表达模式有所差异，所发挥的功能也不尽相同(Li Z, Li W,Guo M, Liu S, Liu L, Yu Y, Mo B, Chen X, Gao L. Origin, evolution anddiversification of plant ARGONAUTE proteins. Plant J. 2021 Nov 30. doi:10.1111/tpj.15615.;Ma Z, Zhang X. Actions of plant Argonautes: predictable orunpredictable CurrOpin Plant Biol. 2018, 45 (Pt A): 59-67.;Wu J, Yang J, ChoWC, Zheng Y. Argonaute proteins: Structural features, functions and emergingroles. J Adv Res. 2020, 24:317-324.;蒲伟军，谭冰兰，朱莉。Argonaute蛋白在植物逆境胁迫响应中的功能研究。中国农业科技导报，2021, 23(2): 17-26)。
研究发现，烟草中AGO8 通过调节防御信号网络中的几个关键节点，在诱导直接防御烟草天蛾中发挥核心作用。NaAGO8基因表达沉默的植株生长正常，但极易受到植食昆虫的攻击。究其原因，AGO8基因沉默造成体内miRNAs表达谱发生广泛改变，转录因子MYB8和酚酰胺和苯丙素途径以及尼古丁生物合成途径相关基因的转录本积累减少，导致在昆虫侵食诱导的防御代谢产物，如尼古丁、酚酰胺和二萜糖苷的水平显著受损。表明AGO8调控的miRNAs-mRNAs靶标组成的复杂网络重新编程会导致诱导性防御受损（Pradhan M, PandeyP, Gase K, Sharaff M, Singh RK, Sethi A, Baldwin IT, Pandey SP. Argonaute 8(AGO8) mediates the elicitation of direct defenses against herbivory. PlantPhysiol., 2017, 175(2): 927-946.）。此外，研究发现TaAGO5在调控小麦对麦双尾蚜（ Diuraphisnoxia）的抗性反应中起关键作用。当TaAGO5基因敲除22%后，导致麦双尾蚜抗性小麦品种呈现完全敏感表型。在敏感品种中TaAGO5表达量的增加可能会干扰植物激素的形成，提高D. noxia表现性能，而在抗病品种中表现并不明显（Sibisi P, Venter E. WheatArgonaute 5 functions in aphid-plant Interaction. Front Plant Sci., 2020, 11:641.）。
其中AGO1是目前AGOs蛋白家族研究中所发现的参与通路最多、功能最丰富也最重要的一类(Liu C, Xin Y, Xu L, Cai ZK, Xue YC, Liu Y, Xie DX, Liu YL, Qi YJ.Arabidopsis ARGONAUTE 1 Binds Chromatin to Promote Gene Transcription inResponse to Hormones and Stresses. Dev. Cell, 2018, 44(3): 348-361.e7.;LudmanM, Fátyol K. Targeted inactivation of the AGO1 homeologues of Nicotianabenthamiana reveals their distinct roles in development and antiviraldefence. New Phytol., 2020.;Bajczyk M, Bhat SS, Szewc L, Szweykowska-KulinskaZ, Jarmolowski A, Dolata J. Novel Nuclear Functions of ArabidopsisARGONAUTE1: Beyond RNA Interference. Plant Physiol., 2019, 179(3): 1030-1039.;Liu C, Xin Y, Xu L, Cai ZK, Xue YC, Liu Y, Xie DX, Liu YL, Qi YJ.Arabidopsis ARGONAUTE 1 Binds Chromatin to Promote Gene Transcription inResponse to Hormones and Stresses. Dev. Cell, 2018, 44(3): 348-361.e7.;LudmanM, Fátyol K. Targeted inactivation of the AGO1 homeologues of Nicotianabenthamiana reveals their distinct roles in development and antiviraldefence. New Phytol., 2021, 229(3):1289-1297.)。研究表明AGO1蛋白主要通过sRNAs-AGO1-miRNAs所形成的调控网络在植物生长发育、环境胁迫响应等生物学过程中发挥重要的调控作用(Du F, Gong W, Bosca´ S, et al. Dose-Dependent AGO1-MediatedInhibition of the miRNA165/166 Pathway Modulates Stem Cell Maintenance inArabidopsis Shoot Apical Meristem. Plant Comm., 2020, 1:100002.;Qin J, Ma X,Tang Z, et al. Construction of regulatory networks mediated by small RNAsresponsive to abiotic stresses in rice (Oryza sativa). Comput Biol Chem.,2015, 58: 69-80.)。AGO1功能缺失通常会导致植株表现出矮秆、窄叶、花序不育、叶片早衰、结实率低等发育异常表型(Liu X, Tang S, Jia G, et al. The C-terminal motifof SiAGO1b is required for the regulation of growth, development and stressresponses in foxtail millet (Setariaitalica (L.) P. Beauv). J Exp Bot., 2016,67(11): 3237-49.)。研究发现，在盐胁迫下AGO1可通过协同转录控制细胞核中MIR161和MIR173的表达来做出响应(Dolata J, Bajczyk M, Bielewicz D, et al. Salt StressReveals a New Role for ARGONAUTE1 in miRNA Biogenesis at the Transcriptionaland Posttranscriptional Levels. Plant Physiol., 2016, 172(1): 297-312.)。此外有研究表明，拟南芥中AGO1在调控MIR168a介导的耐旱机制方面起着关键性作用(Li W,Cui X, Meng Z, et al. Transcriptional regulation of Arabidopsis MIR168a andargonaute1 homeostasis in abscisic acid and abiotic stress responses. PlantPhysiol., 2012, 158(3): 1279-92.；Westwood JH, McCann L, Naish M, et al. Aviral RNA silencing suppressor interferes with abscisic acid-mediatedsignalling and induces drought tolerance in Arabidopsis thaliana. Mol PlantPathol., 2013, 14(2): 158-70.）。AGO1可通过结合受miR1514a调控的NAC转录因子衍生的phasiRNA，在豆科植物干旱胁迫响应中发挥功能（Sosa-Valencia G, Palomar M,Covarrubias AA, et al. The legume miR1514a modulates a NAC transcriptionfactor transcript to trigger phasiRNA formation in response to drought. J ExpBot., 2017,68(8): 2013-2026.）。近年来研究发现AGO1不仅作为RNA结合蛋白，还作为DNA结合蛋白，在植物响应激素和逆境胁迫过程中结合染色质并促进茉莉酸等信号通路的基因表达，表明AGO1在植物响应不同内外源信号过程中具有异于经典RNA干扰而激活基因表达的调控功能（Liu C, Xin Y, Xu L, et al. Arabidopsis ARGONAUTE 1 Binds Chromatinto Promote Gene Transcription in Response to Hormones and Stresses. Dev Cell,2018, 44(3): 348-361.e7.）。以上研究表明AGO1蛋白在调控植物生长发育和逆境响应方面起着关键性作用，然而其生物学功能及作用机制仍不明确，AGO1蛋白是否具有其它未知的新功能值得进一步探索。已有的研究多局限于拟南芥、烟草和水稻等模式植物中，而对于AGOs蛋白在高粱中研究非常有限（Liu X, Lu T, Dou YC, Yu B, Zhang C.Identification of RNA silencing components in soybean and sorghum. BMCBioinformatics. 2014, 15: 4-16.；林俊俊，郭怀刚，董洁静，杨克军，张海燕，李佐同，赵长江，徐晶宇。高粱AGO蛋白家族基因鉴定及表达分析。核农学报，2019，33(07)：1291-1302），尤其在高粱与蚜虫互作的功能研究则未见报道。
发明内容
本发明人前期筛选到一个高抗SCA的高粱EMS突变体YM，利用BSA-Seq结合图位克隆技术，将该突变基因定位于高粱第9号染色体上的 SbAGO1b基因（编码序列第1786位碱基由C突变为T，造成编码蛋白的改变，苏氨酸L-Threonine突变为异亮氨酸Isoleucine）。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术、高粱遗传转化技术验证了该基因突变导致植株抗虫性提高，而过表达则更感蚜，说明 SbAGO1b基因在高粱-蚜虫互作中起负调控作用。转录组学分析发现， SbAGO1b基因突变导致次生代谢途径、糖类和脂类代谢、氨基酸代谢、信号转导途径及萜类和多酮类化合物代谢等多条与植物-蚜虫防御相关的重要途径发生改变，表明SbAGO1b蛋白在高粱-蚜虫互作中具有重要作用。由此完成本发明。
其中，SbAGO1b蛋白氨基酸序列（1109Aa，SEQ ID NO：1）MVRKKRTGPGESSGEASGAPGQGSSQRPQATQQGARGGGQHQGRGGYQGRGAPPSQHPGGGLTEYQPRDYQGRGGYQGRGGPPSQVPGGGPPEPQPRAYQGHGGYQGRGGPPSQHPGGGPPPGSQPRDYQGRGGPRPRGGMPQPHRGGHVGGSVGPSVPSGPSRPVPELHQAPDVQHQAPVVATPSPQGAGSSSQPRKAEVSTGQVQQQLQQLVIHDQSSASQAGQVAPASSKAVRFPLRPGKGTHGSRCIVKANHFIAELPNKDLHQYDVSITPEVTSRGVNRAVMGELVNLYRHSHLDGRLPAYDGRKSLYTAGALPFTSKTFEITLQDEEDSHGGGQRRQRVFRVVIKFAARADLHHLAMFLAGRQPDAPQEALQVLDIVLRELPTARYCPVGRSFYSPNLGRRQQLGEGLETWRGFYQSIRPTQMGLSLNIDMSSTAFIEPLPVTEFVAQLLNRDISVRPLSDSDRVKIKKALRGVKVEVTHRGNMRRKYRISGLTSQATRELSFPIDDRGTVKTVVQYFLETYGFSIQHTTLPCLQVGNQQRPNYLPMEVCKIVEGQRYSKRLNEKQITALLKVTCQRPHEREKDILQTVHHNAYSEDPYAQEFGIRIDERLASVEARVLPPPKLKYHDSGRERDVLPRVGQWNMMNKKMVNGGRVSSWACINFSRTVQDGAARSFCHELALMCQVSGMDFALEPVLPPCYARPEHVERALKGRYQDAMNILRPQDRELDLLIVILPDNNGSLYGDLKRICETDLGLVSQCCLTKHVFKANKQQYLANVALKINVKVGGRNTVLVDALTRRIPLVSDVPTIIFGADVTHPHPGEDSSPSIAAVVASQDWPEVTKYAGLVSAQTHRQELIQDLFKVYQDPQRGSVSGGMVRELLISFWRSTKQKPKRIIFYRDGVSEGQFYQVLLHELDAIRKACASLESDYQPPVTFVVVQKRHHTRLFANNHNDQRAVDKSGNILPGTVVDSKICHPTEFDFYLCSHAGIQGTSRPAHYHVLWDENKFTADGLQTLTNNLCYTYARCTRSVSIVPPAYYAHLAAFRARFYMEPDTTDSGSMASGATTSRAPGGARNTRAGVGNVAVRPLPALKENVKRVMFYC。
SbAGO1b编码基因的CDS序列（3330 bp，SEQ ID NO：2）
ATGGTGAGGAAGAAAAGAACTGGTCCAGGAGAGAGTTCTGGGGAGGCTTCTGGAGCGCCTGGGCAGGGCTCCTCACAGCGTCCTCAGGCAACTCAACAGGGTGCCCGTGGTGGAGGGCAACACCAGGGCCGTGGTGGATATCAGGGCCGTGGAGCGCCGCCTTCACAGCACCCAGGTGGTGGGCTGACTGAGTATCAACCGCGCGACTACCAGGGACGCGGTGGATATCAGGGCCGTGGCGGTCCACCTTCACAGGTTCCTGGTGGTGGGCCGCCTGAGCCTCAGCCGCGTGCCTACCAGGGACACGGTGGATACCAGGGCCGTGGCGGGCCACCTTCACAGCATCCTGGTGGTGGGCCACCACCTGGGTCTCAACCACGTGACTATCAGGGACGTGGTGGTCCGCGTCCCAGAGGGGGAATGCCGCAGCCACACCGTGGCGGGCATGTGGGAGGTAGTGTTGGACCAAGTGTTCCTTCAGGTCCATCTAGACCAGTTCCCGAGCTGCACCAAGCCCCAGATGTCCAACATCAAGCCCCTGTGGTGGCAACACCATCACCACAAGGAGCTGGCTCGTCCTCGCAGCCTAGGAAGGCCGAGGTGAGCACTGGACAAGTCCAGCAACAGCTTCAGCAACTTGTGATTCATGACCAGAGTTCAGCCAGCCAAGCTGGTCAGGTGGCACCAGCGTCAAGCAAAGCGGTTAGATTCCCATTGCGCCCTGGCAAGGGTACGCATGGGTCCAGGTGCATCGTGAAGGCAAATCATTTCATTGCTGAGCTGCCTAATAAAGACCTTCACCAATATGATGTATCGATAACGCCAGAGGTTACTTCACGCGGTGTCAATCGTGCTGTCATGGGAGAGCTTGTAAACCTTTATAGACACTCCCATTTGGATGGGCGTCTGCCTGCGTACGATGGAAGAAAGAGTCTTTATACAGCTGGAGCATTGCCGTTTACTTCGAAGACATTCGAAATTACTCTGCAAGATGAGGAAGACAGTCATGGTGGAGGCCAAAGGCGCCAGAGGGTATTTCGGGTGGTGATCAAATTTGCTGCTCGCGCTGATCTCCACCATCTGGCTATGTTTCTAGCTGGGAGGCAACCAGATGCTCCTCAAGAGGCTCTTCAAGTACTTGACATTGTGCTGCGCGAATTGCCTACTGCCAGGTATTGTCCTGTTGGTAGATCATTTTATTCTCCCAACTTAGGGAGACGTCAGCAACTTGGTGAAGGTTTGGAAACTTGGCGTGGTTTCTACCAAAGCATAAGGCCCACACAGATGGGTCTTTCTCTGAATATTGATATGTCCTCTACTGCATTTATTGAGCCCCTCCCAGTGACTGAATTTGTTGCTCAGCTTCTTAACAGAGATATATCAGTTAGACCATTGTCTGATTCTGATCGTGTGAAGATTAAAAAAGCCCTACGAGGTGTGAAAGTCGAGGTCACACACCGTGGAAACATGCGTAGGAAATATCGGATATCTGGCCTCACTTCACAAGCAACAAGGGAGTTATCATTCCCTATTGATGATCGTGGTACTGTTAAGACTGTGGTGCAATACTTCCTGGAGACTTATGGCTTCAGTATTCAGCACACCACTTTACCTTGCTTGCAAGTGGGCAATCAGCAAAGACCAAATTATTTGCCTATGGAGGTCTGTAAGATAGTTGAGGGACAGCGTTACTCAAAACGGCTTAATGAGAAACAGATCACTGCTCTACTGAAGGTGACTTGCCAGCGTCCCCATGAGCGTGAGAAAGACATCTTGCAGACTGTTCATCATAACGCCTACTCTGAGGATCCTTATGCCCAGGAATTTGGTATAAGGATTGATGAGCGTCTTGCATCTGTTGAAGCTCGTGTTCTGCCTCCCCCAAAGCTGAAATACCATGATAGTGGCAGAGAGAGGGATGTATTGCCAAGAGTTGGCCAGTGGAATATGATGAATAAGAAAATGGTCAATGGTGGTAGAGTTAGCAGCTGGGCATGCATTAACTTCTCAAGAACTGTGCAAGATGGCGCTGCCAGGAGTTTCTGTCATGAACTGGCTTTGATGTGCCAAGTATCAGGAATGGATTTTGCACTTGAACCTGTGCTGCCCCCATGCTATGCGAGGCCTGAACATGTTGAAAGAGCATTAAAGGGACGCTATCAAGATGCCATGAACATACTCAGGCCTCAGGACCGAGAACTTGACTTGCTGATTGTAATACTGCCTGACAATAATGGTTCTCTTTACGGGGATCTCAAAAGGATCTGTGAGACTGATCTTGGATTGGTCTCCCAATGCTGTCTGACTAAACATGTTTTCAAGGCGAACAAGCAGCAGTATCTTGCAAATGTTGCCCTGAAAATAAATGTGAAGGTTGGGGGACGGAATACGGTACTTGTTGATGCTTTGACAAGGAGAATTCCCCTTGTCAGTGATGTACCAACTATTATCTTTGGTGCTGATGTGACCCATCCCCATCCTGGGGAAGATTCTAGTCCTTCCATTGCAGCTGTTGTTGCTTCTCAAGACTGGCCTGAGGTTACCAAGTATGCAGGATTAGTGAGTGCTCAAACCCATCGCCAAGAATTGATACAGGATCTTTTCAAAGTATATCAAGATCCCCAAAGGGGATCTGTCTCTGGTGGCATGGTCAGGGAACTTCTCATTTCTTTCTGGAGGTCAACTAAACAGAAACCAAAAAGGATCATATTCTACAGGGATGGTGTCAGTGAGGGACAGTTCTACCAAGTTCTGTTGCATGAACTTGATGCCATTAGAAAGGCCTGTGCATCATTGGAGTCCGATTACCAGCCTCCAGTTACGTTTGTTGTGGTCCAGAAGCGTCATCACACTAGGTTGTTTGCTAATAATCACAATGACCAACGTGCTGTTGATAAAAGTGGAAACATACTGCCTGGTACTGTGGTGGACTCAAAGATCTGCCATCCAACTGAATTTGATTTCTACCTCTGTAGCCATGCTGGCATTCAGGGAACAAGCCGCCCTGCCCATTATCATGTCCTGTGGGATGAGAACAAATTTACCGCGGATGGGTTGCAAACTCTCACCAACAACCTGTGTTACACGTATGCTAGGTGCACTCGCTCAGTATCAATCGTTCCTCCTGCATATTATGCTCACCTGGCAGCCTTCCGAGCTCGCTTCTACATGGAGCCGGATACCACTGACAGTGGGTCTATGGCGAGTGGTGCTACGACAAGCCGTGCCCCAGGAGGGGCACGCAACACCAGGGCTGGTGTTGGAAATGTTGCCGTGAGGCCATTACCGGCCCTCAAGGAAAACGTGAAGCGTGTCATGTTCTATTGCTAA。
通过对高粱、水稻、玉米、谷子等物种同源AGO1蛋白的同源性比对和系统进化分析，结果表明，高粱SbAGO1b和玉米ZmAGO1a之间亲缘关系最为接近（图2）。
由此，本发明提供一种提高植物的抗虫能力的方法，其是将出发植株的 AGO1基因进行突变以获得抗虫能力提高的植株，其中所述突变是指通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行弱化调控；优选地，所述植物是高粱或玉米。
优选地，高粱中的 AGO1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
更优选地，一是通过EMS化学诱变方法对所述 AGO1基因进行突变。具体地，所述突变发生在所述编码序列的PAZ保守结构域。在一个极具体的例子中，将其编码的第595位氨基酸苏氨酸L-Threonine突变为异亮氨酸Isoleucine，更具体的是将编码序列1786位碱基由C突变为T。二是通过基因编辑的方法对所述 AGO1基因进行突变。具体的所述抗虫是指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
本发明也提供一种降低植物优选为高粱或玉米的抗虫能力的方法，其是在出发植株过表达 AGO1基因而获得抗虫能力降低的植株。如此获得的植株可以作为对昆虫敏感的对照或参照植株。所述的抗虫指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
本发明也提供 AGO1基因或其编码的蛋白在植物抗虫性中的应用。优选地，所述植物是高粱或玉米；更优选地， AGO1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。进一步优选地，所述抗虫是指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
本发明的有益效果：本发明通过获得转 SbAGO1b基因高粱过表达株系以及基因编辑突变株系。实验表明相对于野生型，基因编辑突变 SbAGO1b基因导致其表达降低后，使得 sbago1b突变株系对高粱蚜抗性明显提高；而过表达 SbAGO1转基因株系则对蚜虫的耐受性降低，表明利用SbAGO1b蛋白能够有效地实现对植物抗虫性的调节。本发明的蛋白及其编码基因对于解析植物抗虫机制，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1、 SbAGO1b基因CDS克隆。
图2、高粱SbAGO1b蛋白结构示意图（左）、不同物种AGO1蛋白家族的系统进化关系（右）。其中：At, 拟南芥 Arabidopsis thaliana；Os, 水稻 Oryza sativa；Si，谷子 Setariaitalica；Zm, 玉米 Zea mays；Sb, 高粱 Sorghum bicolor；SbAGO1b为测序品种BTx623序列；SbAGO1b.1为高粱品种JTY序列；SbAGO1b.2为突变体YM序列。
图3、SbAGO1b蛋白亚细胞定位载体构建示意图。
图4、SbAGO1b蛋白亚细胞定位情况。注：叶绿体（实线箭头）、细胞核（虚线箭头）。
图5、 SbAGO1b基因在不同组织、不同蚜虫胁迫中的表达模式。上图为不同组织（幼胚、花、根、芽），下图为不同蚜虫胁迫处理。以高粱Actin1为对照基因，设三次生物学重复。
图6、高粱EMS突变体YM（M）与野生型JTY（WT）田间抗虫性比较。（A）植株整体抗虫表型；（B）局部叶片抗虫表型。
图7-1至图7-4、T0代 SbAGO1b基因编辑突变体的筛选鉴定及基因编辑位点检测。
图7-1 T0代转化植株 SbAGO1b基因编辑靶点扩增检测结果。 A:靶点一扩增检测；B:靶点二位点扩增检测。其中，M: DNA marker 5000 bp；L1-6依次为 sbago1b不同转化植株；L7：非转化植株作为阴性对照；L8：以水为模板扩增作为空白对照。
图7-2 T0代转化植株 Cas9基因PCR扩增检测结果。其中，M: DNA marker 5000 bp；L1-6依次为 sbago1b不同转化植株；L7：非转基因植株作对照。
图7-3 PAT试纸条检测高粱转化株系Bar蛋白表达结果。其中，当试纸条T和C处同时出现条带时，表示为Bar蛋白阳性；若只有C处出现条带则为阴性；L1为非转化植株；L2-7依次为 sbago1b不同转化植株。
图7-4 T0代转化植株 SbAGO1b基因靶点编辑情况。其中：（A） SbAGO1b基因编辑靶点位置；（B）靶点一SG1编辑类型；（C）靶点二SG2编辑类型。WT为野生型；L1-6依次为 sbago1b转化植株
图8、T0代不同高粱转化植体内 SbAGO1b基因表达量变化情况。其中，WT为野生型；L1-6依次为 sbago1b不同转化植株。
图9、 sbago1b基因缺失突变体植株表型（左）、叶片蚜虫侵染表型（右）比较。
图10、 SbAGO1b基因过表达重组载体构建示意图。
图11、 SbAGO1b基因过表达植株株高和叶绿素含量（SPAD）变化（上）、感蚜表型（下）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1、 SbAGO1b基因CDS克隆
利用本发明人前期筛选到的高抗SCA的高粱EMS突变体YM，利用BSA-Seq结合图位克隆技术，将该突变基因定位于高粱第9号染色体上的 SbAGO1b基因。
提取高粱测序品种BTx623叶片的总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用特异性引物扩增高粱基因组中的 SbAGO1b基因CDS序列（图1），将回收的PCR产物与T载体连接构建重组质粒并转化大肠杆菌 E.coli感受态细胞，挑取单菌落于液体LB培养基中过夜培养，提取质粒进行PCR验证，阳性质粒送生工测序，经过序列比对获得完整正确的 SbAGO1b基因CDS序列，基因ID为Sobic.009G003700。
SbAGO1b编码基因全长CDS序列扩增所用引物：
3700-F：5’-ATGGTGAGGAAGAAAAGAACTG-3’，
3700-R：5’-TTAGCAATAGAACATGACACGCTTC-3’。
PCR扩增条件：
2、SbAGO1b蛋白分子特征分析：
本发明从高粱基因组中克隆了编码AGO1蛋白的基因 SbAGO1b，其编码序列大小分别为3, 330 bp，其蛋白氨基酸序列为1,109 Aa，推定的蛋白分子量为122,109 Da。在其氨基酸序列中含有四个AGO蛋白典型的Gly-rich_Ago1、DUF1785、PAZ和Piwi保守结构域（图2）。通过对高粱、水稻、玉米、谷子等物种同源AGO1蛋白的同源性比对和系统进化分析，结果表明，高粱SbAGO1b和玉米ZmAGO1a之间亲缘关系最为接近（图2）。
3、SbAGO1b蛋白亚细胞定位结果
以高粱品种TX430的cDNA为模板，利用KOD高保真酶扩增 SbAGO1b基因CDS序列（简称3700），选用pCAMBIA1302-GFP载体，将 SbAGO1b基因连接在GFP基因的N端，利用CaMV35S启动子启动SbAGO1b::GFP融合蛋白的表达。将胶回收得到的重组片段与线性化载体连接，构建重组载体pCAMBIA-1302-3700）（图3）。将构建好的重组载体转化 E.coliDH5α感受态细胞，37℃倒置培养，挑单克隆菌落，接种于液体LB培养基，提取质粒，用特异引物3700F与3700R进行目标基因PCR鉴定，将PCR阳性产物送生工测序，测序结果经比对分析显示 SbAGO1b基因序列完整正确且连接在亚细胞定位载体上，无移码突变。
将构建好的重组载体p1302-SbAGO1b::GFP（3700）转入农杆菌EHA105菌株中，涂布于含有卡那霉素（50mg/L）和利福平（50mg/L）的YEP平板培养，之后挑单斑摇菌，进行菌液PCR验证。采用农杆菌注射法，将鉴定正确的带有重组质粒的农杆菌注射到三周龄大的烟草幼嫩叶片，在LSM980激光共聚焦显微镜下进行观察，结果显示SbAGO1b定位于叶绿体、细胞核中（图4），为进一步研究SbAGO1b蛋白的功能以及参与的调控通路提供了重要的信息。
4、 SbAGO1b基因表达模式分析
利用定量qRT-PCR技术检测高粱 SbAGO1b基因在不同组织部位、不同发育时期的表达模式，结果检测到该基因可在高粱幼胚、花、根、芽中转录，表达水平各不相同（图5）。为了阐明SbAGO1b在高粱蚜虫侵染响应中的作用，我们采用定量qRT-PCR技术检测了野生型植株在蚜虫胁迫下 SbAGO1b基因的表达模式。结果表明，蚜虫胁迫引起 SbAGO1b基因的表达量下调，其中叶部表达量显著下调（图5）。
5、高粱SbAGO1b突变表型筛选鉴定
本发明人前期从自创的高粱EMS突变体库中筛选到一个抗蚜突变体YM，利用BSA-Seq技术并结合图位克隆技术，结果鉴定到突变基因是 SbAGO1b基因，其编码序列第1786位碱基由C突变为T，突变位点位于PAZ保守结构域。通过田间高粱蚜自然感染试验，结果如图5所示，野生型植株感染的蚜虫数量众多，叶片出现蚜虫分泌的大量蜜露，底部老叶有发黑霉变现象，而YM突变体却几乎没有感蚜，表现出对高粱蚜显著的抗性（图5，表1），且经多代田间试验该突变表型能够稳定遗传。
6、SbAGO1b缺失突变体的获取和鉴定
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，即采用优化的带有玉米Ubi启动子驱动的Cas9和U6启动子驱动sgRNA的基因突变载体pCXB053，构建了 SbAGO1b基因的双靶点突变载体，通过农杆菌介导法转化高粱受体品种TX430，并利用Bar基因作为筛选标记基因，获得 sbago1b基因突变转化体。经检测 SbAGO1b基因编辑靶位点发生了不同类型突变（包括插入、缺失、单碱基突变等），经多代检测其突变位点能够稳定遗传（图7）。选取PCR鉴定为阳性的基因编辑转化单株，利用RT-PCR技术检测，结果表明T0代不同转化植株中 SbAGO1b基因的表达量均低于对照野生植株（图8）。
选取第3-4叶期大的 sbago1b突变体和WT幼苗分别接种30头高粱蚜处理5-7天时， sbago1b叶片未出现蚜虫损伤，表现出较为显著的避趋性和抗生性，而WT叶片表现出明显感虫表型。田间试验表明在高粱蚜自然发生的情况下， sbago1b株系均未出现感虫表型，其抗虫性非常突出（图9，表1）。
其中，转化高粱所用的方法是农杆菌介导法，其操作程序如下：
挑选高粱受体材料幼胚或经诱导培养后生长良好的胚性愈伤组织接种在预培养基上，25℃暗培养3d，然后在OD600值为0.5~0.6的农杆菌悬浮液中浸泡15~20 min，倒去菌液，用无菌滤纸吸去幼胚或愈伤组织表面多余菌液，接种于共培养基上，于25℃暗培养3d；之后用含有500mg/L羧苄青霉素（Carb）的清洗液洗涤2~3次；用无菌滤纸吸去表面清洗液，将侵染后的幼胚或愈伤组织转移到选择培养基（含1、3、5 mg/L等不同浓度的双丙氨膦溶液）上进行筛选培养：即先将共培养后的幼胚或愈伤组织置于不含筛选剂的选择培养基YS-S0上避光恢复培养7d，转入含有较低浓度双丙氨膦（1 mg/L）的选择培养基YS-S1上，进行1周的低压筛选，然后将愈伤组织转入含有浓度为3 mg/L的双丙氨膦的选择培养基YS-S2上，进行一周的筛选，之后再转入含有较高浓度双丙氨膦（5 mg/L）的选择培养基YS-S3上，进行一周的高压筛选。将存活的抗性愈伤组织转接到分化培养基上继续筛选和分化培养（25℃、16h光照/8h黑暗），每隔一周继代培养一次，直至有不定芽出现；待不定芽成苗，苗高3~4 cm时，将其转移到生根培养基上，诱导生根；如有不定根出现，待根长2~3 cm时，转移到蛭石培养基上过渡培养1~2周，移栽温室或大田。
7、 SbAGO1b基因过表达株系的创制
提取高粱受体品种TX430叶片的总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用特异性引物扩增 SbAGO1b编码基因CDS序列，利用植物pFGC5941载体构建 SbAGO1b基因的过表达载体（图10），利用农杆菌介导法转化高粱TX430受体材料，并利用 Bar基因作为筛选标记基因，获得SbAGO1b-OE基因过表达转化体。分析结果表明过表达SbAGO1b植株株高增加，叶绿素含量、叶色均与野生型Tx430无显著差异，但对蚜虫更为敏感（图11，表1），再次说明 SbAGO1b基因可能在高粱蚜虫应答中起负调控作用。
表1 高粱植株抗蚜鉴定结果
注：I：Immune；HR：Highly resistant；R：Fairly resistant；MR：Moderatelyresistant；S：Susceptible；MS：Moderately susceptible；HS：Highly susceptible。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高植物的抗虫能力的方法，其特征在于，是将出发植株的AGO1基因进行突变以获得抗虫能力提高的植株，优选地所述植物是高粱或玉米。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变是指通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定、通过sRNA对基因进行弱化调控。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，高粱中的AGO1基因编码的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过基因编辑的方法对所述AGO1基因进行突变；或者通过化学诱变方法实现。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变发生在所述编码序列的保守结构域，例如PAZ保守结构域；具体地，将其编码的第595位氨基酸苏氨酸L-Threonine突变为异亮氨酸Isoleucine，更具体的是将编码序列1786位碱基由C突变为T。
6.如权利要求1至5所述的方法，其特征在于，所述抗虫是指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
7.一种降低植物的抗虫能力的方法，其是在出发植株过表达AGO1基因而获得抗虫能力降低的植株，如此获得的植株可以作为对昆虫敏感的对照或参照植株；优选地，所述植物是高粱或玉米。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的抗虫指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
9.AGO1基因或其编码的蛋白在植物抗虫性中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物是高粱或玉米；AGO1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述抗虫是指抗蚜虫，尤其是高粱蚜虫。
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