CN116064356A - 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064356A
CN116064356A CN202211354924.2A CN202211354924A CN116064356A CN 116064356 A CN116064356 A CN 116064356A CN 202211354924 A CN202211354924 A CN 202211354924A CN 116064356 A CN116064356 A CN 116064356A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus amyloliquefaciens
seq
nucleotide sequence
pgds
amy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211354924.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116064356B (zh
Inventor
冯小海
张亚涛
王延斌
殷文锋
许宗奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Xuankai Biotechnology Co ltd
Xuan Kai Biotechnology Chuzhou Co ltd
Original Assignee
Nanjing Xuankai Biotechnology Co ltd
Xuan Kai Biotechnology Chuzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Xuankai Biotechnology Co ltd, Xuan Kai Biotechnology Chuzhou Co ltd filed Critical Nanjing Xuankai Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211354924.2A priority Critical patent/CN116064356B/zh
Publication of CN116064356A publication Critical patent/CN116064356A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116064356B publication Critical patent/CN116064356B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用，属于生物工程技术领域技术。本发明通过分子生物学手段，选择了dCas9蛋白。利用dCas9蛋白特异性响应靶向sgRNA的调控特性和可被外源诱导的时空特异性的特性通过在解淀粉芽孢杆菌工程菌中引入靶向聚谷氨酸降解酶基因pgdS的动态调控表达水平，实现一菌合成多种分子量聚谷氨酸。通过本发明生产的聚谷氨酸产量可达27g/L，均一的分子量范围为50‑1400kDa，使面向的应用领域更加精确。

Description

一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸 中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法与其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然生物聚合物，由L-和/或D-谷氨酸单元的γ酰胺键组成，分子量从500到3000kDa不等。γ-PGA作为一种谷氨酸聚合物，分子量是影响其生物学性能的重要参数，不同的用途对γ-PGA分子量的需求不同。近年来研究报道，高分子量γ-PGA要参与絮凝(3000kDa)，去除重金属和染料(2500kDa)，和组织工程支架(2000kDa)。低分子量γ-PGA被认为特别适用于作物冷冻保护剂(2kDa)，益生菌保护剂(257kDa)，和药物载体(45-60kDa)。
为了生产特定分子量的γ-PGA，生物酶促降解法受到了相当大的关注。研究表明，由地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分泌到培养基中的聚谷氨酸水解酶PgdS具有将高分子量γ-PGA切割成1000Da到20kDa片段的能力。此外，通过在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02中过表达pgdS实现了特定γ-PGA的一步合成，导致γ-PGA的分子量从1000-1200kDa降低到600-800kDa。同样，在解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)中过表达pgdS，有效地将γ-PGA的分子量降低到20-30kDa。总之，这些表明酶法降解是获得具有不同分子量的γ-PGA的有效方法。
尽管如此，然而为了实现对降解酶表达水平特定调控，需要构建大量的基因表达文库，消耗人力资源，并且造成了生产工艺的复杂性，不适用于大规模工业化生产。相比之下，创建具有可变分子量的γ-PGA合成的水解酶表达水平可调的有效细胞工厂是一个更加理想的选择。为了获得具有多元分子量的γ-PGA，应在动态范围内微调pgdS表达水平。目前，诱导型启动子系统是最流行的通过添加特定诱导分子来外部动态控制基因表达的工具之一。然而，它们通常具有相对较窄的诱导范围，限制了它们在基因表达调节中的适用性。近年来，已经建立了聚集规则间隔短回文重复干扰(CRISPRi)系统来调节基因的表达。已证明大肠杆菌基因组内可预测的分级宽动态范围基因表达(10至300倍抑制)。通过这种方法，在一个微生物底盘中动态控制pgdS的表达水平以生产具有不同分子量的γ-PGA将是实用且有效的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌工程菌。
本发明还要解决的技术问题是上述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是上述解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌工程菌，可动态调节聚谷氨酸降解酶表达水平并用于生产多元分子量聚谷氨酸。
本发明还公开了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法。
本发明最后公开了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
一种解淀粉芽孢杆菌工程菌，它是包含了双质粒表达系统的解淀粉芽孢杆菌，所述的双质粒CRISPR-dCas9表达系统表达dCas9蛋白模块和sgRNA靶向调控模块；
其中，所述的dCas9蛋白模块包括启动子Pgrac、dCas9蛋白基因dCas9和淀粉酶终止子Tamy，其连接方式为三者顺次连接Pgrac-dCas9-Tamy；
其中，所述的sgRNA靶向调控模块包括3个sgRNA片段sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，1个聚谷氨酸降解酶基因pgdS，4个启动子PHpaⅡ、PBAD、Pglv和Pxyl，2个淀粉酶终止子Tamy，其连接方式为PHpaⅡ-pgdS-Tamy-PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy。
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌是以解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NS为宿主菌。
具体的，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NS是由解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB敲除内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1和DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO后得到；所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB是由解淀粉芽孢杆菌NX-2S(CCTCC NO:M 2016346)消除内源质粒p2Sip得到。(解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB的构建方法已公开在专利CN 108624546 A中，解淀粉芽孢杆菌NX-2S的详细信息已公开在专利CN 106047780 A中)
具体的，解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB敲除内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1和DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO构建解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NS的方法如下：以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，利用引物将目的基因PgdS1上下游各800bp同源臂扩增出来。同时，以表达质粒pMA5为模板扩增组成型强启动子PHpaⅡ。胶回收后将启动子及上下游同源臂通过重叠PCR融合成片段PHpaⅡ-PgdSUP-PgdSDN，再利用一步克隆法将融合片段克隆至EcoR I和Xho I双酶切的载体pDR-pheS*，得到重组质粒pDR-pheS*-PgdS。将验证正确的重组质粒经过去甲基化后，电转化(电压2.5-2.9kv，电击时间4ms)至解淀粉芽孢杆菌NB中，将含有重组质粒的菌株在30℃下含有100μg/mL壮观霉素的LB平板培养基中培养12h后，转接至42℃下含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB培养液中培养24-48h诱导质粒发生单交换。将单交换阳性克隆子在无抗性的LB培养液培养2代后，稀释涂布于含有5mM底物p-Cl-Phe的LB底物平板培养基上，得到PgdS1敲除菌株NB(△PgdS)。将目的基因改为CwlO，重复上述操作，最终得到PgdS1和CwlO双敲除的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NS。
具体的，所述的内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，所述的双质粒表达系统包括pNX01质粒和pHY300PLK质粒，pNX01质粒用于表达dCas9蛋白模块，pHY300PLK质粒用于表达sgRNA靶向调控模块。
具体的，所述的dCas9蛋白模块中，启动子Pgrac的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，淀粉酶终止子Tamy的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.27所示，编码dCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
具体的，所述的sgRNA靶向调控模块中，3个sgRNA片段来源于sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12中的任意3条；其中，sg1的核苷酸序列如SEQ IDNO.7，sg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8，sg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，sg4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10，sg5的核苷酸序列如SEQ ID NO.11，sg6的核苷酸序列如SEQ ID NO.12，sg7的核苷酸序列如SEQ ID NO.13，sg8的核苷酸序列如SEQ ID NO.14，sg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.15，sg10的核苷酸序列如SEQ ID NO.16，sg11的核苷酸序列如SEQ ID NO.17，sg12的核苷酸序列如SEQ ID NO.18。
具体的，所述的sgRNA靶向调控模块中，聚谷氨酸降解酶基因pgdS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，启动子PHpaⅡ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，启动子PBAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.19，启动子Pglv的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；淀粉酶终止子Tamy的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建dCas9蛋白表达质粒：
(1a)以质粒pdCas9-bacteria为模板通过PCR扩增得到dCas9片段，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis表达质粒pHT01为模板扩增得到启动子Pgrac，以解淀粉芽孢杆菌NX-2S的基因组为模板扩增得到淀粉酶终止子Tamy，通过胶回收试剂盒对Pgrac、dCas9和Tamy片段进行回收后，采用重叠PCR对三个片段融合得到dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy。
(1b)采用一步克隆通过Sma I和Xba I酶切将步骤(1a)得到的dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy连接至质粒pNX01上，得到重组质粒pNX-dCas9。
(2)构建sgRNA靶向调控降解酶表达质粒：
(2a)以枯草芽孢杆菌NX-2的基因组为模板扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS，以质粒pMA5为模板扩增得到启动子PHpaⅡ，通过胶回收试剂盒对pgdS、PHpaⅡ片段进行回收后，采用重叠PCR对启动子PHpaⅡ、聚谷氨酸降解酶基因pgdS和步骤(1a)已扩增回收得到的淀粉酶终止子Tamy融合得到PHpaⅡ-pgdS-Tamy片段。
(2b)根据启动子PHpaII片段和聚谷氨酸降解酶基因pgdS基因的序列利用gRNAFinder分别在启动子区-35区、RBS区的+30位置、基因片段非模板链的+150位置、+400位置、+700位置、+1000位置及+1150位置、基因片段模板链的+130位置、+200位置、+600位置、+1000位置及+1100位置，选取20bp作为靶向序列，利用对应的引物PCR分别融合进tracRNA骨架组成sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12，选择其中的任意3条作为sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3；以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组为模板通过PCR扩增得到启动子PBAD和启动子Pxyl，以质粒pKD46为模板通过PCR扩增得到启动子Pglv。将sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、启动子PBAD、启动子Pxyl和启动子Pglv融合得到PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3片段，在将融合得到的PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3片段与淀粉酶终止子Tamy融合得到PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy片段。
优选的，3条sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3片段分别为sg4、sg5和sg6。
优选的，将sg4、sg5、sg6、启动子PBAD、启动子Pxyl和启动子Pglv融合得到PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6片段，在将融合得到的PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6片段与淀粉酶终止子Tamy融合得到PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6-Tamy片段。
(2c)将步骤(2b)得到的PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy片段和步骤(2a)得到的PHpaⅡ-pgds-Tamy片段进一步融合，并通过EcoR I和Hind III连接到质粒pHY300PLK中，得到重组质粒pHY-PPP-pgdS。
优选的，将PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6-Tamy片段和PHpaⅡ-pgds-Tamy片段进一步融合，并通过EcoR I和Hind III连接到质粒pHY300PLK中，得到重组质粒pHY-PPP-pgdS。
(3)构建解淀粉芽孢杆菌工程菌NSd9-PPP：
将步骤(1b)构建得到的重组质粒pNX-dCas9转化至大肠杆菌E.coli GM2163中进行去甲基化dam-、dCm-，再将去甲基化的重组质粒pN0X01-pgdS转化至宿主菌Bacillusamyloliquefaciens NS中，得到重组菌株NSd9。将步骤(2c)得到的重组质粒pHY-PPP-pgdS转化至重组菌株NSd9中，构建得到解淀粉芽孢杆菌工程菌NSd9-PPP。
所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的调控产不同分子量聚谷氨酸，其所用的发酵培养基为：菊粉粗提液30-80g/L，硫酸铵1-10g/L，三水合磷酸氢二钾5-30g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，无水硫酸镁0.1-5g/L，一水硫酸锰0.01-0.1g/L。
其中，将重组菌株NSd9在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加0.1-1mM IPTG诱导dCas9蛋白的表达。
优选的，将重组菌株NSd9在32℃发酵培养第8h时，添加0.5mM IPTG诱导dCas9蛋白的表达。
其中，通过控制木糖、麦芽糖和阿拉伯糖的浓度和添加时间控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，从而获取不同分子量范围的γ-PGA。
具体的，通过在28-35℃发酵培养0-24h后添加5-15g/L的木糖、5-15g/L麦芽糖和0.02-2g/L阿拉伯糖中的任意一种或几种的组合，动态调控降解酶PgdS的水解活性，继续在28-35℃发酵培养48-100h；控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，获取不同分子量范围的γ-PGA。
优选的，在32℃，发酵培养8h后添加5-15g/L的木糖、5-15g/L麦芽糖和0.02-2g/L阿拉伯糖，继续发酵培养88h时，
(1)①当添加木糖浓度0≤C木糖≤5g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为50kDa≤Mw≤390kDa；②当添加木糖浓度5＜C木糖≤10g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为400kDa＜Mw≤500kDa；③当添加木糖浓度10＜C木糖≤15g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为500kDa＜Mw≤560kDa。
(2)①当添加麦芽糖浓度0≤C麦芽糖≤5g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为50kDa≤Mw≤360kDa；②当添加麦芽糖浓度5＜C麦芽糖≤10g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为360kDa＜Mw≤400kDa；③当添加麦芽糖浓度10＜C麦芽糖≤15g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为400kDa＜Mw≤500kDa。
(3)①当添加阿拉伯糖浓度0≤C木糖≤5g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为50kDa≤Mw≤280kDa；②当添加阿拉伯糖浓度5＜C阿拉伯糖≤10g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为280kDa＜Mw≤360kDa；③当添加阿拉伯糖浓度10＜C阿拉伯糖≤15g/L时，γ-PGA的分子量范围大约为360kDa＜Mw≤420kDa。
(4)①当添加15g/L木糖和2g/L阿拉伯糖时，γ-PGA的分子量约为800kDa；②当添加15g/L木糖、15g/L麦芽糖和2g/L阿拉伯糖时，γ-PGA的分子量约为1000kDa；③当添加15g/L木糖和15g/L麦芽糖时，γ-PGA的分子量约为1400kDa。
其中，所述聚谷氨酸γ-PGA经分离纯化后，可用于农业、食品、医药、化妆品和临床等方面。
有益效果：
1、本发明所提供的利用工程菌调控合成不同分子聚谷氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的菊粉粗提液，大大节约了生产成本，适用于工业化生产。
2、本发明提供了一种构建动态调控基因线路的方法，具有发酵过程理性调控聚谷氨酸分子量大小的优势和外源添加诱导剂的时空特异性。
3、通过构建γ-PGA生产工程菌株和引入动态调控基因线路，在发酵培养基中可以积累24-27g/L分子量范围为50-1400kDa的γ-PGA，具有较好的应用前景。基于应用分析，本发明的方法对于工业化生产不同聚谷氨酸具有巨大的经济和社会效益。
4、本发明调控生产的聚谷氨酸具有更为均一的分子量范围，面向的应用领域更加精确。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为pNX-dCas9重组质粒的构建与表达。其中，(A)pNX-dCas9重组质粒示意图；(B)Spe I和Spe I/Not I双酶切质粒pNX-dCas9电泳图；(C)重组菌株NSd9表达dCas9蛋白的SDS-PAGE图：泳道1，IPTG诱导的重组菌株NSd9表达dCas9蛋白；泳道2，无IPTG诱导重组菌株NSd9dCas9蛋白无表达；泳道M，蛋白质marker。
图2为pHY-NT1-egfp重组质粒的构建与表达。(A)pHY-NT1-egfp重组质粒示意图；(B)靶向egfp表达框的sgRNA-NT1扩增片段；(C)egfp的扩增片段。
图3为重组菌株NSd9-E和重组菌株NSd9-NT1在不同IPTG诱导浓度下对绿色荧光蛋白表达的影响。
图4为CRISPRi系统对解淀粉芽孢杆菌的egfp表达水平的调控。(A)靶向egfp表达框的sgRNA设计；(B)不同sgRNA介导的egfp基因的转录水平；(C)不同sgRNA调控下荧光共聚焦显微镜观察。
图5为调控降解酶pgdS表达水平的不同sgRNA设计。
图6为不同sgRNA元件表达对γ-PGA合成的影响。(A)pgdS基因的mRNA水平；(B)PgdS降解酶水解活性；(C)γ-PGA分子量；(D)细胞生长和γ-PGA产量。
图7为不同诱导启动子下sgRNAs的组合与优化。(A)多个sgRNA重组构建示意图；(B)重组融合片段。
图8为CRISPRi介导pgdS表达的动态调节对γ-PGA合成的影响
(A-D)不同浓度诱导剂(木糖、阿拉伯糖和麦芽糖)对降解酶PgdS酶活、γ-PGA分子量、生物量和γ-PGA产量的影响。“0”表示发酵液中未添加诱导剂；“15X+15M”表示发酵液中添加了15g/L木糖和15g/L麦芽糖；“15X+2A”表示发酵液中添加了15g/L木糖和2g/L阿拉伯糖；“15X+15M+2A”表示在发酵液中加入15g/L木糖，15g/L麦芽糖和2g/L阿拉伯糖。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
材料和方法：
(1)质粒构建采用经典分子生物手段进行。
(2)细胞生长的测定：
吸光度：将培养液稀释20倍后在分光光度计600nm处读取吸光值。为了测定干细胞重量(DCW)，将培养液经过适当稀释后在8000×g离心20min。用蒸馏水洗涤2-3次后，在100℃下干燥至恒重并称重。
(3)聚谷氨酸的产量及分子量测定：
利用凝胶渗透色谱法(GPC)测定发酵产物的分子量，将发酵提纯产物适当稀释后采用0.22μm滤膜去除菌体，20μL直接进样。选用色谱柱：Shodex Ohpak SB-806M HQ；配制0.2mol/L Na2SO4溶液作为液相的流动相，利用醋酸调pH为4.0左右；为了控制液相色谱柱内的压力不过高，调节流动相流速为1.0mL/min。将样品的出峰时间与γ-PGA标准品进行对照，确定产物的分子量。
(4)基因转录水平的测定：
使用荧光实时定量技术检测突变株的基因转录水平。解淀粉芽孢杆菌的mRNA提取使用Takara公司的RNAiso Plus Kit试剂盒；经提取后的mRNA使用Takara公司的PrimeScript RT Master Mix Kit试剂盒(Code RR036A)进行反转录成cDNA，获得cDNA后继续根据Takara公司的试剂盒SYBR Premix Ex TaqII(Code RR820A)配制反应体系，然后在ABI StepOnePlus系统上进行PCR反应。PCR条件为，阶段一：95℃，30s，阶段二：95℃，5s；60℃，30s；40个循环。解淀粉芽孢杆菌的16S rRNA被用作参照基因，使用双△法计算目的基因表达差异，每个基因在处理后0h后的表达量定义为1。所用的引物均由金斯瑞引物在线设计软件设计(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-tagman-primer-design-tool)。
(5)聚谷氨酸降解酶活性测定：
聚谷氨酸降解酶酶活测定是通过检测γ-PGA在水解过程中释放出来的游离的氨基团浓度进行确定的。具体操作为：将发酵液离心得到包含降解酶的粗酶液；以纯化后的γ-聚谷氨酸溶解于0.05mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，获得10g/L的γ-PGA水溶液。酶反应液包含200μL粗酶液和800μL的γ-PGA溶液在37℃下培养4h。为每个样品分别设置一个含有灭活酶的空白样品以校正结果用于氨基的非酶释放。在沸水中加热5min停止反应，然后添加1mL茚三酮显色液，混合均匀，置于100℃加热15min，冷却后加入3mL的60％的乙醇进行稀释，利用紫外分光光度计检测OD570。
(6)培养基配方：
①斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂2％
②LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L
③感受态制备培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5M
④复苏培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5M，甘露醇0.38M
⑤电击缓冲液：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，甘油10％
⑥感受态细胞悬浮液：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，甘油10％，PEG-6000 14％
⑦种子培养基：菊粉粗提液20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.5
⑧发酵培养基：菊粉粗提液70g/L，(NH4)2SO4 5g/L，K2HPO4·3H2O 20g/L，KH2PO42g/L，MgSO4 0.45g/L，MnSO4·H2O 0.06g/L，pH 8.0
(7)下述实施例所有质粒购买于金斯瑞生物科技有限公司；引物及DNA序列由金斯瑞生物科技有限公司合成；质粒及DNA片段由金斯瑞生物科技有限公司测序；所用的所有试剂盒购买于Axygen公司；限制性内切酶购买于宝日医生物科技有限公司；DNA聚合酶(PHANTA酶)购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
实施例1：重组解淀粉芽孢杆菌NS的构建
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB敲除内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1(如SEQ ID NO.1所示)和DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO(如SEQ ID NO.2所示)构建解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NS的方法如下：以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，利用引物将目的基因PgdS1上下游各800bp同源臂扩增出来。同时，以表达质粒pMA5为模板扩增组成型强启动子PHpaⅡ(如SEQ ID NO.3所示)。胶回收后将启动子及上下游同源臂通过重叠PCR融合成片段PHpaⅡ-PgdSUP-PgdSDN，再利用一步克隆法将融合片段克隆至EcoR I和Xho I双酶切的载体pDR-pheS*，得到重组质粒pDR-pheS*-PgdS。将验证正确的重组质粒经过去甲基化后，电转化(电压2.5-2.9kv，电击时间4ms)至解淀粉芽孢杆菌NB中，将含有重组质粒的菌株在30℃下含有100μg/mL壮观霉素的LB平板培养基中培养12h后，转接至42℃含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB培养液中培养24-48h诱导质粒发生单交换。将单交换阳性克隆子在无抗性的LB培养液培养2代后，稀释涂布于含有5mM底物p-Cl-Phe的LB平板培养基上，得到PgdS1敲除菌株NB(△PgdS)。将目的基因改为CwlO，重复上述操作，最终得到PgdS1和CwlO双敲除的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NS。
其中，所用引物和PCR反应条件如下表1和表2所示。
表1实施例1使用的引物
Figure BDA0003920690910000071
PCR反应体系：反应混合物皆含有2μL模板，每个引物2μL，25μL PHANTA酶和19μL双蒸馏水。引物浓度为10μmol/mL，模板浓度20ng/μL。
表2实施例1使用的PCR反应条件
Figure BDA0003920690910000072
实施例2：pNX-dCas9重组质粒的构建与表达
以质粒pdCas9-bacteria为模板通过PCR扩增得到dCas9片段(氨基酸序列如SEQID NO.27所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis表达质粒pHT01为模板扩增得到启动子Pgrac(如SEQ ID NO.4所示)，以解淀粉芽孢杆菌NX-2S的基因组为模板扩增得到淀粉酶的终止子Tamy(如SEQ ID NO.5所示)，通过胶回收试剂盒对Pgrac、dCas9和Tamy片段进行回收后，采用重叠PCR对三个片段融合得到dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy；
采用一步克隆通过Sma I和Xba I酶切将得到的dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy连接至质粒pNX01上，得到重组质粒pNX-dCas9(图1A)。
其中，选择IPTG诱导型启动子Pgrac来控制dCas9的表达，可实现该系统对基因表达水平的调控具有可诱导性。构建的重组质粒pNX-dCas9，经双酶切验证正确(图1B)后，将重组质粒pNX-dCas9转化至解淀粉芽孢杆菌NS中得到重组菌株NSd9。
将重组菌株NSd9置于种子培养基中培养8h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达dCas9蛋白，如图1C中SDS-PAGE所示，在没有IPTG添加情况下，dCas9蛋白在野生解淀粉芽孢杆菌NS没有进行表达，而当添加了IPTG出现了约156kDa的蛋白条带，结果表明在解淀粉芽孢杆菌中已成功实现dCas9蛋白的表达。进一步进行传代诱导后挑取单菌落进行PCR验证，结果表明重组质粒pNX-dCas9可在解淀粉芽孢杆菌NS中稳定的存在，且对解淀粉芽孢杆菌NS的生长无明显影响。
其中，所用引物和PCR反应条件如下表3和表4所示。
表3实施例2使用的引物
Figure BDA0003920690910000081
PCR反应体系：反应混合物皆含有2μL模板，每个引物2μL，25μL PHANTA酶和19μL双蒸馏水。引物浓度为10μmol/mL，模板浓度20ng/μL。
表4实施例2使用的PCR条件
Figure BDA0003920690910000082
实施例3 CRISPR-dCas9系统在解淀粉芽孢杆菌中的靶位点设计及验证
(1)如图2所示，以质粒EGFP-pBAD为模板对绿色荧光蛋白基因egfp(如SEQIDNO.22所示)进行扩增，构建重组质粒pHY-egfp，将验证正确的重组质粒分别转化进菌株NS和NSd9，得到重组菌株NS-E和NSd9-E；在重组质粒pHY-egfp的基础上，针对egfp基因构建sgRNA表达质粒pHY-NT1-egfp。将pHY-NT1-egfp质粒转入到重组菌株NSd9得到重组菌株NSd9-NT1。
将重组菌株NSd9-E、NSd9-NT1置于种子培养基中培养8h后，分别加入不同剂量的IPTG(达到终浓度0mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM和1mM)，诱导sgRNA的表达。测定在不同浓度诱导剂下，绿色荧光蛋白的相对荧光强度。结果如图3所示，在含有pNX-dCas9重组质粒和pHY-egfp重组质粒的NSd9-E重组菌株中，即使添加IPTG诱导dCas9蛋白的表达，菌株的荧光水平也不受影响，说明在没有sgRNA表达的情况下，dCas9蛋白的表达对绿色荧光蛋白不会产生干扰；而对于重组菌株NSd9-NT1，随着IPTG浓度的增加，菌株的绿色荧光蛋白的表达水平出现明显下降。当添加0.1mM的IPTG诱导dCas9蛋白表达时，绿色荧光蛋白的表达水平降低至对照菌株NSd9-E的60.8％。当添加1mM的IPTG时，绿色荧光蛋白的表达水平下降至最低，仅是对照菌株荧光蛋白表达强度的28％，这表明该诱导浓度足以完全诱导dCas9蛋白的表达。值得注意的是，当未添加IPTG诱导剂时，重组菌株NSd9-NT1的荧光蛋白强度出现部分抑制，这表明在解淀粉芽孢杆菌中构建的CRISPRi系统存在微弱的泄露表达。
(2)如图4A所示，根据启动子PHpaII片段和绿色荧光蛋白egfp基因的序列，利用gRNAFinder分别在启动子区的-35区、RBS区的+30位置、基因片段非模板链的+160位置以及+400位置选取20bp作为靶向序列，通过PCR融合进tracRNA骨架组成sgRNA-P1(如SEQ ID NO.23所示)、sgRNA-P2(如SEQ ID NO.24所示)、sgRNA-NT1(如SEQ ID NO.25所示)和sgRNA-NT2(如SEQ ID NO.26所示)片段。将各重组质粒通过电转化法转化至解淀粉芽孢杆菌NSd9中得到相应的重组菌株，分别命名为NSd9-P1、NSd9-P2、NSd9-NT1和NSd9-NT2。
利用荧光共聚焦显微镜检测不同重组菌株的荧光强度。结果如图4C所示，缺乏完整功能dCas9/sgRNA复合物的两个对照菌株(NS-E和NSd9-E)显示的荧光强度相似，具有明显的绿色荧光，表明dCas9蛋白或sgRNA不会对绿色荧光强度产生影响。而在表达了dCas9和sgRNA的四个实验菌株(NSd9-P1、NSd9-P2、NSd9-NT1和NSd9-NT2)中，绿色荧光蛋白EGFP的荧光强度明显变弱。并且通过对荧光强度的进一步检测发现，由于sgRNA的不同靶向位置，EGFP的荧光强度相对于参照菌株NS-E被抑制到不同水平(28-68.7％)(图4B)。其中，与sgRNA-NT1相比，sgRNA-NT2序列显示出较弱的抑制能力，这表明sgRNA靶向转录位点附近的区域可实现更高的抑制效率。此外，在sgRNA-P1和sgRNA-P2的介导下，绿色荧光蛋白的表达强度分别达到60.86％和50.32％，这表明靶向转录起始区域比靶向启动子附近区域(-35盒)更有效。
综上所述，本发明中构建的CRISPR系统可以在解淀粉芽孢杆菌中实现基因表达水平的可控调节。
上述实验所用引物和PCR反应条件如下表5和表6所示。
表5实施例3使用的引物
Figure BDA0003920690910000091
Figure BDA0003920690910000101
PCR反应体系：反应混合物皆含有2μL模板，每个引物2μL，25μL Phanta酶和19μL双蒸馏水。引物浓度为10μmol/mL，模板浓度20ng/μL。
表6实施例2使用的PCR条件
Figure BDA0003920690910000102
实施例4基于CRISPR系统理性调控降解酶表达水平
以枯草芽孢杆菌NX-2的基因组为模板扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS，以质粒pMA5为模板扩增得到启动子PHpaⅡ，通过胶回收试剂盒对pgdS、PHpaⅡ片段进行回收后，采用重叠PCR对启动子PHpaⅡ、聚谷氨酸降解酶基因pgdS和淀粉酶终止子Tamy融合得到PHpaⅡ-pgdS-Tamy片段。
根据启动子PHpaII片段和聚谷氨酸降解酶基因pgdS基因的序列利用gRNA Finder分别在启动子区-35区、RBS区的+30位置、基因片段非模板链的+150位置、+400位置、+700位置、+1000位置及+1150位置、基因片段模板链的+130位置、+200位置、+600位置、+1000位置及+1100位置，选取20bp作为靶向序列，利用对应的引物PCR分别融合进tracRNA骨架组成sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12。
以质粒pHY-P1-egfp为模板，利用引物pHY-P43-s-F/R和pHY-s-Tamy-F/R分别扩增出启动子P43及终止子Tamy片段。为了便于后期sgRNA的替换，在启动子后引入酶切位点SalⅠ，在终止子前引入酶切位点PstⅠ。利用引物pHY-P43-s-F/pHY-s-Tamy-R通过重叠PCR融合启动子P43、sgRNA片段及终止子Tamy片段，经胶回收纯化得到片段P43-sgRNA-Tamy。同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对质粒pHY-PHpaⅡ-SPyncM-pgdS进行酶切回收后，将不同的sgRNA融合片段分别与酶切载体进行连接并转化入E.coli DH5α，获得重组质粒pHY-sg1-pgdS、pHY-sg2-pgdS、pHY-sg3-pgdS、pHY-sg4-pgdS、pHY-sg5-pgdS、pHY-sg6-pgdS、pHY-sg7-pgdS、pHY-sg8-pgdS、pHY-sg9-pgdS、pHY-sg10-pgdS、pHY-sg11-pgdS及pHY-sg12-pgdS(图5)。经测序验证成功后，将各重组质粒通过电转化法转化解淀粉芽孢杆菌NSd9中得到相应的重组菌株，分别命名为NSd9-sg1、NSd9-sg2、NSd9-sg3、NSd9-sg4、NSd9-sg5、NSd9-sg6、NSd9-sg7、NSd9-sg8、NSd9-sg9、NSd9-sg10、NSd9-sg11和NSd9-sg12。
通过RT-PCR测定不同重组菌株中pgdS基因的转录水平。结果如图6所示，无论sgRNA是靶向启动子区或是基因编码序列，所有菌株的pgdS的mRNA含量均有所下降。在所有表达sgRNA重组菌中，pgdS的抑制效率在8％～68％之间，这是由于不同sgRNA的靶向位点所致。此外，在sg1和sg2的介导下，pgdS的mRNA含量分别是菌株NS的82％和75％，这表明sgRNA靶向RBS区域的抑制效率高于靶向启动子-35上游区域的抑制效率。当sgRNA靶向模板链DNA时，pgdS的mRNA含量只是有轻微的下降，是参照菌株的66％-92％，而sgRNA靶向非模板链DNA时，抑制效果比模板链的要好，pgdS的mRNA含量是参照菌株的32-76％。
如图6A所示，当sgRNA结合到非模板链DNA的+150bp到+1000bp区域时，抑制效率呈现上升趋势，从28％增加到68％，sg7是结合到非模板链DNA的+1000bp，抑制效率急剧下降到24％。靶向模板链DNA的sgRNA也显示出类似的现象。这些结果表明，在解淀粉芽孢杆菌中，sgRNA结合位点到转录起始位点的距离并不是基因抑制效率的决定性因素，也有可能与靶向位点的可达性有关，这与sgRNA设计和PAM位点的差异有关。
如图6B所示，将不含CRISPRi系统的菌株NS和表达dCas9和pgdS基因的菌株NSd9-PgdS进行比较，结果发现两株菌株的PgdS水解酶活性相似，分别为18.92±0.54U/mL和18.74±0.38U/mL，γ-PGA的分子量均分布在20-30kDa，这表明dCas9蛋白的表达不干扰降解酶pgdS的正常表达。所有pgdS抑制菌株产生的PgdS水解酶活性均低于对照菌株NSd9-PgdS。其中，对有pgdS抑制效率最高的菌株NSd9-sg4、NSd9-sg5和NSd9-sg6产生的PgdS水解酶活性分别为8.26±0.34U/mL、7.98±0.42U/mL和6.84±0.34U/mL，相对于对照菌株的酶活(18.92±0.54U/mL)分别降低了56.34％、57.82％和63.85％。不同菌株合成的γ-PGA的分子量呈阶梯状分布，(图6C)。这些分子量均低于对照菌株NSd9-PgdS合成γ-PGA的分子量。这些结果表明，不同sgRNA对pgdS基因的抑制效率，从而导致γ-PGA分子量的变化。最后，我们检测了所有重组菌株的细胞干重和γ-PGA合成产量，并将这些参数与对照菌株的结果进行了比较。如图6D所示，随着γ-PGA分子量的增大，重组菌株对应的细胞干重和γ-PGA的合成产量均略低低于对照菌株NSd9-PgdS。菌株NSd9-sg4、NSd9-sg5和NSd9-sg6的最终细胞干重分别从5.98±0.35g/L降至5.59±0.28g/L、5.54±0.34g/L和5.51±0.38g/L。此外，菌株NSd9-sg4、NSd9-sg5和NSd9-sg6合成的γ-PGA浓度分别达到了26.23±0.42g/L、25.88±0.38g/L和25.93±0.32g/L，相对于参照菌株NSd9-PgdS(27.05±0.45g/L)分别降低了3.0％、4.1％和4.5％。γ-PGA在微生物合成发酵过程中，由于分子量过大导致发酵液的粘度增加，从而使得发酵液中的溶解氧减少，这一直是维持细胞正常代谢和提高产量的主要限制因素。在本发明过程中，由于CRISPRi系统对pgdS表达水平的调控，导致水解效率有所变化，继而导致合成γ-PGA的分子量发生变化，这可能就是重组菌株菌体量以及γ-PGA合成产量下降的原因。
综上，通过CRISPRi系统合理控制PgdS水解酶的表达，以此制备不同分子量的γ-PGA是切实可行的。
上述实验所用引物和PCR反应条件如下表7和表8所示。
表7实施例4使用的引物
Figure BDA0003920690910000111
Figure BDA0003920690910000121
PCR反应体系：反应混合物皆含有2μL模板，每个引物2μL，25μL Phanta酶和19μL双蒸馏水。引物浓度为10μmol/mL，模板浓度20ng/μL。
表8实施例4用的PCR条件
Figure BDA0003920690910000122
实施例5基于CRISPRi系统理性组装一菌合成多种分子量γ-PGA微生物模式
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组为模板通过PCR扩增得到阿拉伯糖诱导启动子PBAD和木糖诱导启动子Pxyl，以质粒pKD46为模板通过PCR扩增得到麦芽糖诱导启动子Pglv。利用阿拉伯糖诱导启动子PBAD、麦芽糖诱导启动子Pglv和木糖诱导启动子Pxyl分别驱动sgRNA1(sg4)、sgRNA2(sg5)和sgRNA3(sg6)的表达(图7)得到PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6片段，随后再将PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6片段与淀粉酶终止子Tamy融合得到PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6-Tamy片段。
将PBAD-sg4-Pglv-sg5-Pxyl-sg6-Tamy片段和实施例4构建得到的PHpaⅡ-pgds-Tamy片段进一步融合，并通过EcoR I和Hind III连接到质粒pHY300PLK中，得到重组质粒pHY-PPP-pgdS。将重组质粒pHY-PPP-pgdS转化至实施例2中构建得到的重组菌株NSd9中，得到工程菌NSd9-PPP。
上述实验所用引物和PCR反应条件如下表9和表10所示。
表9实施例5使用的引物
Figure BDA0003920690910000123
Figure BDA0003920690910000131
PCR反应体系：反应混合物皆含有2μL模板，每个引物2μL，25μL Phanta酶和19μL双蒸馏水。引物浓度为10μmol/mL，模板浓度20ng/μL。
表10实施例5使用的PCR条件
Figure BDA0003920690910000132
将构建的重组菌株NSd9-PPP在32℃下发酵培养8h后(发酵培养基：菊粉粗提液30-80g/L，硫酸铵1-10g/L，三水合磷酸氢二钾5-30g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，无水硫酸镁0.1-5g/L，一水硫酸锰0.01-0.1g/L)，分别在发酵液中添加0.5mM IPTG诱导dCas9蛋白的表达，添加不同浓度的木糖(5-15g/L)、麦芽糖(5-15g/L)和阿拉伯糖(0.02-2g/L)，继续发酵培养88h时。结果如图8A所示，随着不同诱导剂浓度的增加，γ-PGA降解酶PgdS的水解活性逐渐降低，γ-PGA的分子量也在逐渐增加(图8B),相应的，生物量也随之减少(图8C)。文献报道，木糖诱导型启动子Pxyl存在泄露表达，因此即使在不添加木糖诱导剂的情况下，启动子Pxyl仍可表达部分sg6，以此抑制pgdS的表达。因此在不添加木糖培养时，重组菌株NSd9-PPP的PgdS水解酶活性(18.56±0.32U/mL)也略低于NSd9-PgdS菌株，γ-PGA的分子量也由20-30kDa增加到50-60kDa。当添加不同浓度的木糖(5g/L、10g/L和15g/L)诱导sgRNA表达时，PgdS水解酶活性范围为6.42±0.42U/mL～8.12±0.33U/mL，合成γ-PGA的分子量分布在400-560kDa之间。当添加15g/L的木糖诱导时，γ-PGA的分子量达到最大，为560kDa左右。当添加不同浓度的麦芽糖(5g/L、10g/L和15g/L)诱导时，γ-PGA的分子量分布在360-500kDa之间，添加15g/L的麦芽糖诱导时，γ-PGA的分子量达到最大，为500kDa左右。当添加不同浓度的阿拉伯糖(0.02g/L、0.2g/L和2g/L)诱导时，γ-PGA的分子量分布在280-420kDa之间，添加2g/L的麦芽糖诱导时，γ-PGA的分子量达到最大，为420kDa左右。这些结果表明，选用的三种诱导型启动子均能有效的表达相应的sgRNA，进一步调控pgdS的表达，从而实现对γ-PGA分子量的调控。此外，木糖诱导sg6表达制备的γ-PGA分子量高于麦芽糖诱导sg5表达以及阿拉伯糖诱导sg4表达所得到的γ-PGA分子量，说明启动子Pxyl-sg6组合对降解酶pgdS基因的抑制效率高于其他两个。
根据上述添加单个诱导剂诱导的结果，表明当添加15g/L木糖、15g/L麦芽糖或2g/L阿拉伯糖时，γ-PGA的分子量可以达到最高。为了进一步拓宽对降解酶pgdS的抑制范围，以此获得更广分子量的γ-PGA，我们进一步考察了三种诱导剂的共诱导表达对γ-PGA合成的影响。结果如图8AB所示，与单一诱导剂诱导的结果相比，不同诱导剂组合添加后γ-PGA降解酶PgdS的水解活性均有所下降，对应γ-PGA的分子量也有所上升。当分别添加诱导剂木糖+麦芽糖、木糖+阿拉伯糖、木糖+麦芽糖+阿拉伯糖时，PgdS水解酶活性分别从6.42±0.42U/mL降至4.23±0.32U/mL、5.32±0.35U/mL和1.56±0.41U/mL，对应γ-PGA的产量没有发生明显的变动，在25.02±0.35g/L到25.31±0.38g/L之间(图8D)。当同时添加木糖、麦芽糖及阿拉伯糖时，γ-PGA的分子量达到最大值，为1350-1400kDa(图8B)以上结果表明，不同诱导剂的组合有利于增强对PgdS水解酶的抑制，进一步扩大了γ-PGA的分子量范围。
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (11)

1.一种解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，它是包含了双质粒表达系统CRISPR-dCas9表达系统的解淀粉芽孢杆菌，所述的双质粒表达系统表达dCas9蛋白模块和sgRNA靶向调控模块；
其中，所述的dCas9蛋白模块包括启动子Pgrac、dCas9蛋白基因dCas9和淀粉酶终止子Tamy，其连接方式为三者顺次连接Pgrac-dCas9-Tamy；
其中，所述的sgRNA靶向调控模块包括3个sgRNA片段sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，1个聚谷氨酸降解酶基因pgdS，4个启动子PHpaⅡ、PBAD、Pglv和Pxyl，2个淀粉酶终止子Tamy，其连接方式为PHpaⅡ-pgdS-Tamy-PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，以解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NS为宿主菌，其中，所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NS是由解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB敲除内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1和DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO后得到；所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NB是由解淀粉芽孢杆菌NX-2S CCTCC NO:M 2016346消除内源质粒p2Sip得到。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的内源聚谷氨酸降解酶PgdS基因PgdS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的DL-肽链内切酶CwlO基因CwlO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的双质粒表达系统包括pNX01质粒和pHY300PLK质粒，pNX01质粒用于表达dCas9蛋白模块，pHY300PLK质粒用于表达sgRNA靶向调控模块。
5.根据权利要求1或4所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的dCas9蛋白模块中，启动子Pgrac的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，淀粉酶终止子Tamy的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，编码dCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
6.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的sgRNA靶向调控模块中，3个sgRNA片段来源于sg1、sg2、sg3、sg4、sg5、sg6、sg7、sg8、sg9、sg10、sg11、sg12中的任意3条；其中，sg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7，sg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8，sg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，sg4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10，sg5的核苷酸序列如SEQID NO.11，sg6的核苷酸序列如SEQ ID NO.12，sg7的核苷酸序列如SEQ ID NO.13，sg8的核苷酸序列如SEQ ID NO.14，sg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.15，sg10的核苷酸序列如SEQ IDNO.16，sg11的核苷酸序列如SEQ ID NO.17，sg12的核苷酸序列如SEQ ID NO.18。
7.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的sgRNA靶向调控模块中，聚谷氨酸降解酶基因pgdS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，启动子PHpaⅡ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，启动子PBAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.19，启动子Pglv的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；淀粉酶终止子Tamy的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建dCas9蛋白表达质粒：
(1a)采用重叠PCR对启动子Pgrac、dCas9和淀粉酶终止子Tamy三个片段融合得到dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy；
(1b)采用一步克隆通过Sma I和Xba I酶切将步骤(1a)得到的dCas9蛋白模块Pgrac-dCas9-Tamy连接至质粒pNX01上，得到重组质粒pNX-dCas9；
(2)构建sgRNA靶向调控降解酶表达质粒：
(2a)采用重叠PCR对启动子PHpaⅡ、聚谷氨酸降解酶基因pgdS和淀粉酶终止子Tamy三个片段融合得到PHpaⅡ-pgdS-Tamy片段；
(2b)将淀粉酶终止子Tamy、sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、启动子PBAD、启动子Pxyl和启动子Pglv七个片段融合，得到PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy片段；
(2c)将步骤(2b)得到的PBAD-sgRNA1-Pglv-sgRNA2-Pxyl-sgRNA3-Tamy片段和步骤(2a)得到的PHpaⅡ-pgds-Tamy进一步融合，并通过EcoR I和Hind III连接到质粒pHY300PLK中，得到重组质粒pHY-PPP-pgdS；
(3)构建解淀粉芽孢杆菌工程菌NSd9-PPP：
将步骤(1b)构建得到的重组质粒pNX-dCas9转化至大肠杆菌E.coli GM2163中进行去甲基化dam-、dCm-，再将去甲基化的重组质粒pNX01-pgdS转化至宿主菌Bacillusamyloliquefaciens NS中，得到重组菌株NSd9；将步骤(2c)得到的重组质粒pHY-PPP-pgdS转化至重组菌株NSd9中，构建得到解淀粉芽孢杆菌工程菌NSd9-PPP。
9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将重组菌株NSd9在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加0.1-1mM IPTG诱导dCas9蛋白的表达。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌，通过添加5-15g/L的木糖、5-15g/L麦芽糖和0.02-2g/L阿拉伯糖中的任意一种或几种的组合，动态调控降解酶PgdS的水解活性，在28-35℃发酵培养48-100h，控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，从而获取不同均一分子量范围的γ-PGA。
CN202211354924.2A 2022-11-01 2022-11-01 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用 Active CN116064356B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211354924.2A CN116064356B (zh) 2022-11-01 2022-11-01 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211354924.2A CN116064356B (zh) 2022-11-01 2022-11-01 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116064356A true CN116064356A (zh) 2023-05-05
CN116064356B CN116064356B (zh) 2024-01-30

Family

ID=86179311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211354924.2A Active CN116064356B (zh) 2022-11-01 2022-11-01 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064356B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010213665A (ja) * 2009-03-18 2010-09-30 Kao Corp ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法
CN106047780A (zh) * 2016-08-22 2016-10-26 南京工业大学 一株解淀粉芽孢杆菌及其在联产细菌纤维素和γ‑聚谷氨酸中的运用
CN108624546A (zh) * 2018-05-30 2018-10-09 南京工业大学 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN110317754A (zh) * 2019-06-28 2019-10-11 轩凯生物科技(滁州)有限公司 一种含聚谷氨酸的微生物液体菌剂及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010213665A (ja) * 2009-03-18 2010-09-30 Kao Corp ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法
CN106047780A (zh) * 2016-08-22 2016-10-26 南京工业大学 一株解淀粉芽孢杆菌及其在联产细菌纤维素和γ‑聚谷氨酸中的运用
CN108624546A (zh) * 2018-05-30 2018-10-09 南京工业大学 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN110317754A (zh) * 2019-06-28 2019-10-11 轩凯生物科技(滁州)有限公司 一种含聚谷氨酸的微生物液体菌剂及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUANYUAN SHA 等: "Efficient Biosynthesis of Low-Molecular-Weight Poly-γ-glutamic acid based on Stereochemistry Regulation in Bacillus amyloliquefaciens", ACS SYNTHETIC BIOLOGY, pages 1395 - 1405 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116064356B (zh) 2024-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3858987B1 (en) A novel isopropylmalate synthase variant and a method of producing l-leucine using the same
CN110157654B (zh) 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用
KR20160057478A (ko) 정제 화학약품의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물
CN111394288B (zh) 重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及其生产四氢嘧啶的方法
CN113604472B (zh) 一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑系统
KR20170128509A (ko) 정제 화학약품의 개선된 제조를 위한 재조합 미생물
KR101877286B1 (ko) 만노오스 프로모터를 포함하는 벡터 및 만노오스 프로모터
LU500869B1 (en) Construction method of engineered corynebacterium strain and use thereof
WO2024099089A1 (zh) 一种生产假尿苷的基因工程菌株及其构建方法与应用
CN116064356B (zh) 一种解淀粉芽孢杆工程菌及其在调控产不同分子量聚谷氨酸中的应用
JP7544962B2 (ja) プトレシン生産微生物及びそれを用いたプトレシン生産方法
CN105874073B (zh) 用于拟无枝菌酸菌的穿梭载体和表达载体
CN111979257B (zh) 一种重组dna及其应用
JP2023540330A (ja) Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－シトルリンの生産方法
JP2011200134A (ja) 薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物
CN116515882B (zh) 一种基于t7 rna聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统
CN116004497A (zh) 一株产超低分子量聚谷氨酸的解淀粉芽孢杆工程菌及其应用
KR102360900B1 (ko) 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
CN114107309B (zh) 一种非天然茶碱rna分子开关
KR102665227B1 (ko) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
Leisinger et al. Plasmids, phages, and gene transfer in methanogenic bacteria
KR20240017394A (ko) L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법
US20110129894A1 (en) Secretion optimized microorganism
CN115109793A (zh) 一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN112553235A (zh) 一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant