CN116063512A - 多功能重组抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能重组抗体及其制备方法和应用，本发明不仅提供了一种能够特异性识别人CD276蛋白的单克隆抗体，还提供了其人源化的重组抗体，以及在此基础上进一步重构得到既能够识别人CD276，又具有IL15功能的多功能抗体，能够有效增强原抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，本发明还通过引入突变的人IgG1恒定区，得到一种改构的特异性CD276单抗‑IL15双功能分子，可有效降低了抗体的毒性，提高安全性。本发明的抗体可识别多种肿瘤细胞中的CD276蛋白，进而对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，同时重构的CD276靶向的IL15重组抗体具有还具有药物代谢周期短、毒性低、安全性高的优点，具有巨大的应用前景。

Description

多功能重组抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种Fc突变的CD276靶向的IL15重组多功能抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种能够既识别CD276又具有IL15功能，而且在体内毒性下降的多功能重组抗体及其应用。
背景技术
CD276，即B7-H3，是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫共刺激和共抑制家族，具有免疫调节功能。作为一个免疫调节相关的受体蛋白，其配体至今尚无定论。在正常人体组织中表达水平较低，CD276表达于激活的巨噬细胞和单核细胞，可以起到抑制T细胞的作用，避免免疫的过度激活。
CD276广泛表达于多种恶性肿瘤，包括肺癌，肝癌，肠癌，胃癌，乳腺癌，胰腺癌和肾癌等。肿瘤细胞表达CD276可以促进肿瘤的进展，并导致较差的预后，这是因为CD276可以抑制肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫。
因此，CD276可以作为一个可靠的靶标，用于肿瘤的治疗。
首先，作为一个免疫检查点分子，阻断其功能，可以增强机体的抗肿瘤免疫。
其二，CD276广泛表达于肿瘤细胞，特异性的抗体可以通过ADCC、CDC、ADCP等作用机制，杀伤肿瘤细胞。
其三，CD276在肿瘤细胞的特异性表达，可以通过ADC的方式，实现肿瘤细胞的特异性杀伤。
IL15是一种由多种细胞表达的细胞因子，这些细胞包括单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等，但T淋巴细胞则不表达。与其他多种细胞因子不同，IL15一般不分泌出细胞发挥作用，而是与IL15Rα组合后定位在特定的细胞膜，从而刺激附近的效应细胞，主要是NK和CD8+T细胞。IL15与IL2关系密切，IL15与IL15Rα形成复合物后可以与IL2共用的β/γ受体结合，介导生物学活性。在抗肿瘤作用方面，IL15比IL2的一个优势是IL15/Rα不会刺激Treg的增殖。
目前，有多种IL15相关的分子在研发阶段用于治疗恶性肿瘤。其中进展最快的是ALT-803，其分子由IL15和IL15Rαsushi-hFc1形成的复合物。多个临床研究显示，ALT-803对包括黑色素瘤在内的多种肿瘤有效，但同时会出现严重的毒副作用，主要包括肝功能损害，低血压和发烧等。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够特异性识别CD276蛋白的特异性单克隆抗体，分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞；以及由所述的单克隆抗体经过人源化得到重组抗体；以及既能够识别人CD276蛋白，又能够具有人IL15功能的多功能重组抗体，可用于恶性肿瘤；同时,我们制备了改构的特异性单抗-IL15双功能分子，在保持抗肿瘤活性的同时，大幅度降低了毒副作用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够识别人CD276-ECD蛋白；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明通过用重组表达的人CD276-ECD蛋白免疫小鼠制备了能够特异性识别人CD276蛋白的鼠源单克隆抗体，命名为147#。通过生物学分析，得到所述鼠源单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列。该抗体能够有效结合CD276。通过生物学分析，所述单克隆抗体重链可变区编码122个氨基酸残基，轻链可变区编码107个氨基酸残基。
进一步地，本发明还要求保护一种重组抗体，所述重组抗体由所述的单克隆抗体147#经过人源化得到，所述重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：21所示，所述重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
作为本发明的优选实施方式，所述重组抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述重组抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
本发明发明人对所得到鼠源单克隆抗体147#序列进行进一步分析，替换人源模板的CDR区，重链可变区再与人IgG1恒定区重组，轻链可变区与人的kappa链恒定区重组，同时以该抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对各抗体的VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，最终获得人源化重组抗体，命名为hu147#。所述人源化重组抗体hu147#重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列、重链氨基酸序、轻链氨基酸序列如上述所示。
进一步地，本发明还要求保护一种多功能重组抗体，所述一种多功能重组抗体的重链包括识别人CD276的抗体功能区、人IgG1恒定区功能域、IL15功能区，以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别人CD276的抗体功能区的氨基酸序列包括所述重组抗体的重链可变区氨基酸序列。
所述IL15功能区可识别人IL2/IL15β/γ受体的功能域。
本发明发明人进一步改造了上述得到的人源化抗体，将抗体重链序列与具有IL15功能的序列相连接，进一步得到既能够识别人CD276蛋白，又具有IL15功能的重组抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述人IgG1恒定区功能域为人IgG1恒定区，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
更优选地，所述人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。
本发明发明人通过使用含有突变的人IgG1恒定区的序列，得到的CD276靶向的IL15重组抗体代谢周期更短，毒副作用更低，安全性更佳。
作为本发明的优选实施方式，所述人IL15功能区的氨基酸序列如SEQ IDNO：28所示。
更优选地，所述人IL15功能区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
SEQ ID NO：29所示的优选人IL15的功能区的氨基酸序列为人IL15Rsushi与人IL15通过(GGGGS)6连接形成单链IL15，即IL15sc。
作为本发明的优选实施方式，所述CD276靶向的IL15重组抗体中用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段为GGGGS重复。该linker在构建稳定、具有生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用，能够保证蛋白的正确折叠、保持生物活性以及提高蛋白产量等。
更优选地，所述GGGGS重复为(GGGGS)3。
作为本发明的优选实施方式，所述多功能重组抗体的人IgG1恒定区功能域氨基酸序列如SEQ ID NO：8；所述多功能重组抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO：30所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
本发明制备了一种能够识别CD276并具有IL15功能的多功能抗体，命名为SPGL007。
更优选地，所述多功能重组抗体的人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述多功能重组抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；所述多功能重组抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
利用所述优选的多功能重组抗体序列制备得到的多功能重组抗体包含突变的人IgG1恒定区的序列，命名为SPGL008；多功能重组抗体SPGL008不仅能够有效识别多种肿瘤细胞中的CD276，能有效抑制多种癌细胞生长，且半衰期更短，毒性更低，安全性好。
进一步地，本发明还要求保护编码所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的核苷酸序列。
根据提供所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的氨基酸序列可得到相应的编码基因的核苷酸序列。
作为本发明的优选实施方式，所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步地，本发明还要求保护包含所述的核苷酸序列的表达载体。
通过分子生物学的方法，可构建得到含有所述的核苷酸序列的表达载体。
进一步地，本发明还要求保护包含所述的表达载体的宿主细胞。
通过细胞生物学的方法，可利用所述表达载体构建得到能够有效表达所述抗体蛋白的宿主细胞。
进一步地，本发明还要求保护所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的生物制剂的应用。
进一步地，本发明还要求保护一种生物制剂，所述生物制剂包括所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞中的至少一种。
进一步地，本发明还提供了所述单克隆抗体或所述的重组抗体，或所述多功能重组抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过人工合成或分子生物学方法得到含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体；
(2)将所述表达载体转染细胞进行蛋白表达；
(3)通过蛋白纯化得到所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体。
通过分别构建含有将上述抗体的重链或轻链序列的表达载体，转染合适的细胞进行表达和纯化，即可获得相应的抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中，通过分子生物学制备含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体为：将所述抗体的重链或轻链核苷酸序列插入至pcDNA3.4表达载体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中，用于蛋白表达的细胞为Expi-293F细胞。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中的蛋白纯化方法为通过Protein G纯化。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了一种能够特异性识别人CD276蛋白的单克隆抗体，还提供了其人源化的重组抗体。并在此基础上，发明人进一步利用CD276特异性重组抗体制备了既能够识别人CD276，又具有IL15功能的多功能重组抗体，能够有效增强原抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，本发明还通过引入突变的人IgG1恒定区，得到一种改构的特异性CD276单抗-IL15双功能分子，该双功能分子在保持体内抗肿瘤活性的同时，可有效缩短其代谢周期，从而降低了其在体内的毒副作用，大大提高了安全性。本发明的多功能重组抗体能够识别多种肿瘤细胞上的CD276，具有巨大的应用前景。
附图说明
图1 ELISA法测定鼠源抗体147#对人CD276-ECD蛋白的结合活性结果
图2流式细胞法测定鼠源单抗结合CD276结果。
图3 Western blot方法确定147#对人CD276-ECD的结合结果。
图4、图5ELISA的方法检测147#与人CD276结构域Ig-like C2-type 1区域内多肽的结合结果。
图6单抗147#与食蟹猴CD276-ECD抗原的交叉活性测定结果。
图7 ELISA法测定人源化抗体hu147和突变的人源化抗体hu147mu对人CD276-ECD的结合活性结果。
图8 ELISA法测定SPGL008和SPGL007对人CD276-ECD的结合活性结果。
图9 SPGL008同时结合人CD276和人CD122/132活性结果。
图10A、10B SPGL008的促细胞增殖活性结果。
图11 SPGL008在抑制小鼠结直肠癌细胞MC38移植瘤生长结果。
图12 SPGL008抑制人肺癌细胞NCI H1975移植瘤生长的结果。
图13 SPGL008联合HER2单抗抑制人乳腺癌细胞JIMT-1移植瘤在裸小鼠体内的生长结果。
图14 SPGL008在huFcRn转基因小鼠体内代谢结果。
图15流式检测SPGL008与多种肿瘤细胞结合的结果。
图16 SPGL008放置0周蛋白情况。
图17为SPGL008 4℃放置5周蛋白情况。
图18 SPGL008 37℃放置5周蛋白情况。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1抗原免疫动物以及杂交瘤的制备和筛选
步骤1：抗原免疫小鼠
用重组表达的人CD276-ECD蛋白(购自北京百普赛斯公司，Acro BIOSYSTEMS，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)常规皮下免疫Balb/c小鼠。第1天，人CD276-ECD蛋白与弗氏完全佐剂(CFA，Sigma公司)乳化充分混匀后，对Balb/c小鼠进行皮下注射(50μg/鼠)，第14天和第36天，人CD276-ECD蛋白与弗氏不完全佐剂乳化(IFA，Sigma公司)充分混匀后，对Balb/c小鼠进行皮下加强免疫(50μg/鼠)，第50天，腹腔内注射人CD276-ECD蛋白50μg/鼠激发，3～4天后，取小鼠脾脏进行融合实验。
步骤2：杂交瘤的制备和筛选
在小鼠末次冲击免疫后3～4天，使用常规的杂交瘤技术方案，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG(PEG1450,Sigma公司)法融合。融合后的细胞在完全培养基中悬浮均匀，完全培养基即将RPMI1640和DMEM F12培养基1：1混匀后加入1％的Glutamine(谷氨酰胺，Gibco公司)，1％ Sodium pyruvate(丙酮酸钠，Gibco公司)，1％MEM-NEAA(最小基本培养基-非必需氨基酸溶液，Gibco公司)，1％Penicillin-streptomycin(青霉素-链霉素，Gibco公司)，50μM的β-巯基乙醇(Gibco公司)及20％FBS(胎牛血清，Gibco公司)组成的培养基；按105个细胞/100μl/孔，分入96孔培养板中培养过夜，次日，每孔加入100μl孔含有2×HAT(Sigma公司)的完全培养基，使96孔板内培养液为200μl/孔(含1×HAT)。在7～12天后，收获上清液，通过间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选人CD276-ECD蛋白结合活性阳性的杂交瘤孔。
其中，间接酶联免疫吸附测定法筛选人CD276-ECD蛋白活性阳性的杂交瘤孔的方法如下：将重组人CD276-ECD蛋白以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH 9.6)稀释至1μg/ml，100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜。PBST洗板3次，加入200μl/孔封闭液(2％BSA-PBST)，37℃放置1h后PBST洗板1次待用。将收取的杂交瘤上清液依次加入封闭后的酶标板，100μl/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam,货号ab6789)，37℃放置30min；PBST洗板5次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μl 2MH2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原人CD276-ECD蛋白结合能力。
在含血清完全培养基中扩增筛选获得的10株杂交瘤细胞株，离心换液至无血清培养液SFM培养基，使细胞密度为1～2×107/ml，在5％ CO2，37℃条件下培养2周，离心获取培养上清，通过Protein G亲和层析进行纯化，获得鼠源抗人CD276-ECD蛋白单克隆抗体，命名为147#。
实施例2 ELISA法测定鼠源抗体147#对人CD276-ECD蛋白的结合活性
间接酶联免疫吸附测定法测定鼠源抗体对人CD276-ECD蛋白的结合能力。具体方法如下：预先包被人CD276-ECD蛋白，以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH 9.6)稀释至2μg/ml包板，4℃，过夜；再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，将以1％BSA-PBST梯度稀释的待测抗体依次加入封闭后的酶标板，100μl/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(Millipore公司)，37℃放置30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μl 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原人CD276-ECD蛋白的结合能力。
结果如图1所示，抗体147#有很好的结合活性,结合人CD276-ECD蛋白的EC50为38.35ng/ml，即0.26nM。
实施例3流式细胞法测定鼠源单抗结合CD276
通过流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)的方法测定147#对人肾癌细胞A498的结合亲和力。
本实验以人肾癌细胞A498作为靶细胞，将100μl按照6倍梯度从10000ng/ml连续稀释4个梯度的147#作为一抗，分别与悬浮于100μl RPMI-1640无血清培养基(购自Gibco公司，货号22400089)中的1×105个A498细胞于4℃孵育1h(147#的最高工作浓度为5ug/ml，最低为23ng/ml)，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的147#，再将细胞与100μl、2μg/ml、AlexaFluor 488标记的抗鼠荧光二抗(购自Thermo，invitrogen公司，货号A11001)于4℃孵育30min，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的二抗，最后将细胞重悬在100μl PBS中，通过流式细胞仪测定147#对该细胞的结合亲和力，所得数据通过GraphPad Prism 6软件拟合分析。
结果如图2所示，结果表明147#可以特异性结合细胞表面CD276高表达的人肾癌细胞A498，其EC50为59.15ng/ml，即0.39nM。
实施例4 147#结合抗原表位的测定
4.1. 147#与还原变性的CD276-ECD结合能力的测定
通过蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法测定147#与还原变性的人CD276-ECD的结合能力。
将还原变性的人CD276-ECD进行SDS-PAGE电泳(400ng/泳道)后，通过电转移法转印至PVDF膜，于1％ BSA-TBST中封闭(室温震荡1h)，加入1μg/mL(1％ BSA-PBST稀释)的鼠源抗体147#，室温震荡孵育2h，PBST洗3次后，加入HRP标记羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam公司，货号ab6789，按说明书以1％BSA-PBST稀释10000倍)，室温震荡孵育1h后，PBST洗3次后，PVDF膜上滴加适量PierceTMECL Western印迹底物溶液(购自Thermo公司，货号32209)，室温避光于生物分子成像仪(购自Thermo公司，型号CL1500)上自动成像。
结果如图3所示，在CD276-ECD目标位置之间出现了特异的免疫印迹，说明147#可以特异性结合还原变性的人CD276-ECD，提示了抗体147#特异性结合人CD276-ECD蛋白的表位为线性表位。
4.2.单抗147#对靶抗原结合区域的确定
通过常规的Western blot和ELISA的方法确定147#对人CD276-ECD的结合区域。
为确认147#对CD276的结合表位，经查阅文献及NCBI获取人CD276的胞外域基因(CD276-ECD)基因，其中，包含了功能结构域Ig-like V-type 1(Domain1，氨基酸序列如SEQID NO：16)、功能结构域Ig-like C2-type 1(Domain2，氨基酸序列如SEQ ID NO：17)。将CD276功能结构域Ig-like V-type 1和Ig-like C2-type1与人的Fc区(氨基酸序列如SEQID NO：18所示)拼接，分别形成V-type 1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示)、和C2-type1-Fc(氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示)，分别构建至pcDNA3.4表达载体，转染Expi-293F细胞，通过Protein A纯化获得各Fc融合蛋白。随之，参照上述5.1所述的方法，通过常规的Western blot方法测定147#对人CD276-ECD结构域Ig-like V-type 1和Ig-like C2-type1结合情况。
结果如图3所示，Western blot检测结果均表明147#只与人CD276-ECD的第二个功能结构域，即Ig-like C2-type 1结合。
4.3.单抗147#对靶抗原结合多肽的确认
通过ELISA的方法检测147#与人CD276结构域Ig-like C2-type 1区域内多肽的结合能力，进一步确认147#对人Ig-like C2-type 1结合的表位。
由4.1和4.2的结果已经确定147#可以结合变性的CD276-ECD和Ig-like C2-type1结构域，判断147#结合的表位为线性表位，可以采用合成多肽经ELISA方法检测，进一步明确147#结合表位的位置。
首先将人Ig-like C2-type 1结构域分解成相互有重叠的9个部分，每个部分合成一条N端生物素修饰的多肽，即：
1.bio-PSMTLEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
2.bio-LRPGDTVTI TCSSYQGYPE(155-174)；
3.bio-TCSSYQGYPE AEVFWQDGQG(165-184)；
4.bio-AEVFWQDGQG VPLTGNVTTS(175-194)；
5.bio-VPLTGNVTTS QMANEQGLFD(185-204)；
6.bio-QMANEQGLFD VHSILRVVLG(195-214)；
7.bio-VHSILRVVLG ANGTYSCLVR(205-224)；
8.bio-ANGTYSCLVR NPVLQQDAHS(215-234)；
9.bio-NPVLQQDAHS SVTIT(225-240)。
ELISA法测定147#与上述9个多肽的结合活性，结果如图4所示，147#只与多肽1结合，即人CD276-ECD蛋白N端的第145-154位氨基酸的多肽结合，说明147#的结合表位位于人CD276蛋白的P145至I164之间。
再通过丙氨酸扫描(将非丙氨酸的氨基酸位点分别单点突变成丙氨酸)的方式，合成了N端生物素修饰的20条多肽(下划线部分为突变的氨基酸位点)，即：
1-1.bio-ASMTLEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-2.bio-PAMTLEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-3.bio-PSATLEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-4.bio-PSMALEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-5.bio-PSMTAEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-6.bio-PSMTLAPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-7.bio-PSMTLEANKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-8.bio-PSMTLEPAKD LRPGDTVTI(145-164)；
1-9.bio-PSMTLEPNAD LRPGDTVTI(145-164)；
1-10.bio-PSMTLEPNKA LRPGDTVTI(145-164)；
1-11.bio-PSMTLEPNKD ARPGDTVTI(145-164)；
1-12.bio-PSMTLEPNKD LAPGDTVTI(145-164)；
1-13.bio-PSMTLEPNKD LRAGDTVTI(145-164)；
1-14.bio-PSMTLEPNKD LRPADTVTI(145-164)；
1-15.bio-PSMTLEPNKD LRPGATVTI(145-164)；
1-16.bio-PSMTLEPNKD LRPGDAVTI(145-164)；
1-17.bio-PSMTLEPNKD LRPGDTATI(145-164)；
1-18.bio-PSMTLEPNKD LRPGDTVAI(145-164)；
1-19.bio-PSMTLEPNKD LRPGDTVTA(145-164)；
1-20.bio-PSMTLEPNKD LRPGDTVTI(145-164)；
结果如图5所示，SPGA03-147对肽1-7、1-10、1-11、1-12、1-14、1-15几乎不结合，对肽1-9和1-17的结合稍有减弱，而对其他多肽的结合与原始多肽(PEP1)一致，说明多肽PEP1中氨基酸P/D/L/R/G/D对147#结合最关键，氨基酸K/V次之，即人CD276蛋白中P151/D154/L155/R156/G157/D158是单抗147#结合的最关键位点，而K153/V161是次关键位点。
实施例5单抗147#与食蟹猴CD276-ECD抗原的交叉活性测定
间接酶联免疫吸附测定法测定147#对食蟹猴CD276-ECD(购自北京百普赛斯公司，Acro BIOSYSTEMS，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)和小鼠CD276-ECD(购自北京百普赛斯公司，Acro BIOSYSTEMS，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)的结合能力。具体方法方法如下：间接酶联免疫吸附测定法测定鼠源抗体对人CD276-ECD蛋白的结合能力。具体方法如下：预先包被食蟹猴和小鼠CD276-ECD蛋白，以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH 9.6)稀释至2μg/ml包板，4℃，过夜；再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，将以1％BSA-PBST梯度稀释的待测抗体依次加入封闭后的酶标板，100μl/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(Millipore公司)，37℃放置30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μl 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原食蟹猴和小鼠CD276-ECD蛋白的结合能力。
结果如图6所示，147#抗体结合猴CD276-ECD蛋白的EC50为30.16ng/ml，即0.2nM，与结合人CD276-ECD的EC50一致(38.35ng/ml)；147#抗体不结合小鼠源CD276-ECD。
实施例6人源化抗体hu147的制备
本实施例通过分子生物学的相关方法获取杂交瘤147#的重链可变区和轻链可变区，并进一步构建嵌合抗体。
通过Trizol提取147#杂交瘤细胞的RNA并进行mRNA反转录获取cDNA，随后以cDNA为模板，分别用鼠源抗体的重链和轻链简并引物(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel，组合引物的序列来自第323页)进行PCR，对所获得的PCR产物进行测序并通过kabat数据库分析，确定所获得的序列为鼠源抗体的可变区序列。
相关序列信息如下：
147#的重链可变区基因序列，全长均为366bp，编码122个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
147#的轻链可变区基因序列，全长均为321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
对鼠源抗体147#轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则确定鼠源抗体147#的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。其中，147#重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：KTSGYIFT(SEQ ID NO：10)、HCDR2：IGRIYP(SEQ ID NO：11)、HCDR3：ARGGEVRRDFYALDY(SEQ ID NO：12)；轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：KASENVGTY(SEQ ID NO：13)、LCDR2：GASNRYT(SEQ ID NO：14)和LCDR3：GQRYSYPFT(SEQ IDNO：15)。
在Germline数据库中选取与上述各鼠源抗体FR区匹配最好的人源化模板。然后将鼠源抗体的CDR区移植到所选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，重链可变区再与人IgG1恒定区重组，轻链可变区与人的kappa链恒定区重组，同时以该抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对各抗体的VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，分别形成人源化抗体重链可变区(hu147 VH，氨基酸序列如SEQ IDNO：21)和人源化抗体轻链可变区(hu147 VL，氨基酸序列如SEQ ID NO：22)；hu147 VH与人IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：8)拼接形成人源化抗体重链(hu147H，氨基酸序列如SEQ ID NO：23)；hu147 VL与人kappa链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：9)拼接，形成人源化抗体轻链(hu147 L，氨基酸序列如SEQ ID NO：24)。分别构建人源化抗体的重链和轻链至pcDNA3.4表达载体，转染Expi-293F细胞，通过ProteinA纯化获得人源化抗体hu147，并通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定各抗体分子量大小正确及纯度>95％。
实施例7 Fc突变的人源化抗体(hu147mu)的制备
对hu147重链可变区序列与突变的人IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示)拼接，形成hu147mu的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)，轻链同hu147(氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)，分别构建至pcDNA3.4表达载体，转染Expi-293F细胞，通过Protein G纯化获得抗体hu147mu，通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定所表达各抗体分子量在150kD左右，抗体纯度>95％，定量，分装，冻存于-80℃备用。
实施例8 ELISA法测定人源化抗体hu147和突变的人源化抗体hu147mu对人CD276-ECD的结合活性
通过ELISA法测定上述人源化抗体hu147，hu147mu对人CD276-ECD的结合亲和力，相关实验方法参照实施例2。
实验结果如图7所示，人源化抗体hu147和hu147mu结合人CD276-ECD的EC50分别为6.70ng/ml和6.80ng/ml和，即0.04nM和0.05nM，均较147#明显提高(EC50为0.26nM)表明hu147和hu147mu对人CD276-ECD具有良好的亲和力，而且Fc的上述突变不影响与抗原的结合。
实施例9制备hu147-IL15双功能分子SPGL008和SPGL007
人IL15Rsushi氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；人IL15氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；人IL15Rsusi与人IL15通过(GGGGS)6连接形成单链IL15，即IL15sc(SEQ ID NO：29所示)；hu147重链序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示)与人IL15sc序列通过(GGGGS)3拼接，形成SPGL007的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)；hu147mu重链序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)与人IL15sc序列通过(GGGGS)3拼接，形成SPGL008的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示)；轻链同hu147(氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)；SPGL007的重链、轻链共转染转染Expi-293F细胞，通过Protein G纯化获得双功能抗体SPGL007；SPGL008的重链、轻链共转染转染Expi-293F细胞，通过Protein G纯化获得双功能抗体SPGL008；通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定所表达各抗体分子量在190kD左右，抗体纯度>95％，定量，分装，冻存于-80℃备用。
实施例10 ELISA法测定SPGL008和SPGL007对人CD276-ECD的结合活性
通过ELISA法测定上述SPGL008和SPGL007对人CD276-ECD的结合亲和力，相关实验方法参照实施例2。
实验结果如图8所示，SPGL008和SPGL007结合人CD276-ECD的EC50分别为31.51ng/ml和32.75ng/ml，即0.16nM和0.17nM，虽然较均hu147(0.05nM)或hu147mu(0.04nM)有所下降，但仍然维持较高的亲和力。
实施例11 SPGL008同时结合人CD276和人CD122/132
采用ELSA方法测定结合CD276-ECD的SPGL008、SPGL007与人CD122/132的结合，说明SPGL008具有同时结合CD276和CD122/132的功能。方法如下：预先包被人CD276-ECD蛋白，以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH 9.6)稀释至2μg/ml包板，4℃，过夜；再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，将以1％BSA-PBST梯度稀释待测抗体至1ug/ml，加入封闭后的酶标板，100μl/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入梯度稀释的生物素标记的CD122/132(购自北京百普赛斯公司)，37℃，1小时，PBST洗板3次后加入稀释的HRP标记的SA(Pierce公司)，37℃放置30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μl 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与人CD122/132的结合能力。
结果如图9所示，抗体SPGL008和SPGL007均有很好的结合活性,在本实验条件下，结合人CD122/132蛋白的EC50分别为17.71ng/ml和15.08ng/ml，即0.09nM和0.08nM；作为对照，hu147虽然能够结合CD276(实施例8所示)，但不能结合CD122/132。
实施例12 SPGL008的促细胞增殖活性
本实施例以CTLL2细胞增殖实验说明SPGL008和SPGL007的生物学活性。方法如下：CTLL2细胞以含10％FBS的1640培养液稀释至5×104/ml，100ul/孔加入细胞培养板。将IL2以含10％FBS的1640培养液稀释至30ng/ml，后3倍比稀释共8个梯度后分别加入上述含CTLL2细胞的培养板；将SPGL008和SPGL007以含10％FBS的1640培养液稀释至5000ng/ml，后3倍比稀释共8个梯度后分别加入上述含CTLL2细胞的培养板；CO2细胞培养箱培养72小时后，以CCK8测定各孔的相对细胞数，并计算EC50，判定样品的活性。
结果如图10A所示，SPGL008和SPGL007均可以刺激CTLL2细胞的增殖，EC50分别为103.0ng/ml和91.0ng/ml，即0.53和0.48nM，说明SPGL008具有与SPGL007一致的生物学活性。作为对照，如图10B所示，IL2的EC50为0.74ng/ml，即0.048nM。
实施例13 SPGL008较SPGL007在小鼠体内的毒性明显下降
SPGL008和SPGL007于第1天、第3天，腹腔注射C57BL/6小鼠(维通利华公司)共2次，注射体积为0.2ml/次，SPGL008和SPGL007均按0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg剂量给药，每天观察实验小鼠的死亡情况，对照组给药同体积的PBS。
结果如表1所示，在实验第10天，SPGL008组在0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg剂量下，所有实验动物存活(存活率100％)，在4.0mg/kg剂量下，70％实验动物死亡(存活率30％)；但SPGL007组在4.0mg/kg、2.0mg/kg剂量下，100％实验动物死亡(存活率0％)，在1.0mg/kg剂量下，60％实验动物死亡(存活率40％)，在0.5mg/kg剂量下，无实验动物死亡(存活率100％)。这些结果说明，Fc突变后，SPGL008对实验小鼠的毒性较SPGL007明显下降。
表1各剂量组实验动物存活率
抗体 0.5mg/kg 1.0mg/kg 2.0mg/kg 4.0mg/kg
SPGL007 100％ 40％ 0％ 0％
SPGL008 100％ 100％ 100％ 30％
实施例14 SPGL008在抑制小鼠结直肠癌细胞MC38移植瘤生长
本实施例采用小鼠结直肠癌细胞MC38移植瘤模型评价SPGL008和SPGL007的体内抗肿瘤活性。实验方法如下：
收集体外培养的小鼠结肠癌MC38细胞，将细胞悬液浓度调整为1×107/ml。在无菌条件下，接种100μl细胞悬液于C57BL/6小鼠右侧肋部皮下。小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至100-200mm3后将动物随机分组，6只/组。SPGL008和SPGL007均按0.5mg/kg给药，对照组给等量PBS，每周腹腔注射给药2次，给药体积0.2ml/次，连续给药2周。整个实验过程中，每周3次测量移植瘤直径，同时称小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：
TV＝1/2×a×b2
其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100
抑瘤率TGI(％)＝100-T/C(％)
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
结果如图11所示，SPGL008和SPGL007均体现了较强的抗肿瘤活性，TGI分别为76.2％和69.4％，相差不显著(p>0.05)，说明Fc突变的SPGL008不影响体内抗肿瘤活性。
实施例15 SPGL008抑制人肺癌细胞NCI H1975移植瘤生长
收集体外培养的人肺癌NCI-H1975细胞，将细胞悬液浓度调整为8×107/ml。在无菌条件下，接种100μl细胞悬液于裸小鼠右侧肋部皮下。待肿瘤细胞在小鼠皮下形成实体肿瘤，用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至50-100mm3后将动物随机分组。按照1.0mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg剂量，每周3次，腹腔注射给药，共6次。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。余同实施例14。
结果如图12所示，SPGL008体现了较强的抗肿瘤活性，1.0mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg剂量下，TGI分别为70.0％、60.8％和62.5％。
实施例16 SPGL008联合HER2单抗抑制人乳腺癌细胞JIMT-1移植瘤在裸小鼠体内的生长
收集体外培养的人乳腺癌JIMT-1细胞，将细胞悬液浓度调整为8×107/ml。在无菌条件下，接种100μl细胞悬液于裸小鼠右侧肋部皮下。待肿瘤细胞在小鼠皮下形成实体肿瘤，用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至50-100mm3后将动物随机分组。单药组HER2单抗(曲妥珠)按照20mg/kg剂量，联合组由固定剂量20mg/kg曲妥珠分别联合1.0mg/kg和0.3mg/kg的SPGL008给药，每周2次，腹腔注射给药，共6次。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。余同实施例15。
结果如图13所示，曲妥珠单抗组体现了较弱的抗肿瘤作用，TGI为55％，说明JIMT-1是对曲妥珠耐受的肿瘤；SPGL008剂量1.0mg/kg联合曲妥珠的TGI达到90％，而且50％(3/6)肿瘤完全消失(CR)；即使SPGD008剂量在0.3mg/kg下，联合曲妥珠，TGI也达到72％，抗肿瘤效果明显高于曲妥珠单药。
实施例17 SPGL008在huFcRn转基因小鼠体内代谢
采用人FcRn转基因小鼠测定SPGL007和SPGL008的药代动力学。方法如下：8只小鼠分两组，分别按1mg/kg剂量，腹腔注射SPGL007和SPGL008，2小时、6小时、24小时、48小时和72小时后取血，获取血清。血清作适当稀释后，采用ELISA法测定血药浓度，方法基本同实施例11。
结果如图14所示，Fc突变的SPGL008较Fc野生型的SPGL007在人FcRn转基因小鼠体内的代谢明显加快，半衰期分别为10小时和18小时，相差显著。
实施例18 SPGL008检测多种肿瘤细胞CD276的表达
采用流式细胞术进行，检测方法基本同实施例3。
结果如图15所示，SPGL008可以结合多种人肺癌细胞(H1975、Calu-3、A549、H322、H292)，结合人乳腺癌细胞(JIMT-1),结合人肾癌细胞(A498)结合人皮肤癌细胞(A431)，提示上述多种肿瘤可能成为SPGL008的适应症。
实施例19 SPGL008具有良好的稳定性
采用分子筛高效液相色谱(SEC-HPLC)检测SPGL008放置不同时间后纯度的变化，考察SPGL008的稳定性。方法如下：
采用TSKgel G3000SWXL色谱柱(TSK公司)，在HPLC Ultimate 3000(Thermo公司)色谱仪上进行。检测流动相为PBS(pH 7.4)，恒定流速0.8ml/min，上样量为100ug/100ul。采用280nM吸收峰积分法计算目标蛋白在总蛋白中的含量(％)来表示纯度。
结果如图16、图17和图18所示，SPGL008在PBS溶液中，0周是纯度为84.9％，4℃放置5周后，纯度为84.0％，变化率<2％；37℃放置5周后，纯度为83.9％，变化率<2％，表明SPGL008在PBS缓冲液中，4℃和37℃条件下均保持稳定。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够识别人CD276-ECD蛋白；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体由权利要求1所述的单克隆抗体经过人源化得到，所述重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
3.一种多功能重组抗体，其特征在于，所述多功能重组抗体的重链包括识别人CD276的抗体功能区、人IgG1恒定区功能域、人IL15的功能区，以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别人CD276的抗体功能区的氨基酸序列包括如权利要求2所述重组抗体的重链可变区氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的多功能重组抗体，其特征在于，所述人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述多功能重组抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
5.编码如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述CD276靶向的IL15重组抗体的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求5所述的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述CD276靶向的IL15重组抗体；或如权利要求5所述的核苷酸序列，或如权利要求6所述的表达载体，或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的生物制剂的应用。
9.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述CD276靶向的IL15重组抗体；或如权利要求5所述的核苷酸序列，或如权利要求6所述的表达载体，或如权利要求7所述的宿主细胞中的至少一种。
10.如权利要求1所述单克隆抗体或如权利要求2所述的重组抗体，或如权利要求3或4所述CD276靶向的IL15重组抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过人工合成或分子生物学方法得到含所述单克隆抗体或重组抗体或CD276靶向的IL15重组抗体的基因片段的表达载体；
(2)将所述表达载体转染细胞进行蛋白表达；
(3)通过蛋白纯化得到所述单克隆抗体或重组抗体或CD276靶向的IL15重组抗体。
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