CN116063411A - 新型冠状病毒抗原多肽及其重组腺相关病毒和制备疫苗的应用 - Google Patents

新型冠状病毒抗原多肽及其重组腺相关病毒和制备疫苗的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SARS‑COV‑2病毒抗原多肽、重组腺相关病毒及其应用，本发明采用新冠病毒SARS‑COV‑2的抗原多肽S蛋白或者RBD结构域作为抗原，截断的结构域序列长度短、分子量更小、结构更明确，具有特异性；包含编码该类抗原多肽核酸序列的重组腺相关病毒通过肌肉注射实现基因的递送，可有效持续的表达抗原多肽；本发明的重组腺相关病毒在体内表达的抗原多肽可诱导针对SARS‑COV‑2病毒抗原多肽的特异性免疫应答，其产生的抗体血清不仅能特异性识别SARS‑COV‑2的RBD抗原多肽，还具有中和效价，能抑制变异型毒株Delta、Omicron的复制、传播或阻止其在宿主体内定居，从而能有效预防和/或治疗SARS‑CoV‑2病毒引起的新型冠状病毒肺炎。

Description

新型冠状病毒抗原多肽及其重组腺相关病毒和制备疫苗的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及新型冠状病毒抗原多肽及其重组腺相关病毒和制备疫苗的应用。
背景技术
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)隶属β-冠状病毒属，是一种单链RNA病毒，基因组大小约为30kDa。SARS-CoV-2隐匿性和传染性很强，随着SARS-CoV-2在各国扩散，其自身不断发生变化或发生基因变异，新的病毒变异在死亡率、传播和逃避疫苗方面有所升高，使其更具破坏性。SARS-CoV-2变异的突变动态所造成的免疫逃逸对整个世界构成了不可预见的危险，因此，必须加快针对变异型毒株疫苗的开发。
现有技术中SARS-CoV-2疫苗基本对变异型毒株如Delta的效力都极大降低，中国专利公开了一种针对新冠病毒变异型毒株Delta的融合蛋白、喷鼻式疫苗及其制备方法，其融合蛋白为蛋白S、蛋白M和核衣壳蛋白N融合形成，但该疫苗需要包括其所用3种蛋白的编码基因，基因序列较长，表达的蛋白较为复杂，且疫苗效果单一。为了丰富应对SARS-COV-2变异型毒株Delta，且应对SARS-COV-2的变异，需要开发更多简单稳定且可对多种SARS-COV-2变异型毒株Delta和Omicron均有效的高传播性及位点突变的新型疫苗。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术的不足，研发设计了SARS-COV-2新型抗原多肽，并提供了该抗原多肽的表达载体、抗原多肽重组腺相关病毒的制备方法，以及重组腺相关病毒在制备预防新冠病毒肺炎疫苗中的应用。
本发明的目的是提供SARS-COV-2病毒新型抗原多肽。
本发明再一目的是提供包含上述抗原多肽的重组腺相关病毒表达载体。
本发明再一目的是提供上述抗原多肽及其重组腺相关病毒在制备新冠肺炎疫苗中的应用。
本发明再一目的是提供一种SARS-COV-2病毒疫苗。
本发明再一目的是提供一种SARS-COV-2病毒疫苗的制备方法。
本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明提供一种SARS-COV-2抗原多肽，其氨基酸序列为以下氨基酸序列中的一种：
(1)SEQ ID NO.1所示序列；
(2)SEQ ID NO.2所示序列；
(3)SEQ ID NO.3所示序列；
(4)SEQ ID NO.4所示序列。
其中，SEQ ID NO.1为将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的R682RAR685位点突变为G682SAS685，和K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列；
SEQ ID NO.3为将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的R682RAR685位点突变为S682RAG685，和K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列；
SEQ ID NO.4为SARS-CoV-2变异型毒株Delta的基因序列的第319-593的氨基酸序列，其为S蛋白的刺突蛋白受体RBD结构域。
本方案还请求保护编码上述抗原多肽的核苷酸序列。
进一步的，所述编码抗原多肽的核苷酸序列经过人源密码子优化；
本方案还请求保护包含上述抗原多肽的重组腺病毒表达载体。
进一步的，所述表达载体含有腺相关病毒反向末端重复序列、编码信号肽的核苷酸序列，以及编码上述抗原多肽的核苷酸序列。
优选的，所述腺相关病毒反向末端重复序列选自如下序列：SEQ ID NO.8-10.
进一步的，所述的表达载体还含有必须的表达调控元件，如启动子序列、上游调节区域、编码区、转录调控元件、终止子等。
进一步的，上述信号肽为以下信号肽中的一种：
(1)tPA信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)新型tPA信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)天然信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
tPA信号肽为人类组织型纤溶酶原激活物的信号肽；新型tPA信号肽为tPA信号肽第22位氨基酸由脯氨酸(P)突变为丙氨酸(tPA22P/A)；天然信号肽为新冠病毒S刺突蛋白的信号肽。
进一步的，所述的腺相关病毒反向末端重复序列来自血清型腺相关病毒2型。
本方案还请求保护上述抗原多肽、编码上述抗原多肽的核苷酸序列、包含上述抗原多肽的表达载体或上述重组腺相关病毒在制备预防新冠病毒肺炎疫苗中的应用。
优选的，所述新冠病毒肺炎由变异型毒株Delta和或变异型毒株Omicron引起的。
进一步的，所述的疫苗还包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。
本方案还请求保护以上述抗原多肽为抗原制备得到的SARS-COV-2病毒疫苗。
本方案还请求保护由包含编码上述抗原多肽核苷酸序列的表达载体表达得到的SARS-COV-2病毒疫苗。
进一步的，所述的表达载体为表达上述抗原多肽的重组腺相关病毒。
进一步的，所述疫苗的剂型为注射剂。
更优选的，所述疫苗的剂型为肌肉注射剂。
本方案还请求保护一种SARS-COV-2病毒疫苗的制备方法，通过以下步骤制备：
将pHelper、pRep2Cap5和表达上述抗原多肽的表达载体共孵育；在转染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞；培育细胞后，离心收集细胞，经过裂解和纯化，得到SARS-COV-2病毒疫苗。
相对于现有技术，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用新冠病毒SARS-COV-2病毒的抗原多肽S蛋白或者RBD结构域作为抗原，截断的结构域序列短、分子量更小具有特异性；该类抗原多肽核酸序列在重组腺相关病毒上通过肌肉注射实现基因的递送，可有效持续的表达抗原多肽。
(2)本发明的重组腺相关病毒在体内表达的抗原多肽可诱导针对SARS-COV-2变异型毒株Delta和Omicron抗原多肽的特异性免疫应答，其产生的抗体血清不仅能特异性识别SARS-COV-2的RBD抗原多肽，还对变异型毒株Delta和Omicron具有中和效价，该疫苗能抑制SARS-CoV-2变异型毒株Delta和Omicron的复制、传播或阻止其在宿主体内定居，从而能有效预防和/或治疗SARS-CoV-2变异型毒株Delta和Omicron引起的新型冠状病毒肺炎，本疫苗对于SARS-CoV-2的多种毒株均有较好的效果。
附图说明
图1为疫苗1构建完成的表达载体图谱示意图；图中，各关键元件描述如下：ITR是指AAV2的反向末端重复序列；tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.1序列；WPRE是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；SV40polyA是指猴空泡病毒40(SV40)多聚腺苷酸序列。
图2为疫苗2构建完成的表达载体图谱示意图；图中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.2序列；其他关键元件同图1。
图3为疫苗3构建完成的表达载体图谱示意图；图中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.6序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1。
图4为疫苗4构建完成的表达载体图谱示意图；图中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1。
图5为疫苗5构建完成的表达载体图谱示意图；图中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.7序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1。
图6为疫苗6构建完成的表达载体图谱示意图；图中，CMV为巨细胞病毒增强子，chickenβ-actin为启动子剪接受体；tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike-RBD是指SEQ ID NO.4序列；WPRE是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；SV40polyA是指猴空泡病毒40(SV40)多聚腺苷酸序列。
图7为重组腺相关病毒疫苗1-6免疫C57小鼠后，采用ELISA检测对第40天抗体血清中IgG抗体表达的影响。
图8为重组腺相关病毒疫苗4经不同免疫方式免疫C57小鼠后，采用ELISA检测对第40天抗体血清中IgG抗体表达的影响。
图9为重组腺相关病毒疫苗1-6免疫C57小鼠后第40天进行血清针对SARS-CoV-2变异型毒株Delta病毒中和试验的结果。
图10为重组腺相关病毒疫苗1-6免疫C57小鼠后第60天进行血清针对SARS-CoV-2变异型毒株Omicron病毒中和试验的结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
在本发明的描述中，将使用以下术语，简要说明定义如下：
载体是指遗传物质的递送工具或元件，例如质粒、病毒、病毒类似颗粒、噬菌体等，该术语还经常根据应用类型或场景称为克隆载体、表达载体或骨架载体，以及病毒载体。
rAAV载体是指重组非复制型的腺相关病毒，rAAV载体包括血清型蛋白衣壳，并封装着重组的基因组，基因组包括功能性的5’和3’反向末端重复序列(ITR序列)，并侧接外源核苷酸序列替代野生型AAV的rep或者cap基因。ITR序列提供对rAAV功能性拯救、复制、包装。在一些实施例中，ITR序列来自AAV2。外源核苷酸序列通常由一系列表达调控元件和编码区组成。
AAV血清型质粒pREPCAP包括两个开放阅读框(ORF)，编码Rep和Cap表达产物。Cap是指本领域技术人员熟悉的AAV的衣壳蛋白，编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3及AAP等功能性蛋白，不同血清型的AAV有不同的衣壳蛋白序列。
AAV辅助质粒pHelper通常包括腺病毒VA RNA、E4 ORF6、E2A、E1B等编码区域提供AAV复制必须的功能。
表达调控元件通常为启动子序列、上游调节区域、编码区、转录调控元件等的集合，共同实现在受体细胞中编码区序列的复制、转录和翻译。启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。在一些案例里，启动子序列选用CAG启动子，合适的启动子还包括本领域技术人员已知的启动子，例如人巨细胞病毒(CMV)启动子，泛素C启动子(UbC)、EF1α启动子等，任选地，可以选择作为表达调控序列mRNA的转录。在一些案例中选用SV40polyA作为转录终止子。合适的polyA序列包括不限于本领域已知的SV40、BGH、合成polyA等。一些案例里还包括增强转录的调控元件土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，增强翻译效率的序列(Kozak序列)。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商提供说明书条件。
实施例1构建AAV表达载体质粒
1、抗原多肽获取
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取SARS-COV-2毒株Delta的基因序列(GenBank accession no.OM471068.1)，用Uniprot blast(https://www.uniprot.org/blast/)通过uniprotkb_refprotswissprot数据库预测变异型毒株Delta的S蛋白序列内的保守结构域，以及RBD结构域。
并对变异型毒株Delta的S蛋白和RBD结构域进行如下处理：
(1)突变获得SEQ ID NO.1所示序列；
具体是将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的R682RAR685位点突变为G682SAS685，和K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列。
(2)突变获得SEQ ID NO.2所示序列；
具体是将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列。
(3)突变获得SEQ ID NO.3所示序列；
具体是将SARS-CoV-2变异型毒株Delta的S蛋白的R682RAR685位点突变为S682RAG685，和K986V987位点突变为P986P987得到的第13-1208氨基酸序列。
(4)获得SEQ ID NO.4所示序列。
具体是SARS-CoV-2变异型毒株Delta的基因序列的第319-593的氨基酸序列，其为S蛋白的刺突蛋白受体RBD结构域。
2、构建表达载体
将获取的序列拼接在tPA信号肽之后，通过GenSmart Optimization(VersionBeta 1.0)进行人源密码子优化，并使用DNAWorks(v3.2.4)(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)设计引物使用
Figure BDA0003850183410000071
HS DNA Polymerase(Takarabio)扩增合成序列，利用内切酶FastDigestTMEcoRI和FastDigestTMHindIII(ThermoFisher)酶切腺相关病毒骨架载体pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA，采用的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组试剂盒(南京诺唯赞)进行同源重组连接反应，经转化大肠杆菌DH5ɑ，涂于氨苄抗性的培养皿，16小时后挑取菌落检测，将阳性克隆送至测序公司(苏州金唯智)进行测序，将测序结果正确的质粒命名为表达载体1，表达载体1全序列如SEQ ID NO.15所示，其各元件组成和顺序见图1。图中，AAV2ITR(alternate)对应腺相关病毒反向末端重复序列见表1中序列SEQ ID NO.8；tPA signal为信号肽是指SEQ IDNO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.1序列；WPRE3是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，见序列SEQ ID NO.13；SV40late poly(A)signal是指猴空泡病毒40(SV40)多聚腺苷酸序列，见序列SEQ ID NO.14。
依照上述方法构建表达载体2-6，其各元件序列见下表1。
表达载体2构建完成的载体图谱示意图为图2，其中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.2序列；其他关键元件同图1，表达载体2全序列如SEQ ID NO.16所示。
表达载体3构建完成的载体图谱示意图为图3，其中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.6序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1，表达载体3全序列如SEQ ID NO.17所示。
表达载体4构建完成的载体图谱示意图为图4，其中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1，表达载体4全序列如SEQ ID NO.18所示。
表达载体5构建完成的载体图谱示意图为图5，其中，tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.7序列；Delta(B.1.617.2)-spike是指SEQ ID NO.3序列；其他关键元件同图1，表达载体5全序列如SEQ ID NO.19所示。
表达载体6构建完成的载体图谱示意图为图6，其中，CMV Enhancer-SC40intron为巨细胞病毒增强子，见序列SEQ ID NO.12，chickenβ-actin为启动子剪接受体；tPA signal为信号肽，是指SEQ ID NO.5序列；Delta(B.1.617.2)-spike-RBD是指SEQ ID NO.4序列；ITR见序列SEQ ID NO.9，WPRE3是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件同表达载体1；SV40late poly(A)signal是指猴空泡病毒40(SV40)多聚腺苷酸序列同表达载体1，表达载体6全序列如SEQ ID NO.20所示。
表1表达载体1-6中的元件及其基因序列
Figure BDA0003850183410000081
其中，表达载体1-5中的元件AAV2 ITR(alternate)对应腺相关病毒反向末端重复序列-5’端；表达载体6中的元件ITR对应腺相关病毒反向末端重复序列-5’端；表达载体1-6中的元件AAV2 ITR对应腺相关病毒反向末端重复序列-3’端；表达载体1-5中的元件SV40Promoter对应表达载体1-5的启动子；表达载体6中的元件CMV Enhancer-SC40 intron对应表达载体6的启动子；表达载体1-6中的元件WPRE3对应转录后的调控序列；表达载体1-6中的元件SV40 late poly(A)signal对应终止子。
实施例2重组腺相关病毒疫苗的制备
293T细胞在转染前24小时以每培养皿1×107个细胞的密度在150mm培养皿中接种，并加入12μg pHelper、8μg pRep2Cap5、5μg表达载体1和10μg转染试剂聚乙烯亚胺(25kD)孵育转染，转染72小时后，4℃离心收获细胞。细胞重悬在含有50mM Tris-HCl(pH值8.0)、150mM NaCl的裂解缓冲液中。收获裂解液在干冰/乙醇和37℃水浴中进行三次冻融循环。然后加入1unit/mL核酸酶和0.5％脱氧胆酸钠，细胞悬液在37℃下孵育1小时，离心20分钟，在4℃收集rAAV上清粗裂解液。粗裂解液用10mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释至10mL的最终体积，然后在超速离心管中加入按照15％、25％、40％、60％质量体积比梯度加载碘克沙醇。在18℃下用350，000×g离心1小时，收集3mL的40％下层组分和0.5mL的60％上层组分即为纯化液，用100kDa截止超滤管(Millipore)进行超滤置换为病毒保存液。重组病毒保存液为PBS磷酸缓冲液(pH值7.4)，0.05％普洛沙姆188。将纯化的rAAV标记为疫苗1，采用SYBRGreenI qPCR测定病毒滴度。使用前在-80℃冰箱保存。
疫苗2-6的制备方法同疫苗1，仅需更改表达载体2-6和上述相应元件。
实施例3免疫C57小鼠
(1)取6-8周龄的C57小鼠随机分为7组，每组5只，疫苗1-6组右后肢肌肉注射实施例2中的重组腺相关病毒疫苗1-6(浓度为2.5×1012vg/ml，注射体积为40μL)；阴性对照组注射同样剂量的重组绿色荧光蛋白腺相关病毒的空白载体AAV-GFP(浓度为2.5×1012vg/ml，注射体积为40μL)。
(2)取6-8周龄的C57小鼠随机分为2组，每组5只，疫苗4-两后肢组对小鼠后两肢肌肉分别注射积为20μL实施例2中的重组腺相关病毒疫苗4(浓度为2.5×1012vg/ml)；疫苗4-滴鼻组对小鼠进行滴鼻给药20μL实施例2中的重组腺相关病毒疫苗4(浓度为5×1012vg/ml)。
采用一次免疫方案，在第0天进行注射；分别于第40天与第60天取血，每只小鼠取血0.1mL-0.2mL，在0℃放置60分钟，4000转/分钟离心15分钟，取上层血清用于ELISA检测分析和抗体中和实验。
实施例4ELISA免疫分析
(1)用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将蛋白RBD319-541(野生型毒株)配置成浓度为0.5μg/ml的溶液，以每孔100μL的量加入96孔板，放入4℃孵育过夜；第二天放入37℃培养箱孵育1小时；用PBST(PBS+0.1％吐温20)洗板3次，每孔加入300μL洗液；洗板后加入2％脱脂奶粉，每孔加入250μL，37℃孵育1小时；用PBST(PBS+0.1％吐温20)洗板3次。分别在每个孔中加入实施例5中各组小鼠产生的抗体血清(稀释倍数1:300)，每孔加入100μL，放置在37℃培养箱孵育1小时；洗板3次后；在小鼠血清组加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG，每孔加入100μL，室温孵育1小时；洗板3次。加入TMB溶液，每孔加入100μL，室温避光显色15分钟。加入0.5M H2SO4溶液终止显色，每孔加100μL，酶标仪检测吸光度，检测波长为450nm，570nm作为背景波长。
(2)吸光度结果分析
1)将吸光度(OD)值相对于实施例2中的重组腺相关病毒疫苗作图，如图7所示，本发明实施例2中的重组腺相关病毒疫苗1-6组诱导小鼠产生的IgG抗体滴度显著高于AAV-GFP空白对照组，说明疫苗在小鼠体内诱导了强大的免疫应答；抗体滴度结果4>2>1，位点突变为S682SAG685增加了疫苗的免疫活性而位点突变为G682SAS685抗体滴度降低了，说明R682RAR685的位点的突变对疫苗的免疫活性有影响；信号肽为tPA的疫苗4与信号肽为新型tPA的疫苗3抗体滴度显著高于天然信号肽，说明不同的信号肽对疫苗的活性具有影响。
2)将吸光度(OD)值相对于不同给药方式作图，如图8所示，4-两后肢>4-右后肢>4-滴鼻，肌肉注射给药后的抗体滴度高于滴鼻给药，尤其是两后肢肌肉注射给药效果更好。
实施例5中和抗体实验
将Vero E6细胞(2×104个/孔)接种到96孔板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，直到形成单层。将SARS-CoV-2变异型毒株Delta和SARS-CoV-2变异型毒株Omicron的100TCID50分别与连续4倍稀释的小鼠抗血清混合，在37℃孵育一小时，将血清样品在56℃加热30分钟，随后加入到Vero E6细胞培养孔混合。在每种测定中，感染了100TCID50的SARS-CoV-2变异型毒株Delta和者SARS-CoV-2变异型毒株Omicron的细胞分别为阳性对照，而无病毒的细胞为阴性对照，然后在感染后第3天记录CPE(细胞病变效应)。通过Reed-Muench法计数SARS-CoV-2变异型毒株Delta和SARS-CoV-2变异型毒株Omicron分别感染Vero E6细胞数(CPE)，能使50％接种后的细胞产生细胞病变小鼠血清的最大稀释倍数，即为此疫苗的中和抗体滴度(NA)。
中和抗体滴度越高，说明病毒复制水平越低，对病毒感染的防护能力越强。将中和抗体(NA)值相对于实施例2中的重组腺相关病毒疫苗1-6作图，如图9所示，疫苗1-6组诱导的血清中和抗体滴度显著高于AAV-GFP空白对照组，表明重组腺相关病毒疫苗1-6在小鼠体内产生特异性的体液免疫应答，保护细胞免受SARS-CoV-2变异型毒株Delta的感染，疫苗的防治效果明显。
如图10所示，在针对SARS-CoV-2变异型毒株Omicron的中和抗体实验结果中，疫苗1-6组诱导的血清中和抗体滴度均高于AAV-GFP空白对照组，且疫苗1、4与5三组疫苗显著高于其他组，表明重组腺相关病毒疫苗1-6在小鼠体内产生特异性的体液免疫应答，保护细胞免受SARS-CoV-2变异型毒株Omicron的感染，疫苗的防治效果明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.SARS-COV-2病毒抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为以下氨基酸序列中的一种：
(1)SEQ ID NO.1所示序列；
(2)SEQ ID NO.2所示序列；
(3)SEQ ID NO.3所示序列；
(4)SEQ ID NO.4所示序列。
2.编码权利要求1所述抗原多肽的核苷酸序列。
3.一种重组腺相关病毒表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒表达载体，其特征在于，含有腺相关病毒反向末端重复序列、编码信号肽的核苷酸序列，以及编码权利要求1所述抗原多肽的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒表达载体，其特征在于，所述信号肽为以下中的一种：
(1)tPA信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)新型tPA信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)天然信号肽：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.权利要求1所述抗原多肽、权利要求2所述DNA分子、权利要求3-5任一所述表达载体在制备预防新冠病毒肺炎疫苗中的应用。
7.一种SARS-COV-2病毒疫苗，其特征在于，以权利要求1所述抗原多肽为抗原制备得到。
8.一种SARS-COV-2病毒疫苗，其特征在于，由包含权利要求3-5任一所述表达载体表达得到。
9.根据权利要求8所述的SARS-COV-2病毒疫苗，其特征在于，还包含药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。
10.一种SARS-COV-2病毒疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤制备：
将pHelper、pRep2Cap5和权利要求3-5任一所述的表达载体共孵育；在转染试剂聚乙烯亚胺存在的条件下转染细胞；培育细胞后，离心收集细胞，经过裂解和纯化，得到SARS-COV-2病毒疫苗。
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CN113388041B (zh) * 2020-03-12 2024-02-06 厦门大学 具有融合前早期构象的SARS-CoV-2 S三聚体蛋白及其应用
CN113321739B (zh) * 2021-02-04 2022-09-09 广东克冠达医药科技有限公司 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN113185613B (zh) * 2021-04-13 2022-09-13 武汉大学 新型冠状病毒s蛋白及其亚单位疫苗
CN113913464B (zh) * 2021-09-28 2022-11-22 武汉枢密脑科学技术有限公司 一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用

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