CN116060434A - 一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中tnt的方法 - Google Patents

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朱勇兵
韩梦薇
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Abstract

本发明公开了一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌的发酵培养液接入固定化载体中，培养，喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌；将固定化苏云金芽孢杆菌撒入待修复的含TNT土壤中，混合均匀，翻土，保证土壤通气及微生物活性；或者，向泥浆反应器中加入固定化苏云金芽孢杆菌并混合均匀，进行反应将TNT降解。本发明提供的固定化苏云金芽孢杆菌，制作方法操作简单，易于实现，生产成本低，玉米秸秆生物炭、硅藻土混合使用，增强了对菌株的吸附性能。本发明的固定化苏云金芽孢杆菌易回收，可多次使用，绿色环保。

Description

一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法
技术领域
本发明涉及环境治理技术领域，具体涉及一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法。
背景技术
近年来，含能化合物在军事、采矿、建筑、高能冶金等各行各业大量使用。对含能化合物的使用，在解决便利的同时，也存在的巨大的隐患。在制造、运输和使用含能化合物过程中导致了土壤和水源的污染。由于TNT具有成本低廉、易于铸装、使用安全和爆炸性能良好等诸多优点,长久以来都是军事和民爆领域产量最大和最为常用的单体猛炸药。在其生产、运输、装药、储存和销毁等各种环节，大量的TNT和副产物进入环境造成严重污染。TNT具有致毒、致癌、致畸变性，其对环境的危害主要表现在：当人类吸入时，轻者会引起肝脏疾病(中毒性肝炎)、再生障碍性贫血及白内障，重者可导致死亡；当水中TNT的含量达1mg/L时，鱼类就会死亡；TNT进入土壤，会与土壤中的几种主要化合物作用,使土壤中有机质的浓度增高，因此它对环境造成深远危害。TNT的生物降解和转化一直受到人们的广泛研究。
目前，大多数采用物理或化学方法从土壤中去除TNT，如焚烧、引爆或化学氧化。但是这些方法的实践成本很高，并且对环境造成了二次污染。微生物降解TNT国外从20世纪40年代开始研究，此项技术经过不断探索与发展，目前的主要工作是寻求高效降解菌。由于微生物降解TNT是利用微生物的代谢活动对有机物进行降解,该类方法安全可靠、运行管理费用低、处理效果令人满意而倍受环保研究人员的关注。自然界中有些微生物能够利用TNT并降解环境中的含能化合物污染。专利CN 106497811 B公开了一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其在降解TNT中的应用和一种降解TNT的方法，铜绿假单胞菌保藏号为CGMCC NO：10842。通过将保藏号为CGMCC NO：10842的铜绿假单胞菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10842的铜绿假单胞菌的菌剂与TNT污染样品接触，以对TNT污染样品中的TNT进行降解。但该菌在液体环境中完全降解TNT污染样品转化率相对较慢，因此，寻找TNT高效降解菌、制备微生物菌剂应继续探究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供苏云金芽孢杆菌在降解土壤TNT中的应用，所述苏云金芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.7882。
本发明第二方面提供一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，包括以下步骤：
(1)载体配置及菌株固定化：将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌的发酵培养液接入固定化载体中，培养，喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌；
(2)降解土壤中TNT：将步骤(1)得到的固定化苏云金芽孢杆菌撒入待修复的含TNT土壤中，混合均匀，翻土，保证土壤通气及微生物活性；或者，将含TNT土壤与水混合调成泥浆加入泥浆反应器中，向泥浆中加入步骤(1)得到的固定化苏云金芽孢杆菌并混合均匀，进行反应将TNT降解。
作为优选，步骤(1)中，所述苏云金芽孢杆菌的发酵培养液由以下步骤得到：将苏云金芽孢杆菌的种子菌液按10.0-15.0％的接种量接种于发酵培养液中，30-35℃通气搅拌发酵12-24h，测定发酵培养液微生物含量≥2.0～5.0×108CFU/mL。
作为优选，步骤(1)中，苏云金芽孢杆菌的发酵液的接种量与固定化载体投入量为100mL:(2-8)g，培养条件为30-37℃、24-48h、150-180r/min。
作为优选，步骤(1)中，所述固定化载体的制备步骤为：将玉米秸秆生物炭、硅藻土按重量比为(3-6)：(4-7)混合均匀，120-130℃灭菌10-30min，60-70℃烘干，得到固定化载体。
作为优选，步骤(2)中，固定化苏云金芽孢杆菌的撒入量为1-2kg/m2，土壤含水率为10-15％，翻土间隔为5天。
作为优选，步骤(2)中，泥浆中TNT含量为1000mg/kg，固定化苏云金芽孢杆菌的加入量为泥浆重量的20-25％，反应时间为7-12天。
本发明的有益效果：
本发明提供的固定化苏云金芽孢杆菌，降解速度快、降解效果持续稳定、降解率高，制作方法操作简单，易于实现，生产成本低，玉米秸秆生物炭、硅藻土混合使用，增强了对菌株的吸附性能。
本发明提供的固定化苏云金芽孢杆菌，应用于泥浆反应器中，和好氧淤泥混合，能大量降低水土中TNT含量，处理效果稳定。
本发明的固定化苏云金芽孢杆菌易回收，可多次重复使用，绿色环保。
附图说明
图1：硝基还原假单胞菌T1、硝基还原假单胞菌T2、枯草芽孢杆菌T3、苏云金芽孢杆菌T4和苏云金芽孢杆菌T5对TNT的降解率。
图2：本发明所用苏云金芽孢杆菌的降解动态；
图3：实施例2中TNT的降解动态图；
图4：本发明所用苏云金芽孢杆菌重复降解TNT的动态图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，基于此，本发明提供一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，包括以下步骤：
(1)制备发酵培养液：将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，30-35℃、10-15h培养获得活化菌株；将苏云金芽孢杆菌活化菌株接种于LB液体培养基中，36-37℃、10-15h、150-180r/min震荡培养获得种子菌液，
将得到的种子菌液按10.0-15.0％接种于发酵培养液中，发酵培养液包括(NH4)2SO42.0～4.0g/L,NaH2PO4 1.5～3.0g/L，葡萄糖10～15g/L，pH7.0～7.2；通气搅拌发酵，发酵温度为30-35℃，发酵时间为12-24h，发酵完成后发酵培养液中微生物含量不低于2.0-5.0×108CFU/mL；
(2)载体配置及菌株固定化：将玉米秸秆生物炭、硅藻土按重量比为(3-6)：(4-7)混合均匀，120-130℃灭菌10-30min，60-70℃烘干，得到固定化载体；将步骤(1)得到的发酵培养液接入固定化载体中，发酵培养液的接种量(ml)与固定化载体投入量(g)为100：(2-8)，培养条件为30-37℃、24-48h、150-180r/min，喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌；
(3)降解土壤中TNT：将步骤(2)得到的固定化苏云金芽孢杆菌按1-2kg/m2的量撒入待修复的含1000mg/kgTNT土壤中，混合均匀，翻土间隔为5天，土壤含水率为10-15％，保证土壤通气及微生物活性；或者，将含TNT土壤与水混合调成泥浆加入泥浆反应器中，泥浆中TNT含量为1000mg/kg，向泥浆中加入泥浆重量的20-25％的固定化苏云金芽孢杆菌并混合均匀，进行反应7-12天将TNT降解。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
筛选实验
以下实验中所用硝基还原假单胞菌T1购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.1.8737；所用硝基还原假单胞菌T3保藏号为：CGMCC No.1.4928；所用枯草芽孢杆菌T3保藏号为：CGMCC No.1.15792；所用苏云金芽孢杆菌T4保藏号为：CGMCCNo.1.7882；所用苏云金芽孢杆菌T5保藏号为：CGMCC No1.15822。
将硝基还原假单胞菌T1、硝基还原假单胞菌T2、枯草芽孢杆菌T3、苏云金芽孢杆菌T4和苏云金芽孢杆菌T5在LB液体培养基中活化，150r/min，37℃震荡培养12小时，获得种子菌液。将这五种菌分别加入含100mg/L TNT的1/5LB培养基中，150r/min，37℃震荡培养12小时。菌株筛选结果如图1所示，通过测定TNT含量得知，硝基还原假单胞菌T1降解率为62.95％，硝基还原假单胞菌T2降解率为47.2％，枯草芽孢杆菌T3降解率为61.56％，苏云金芽孢杆菌T4降解率为100％，苏云金芽孢杆菌T5降解率为54.22％。其中，苏云金芽孢杆菌T4降解效果最好，选择保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌在土壤中去除TNT。
保藏编号为CGMCC No.1.7882苏云金芽孢杆菌在含100mg/LTNT的1/5LB液体培养基中，在菌液初始OD600＝0.05，150rpm、37℃震荡培养4h的条件下，TNT降解率能达到91.5％。其降解动态如图2所示。
实施例1
(1)制备发酵培养液：将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，35℃、12h培养获得苏云金芽孢杆菌的活化菌株；
将苏云金芽孢杆菌的活化菌株接种在LB液体培养基中，接种量2.0％体积分数，在150r/min、35℃条件下震荡培养12小时得到苏云金芽孢杆菌的种子菌液。
按体积分数10.0％的接种量将苏云金芽孢杆菌的种子菌液接种于发酵培养液中，发酵培养液包括(NH4)2SO4 3.0g/L,NaH2PO4 2.0g/L，葡萄糖15g/L，pH7.0；在35℃条件下通气搅拌发酵24h，经测定发酵培养液中微生物含量不低于5.0×108CFU/mL。
(2)载体配置及菌株固定化：将玉米秸秆生物炭6份、硅藻土4份混合均匀，121℃、0.105MPa高压蒸汽灭菌20min后，经65℃烘干，配置好固定化载体。
将苏云金芽孢杆菌的发酵液的接种到固定化载体中，苏云金芽孢杆菌的发酵培养液的接种量与固定化载体的投入量为100mL:8g，在150rpm/min、37℃条件下培养48h，经喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌。
(3)降解TNT：将步骤(2)得到的固定化苏云金芽孢杆菌按2kg/m2的量撒入待修复的含1000mg/kg TNT土壤中，混合均匀，保持土壤含水率为10％，每隔5天重新翻土，保证土壤通气及微生物活性，在生化培养箱中孵育。
在30天、40天、50天分别取土壤样本，测定TNT含量，具体步骤如下：
取1g土壤加入2mL乙腈混匀，超声萃取60min，8000rpm离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后移入色谱瓶，使用高效液相色谱测定TNT含量，液相色谱参数为流动相为水：甲醇＝50：50，流速为0.7mL/min，柱温为33℃。
经测定，30天时TNT降解率为59.6％，40天时TNT降解率为85.6％，50天时TNT降解率为99.8％。
实施例2
(1)制备发酵培养液：将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，在35℃下培养12h获得苏云金芽孢杆菌的活化菌株；
将苏云金芽孢杆菌的活化菌株接种在LB液体培养基中，接种量2.0％体积分数，在150r/min、35℃震荡培养12小时得到苏云金芽孢杆菌的种子菌液。
按体积分数15.0％的接种量将苏云金芽孢杆菌的种子菌液接种于发酵培养液中发酵培养液包括(NH4)2SO4 3.0g/L,NaH2PO4 2.0g/L，葡萄糖15g/L，pH7.0；在35℃的条件下通气搅拌发酵24h，经测定发酵培养液中微生物含量不低于5.0×108CFU/mL。
(2)载体配置及菌株固定化：将玉米秸秆生物炭6份、硅藻土4份混合均匀，121℃、0.105MPa高压蒸汽灭菌20min后，经65℃烘干，配置好固定化载体。
将苏云金芽孢杆菌的发酵培养液接种到固定化载体中，苏云金芽孢杆菌的发酵培养液的接种量与固定化载体的投入量为100mL:8g，在150rpm/min、37℃条件下培养48h，经喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌。
(3)降解TNT：将含TNT的土壤与水混合均匀得到TNT含量为1000mg/kg的泥浆，将泥浆加入到泥浆反应器中，按20％的重量百分比向泥浆中加入固定化苏云金芽孢杆菌并混合均匀，曝气反应。
在第12天和22天时分别取泥浆样本测定其TNT含量，具体步骤如下：
取2mL泥浆于离心管中，8000rpm离心5min，取上清液500微升，加入等量乙腈萃取，萃取液经0.22μm微孔滤膜过滤后移入色谱瓶；并向沉淀中加入2mL乙腈混匀，超声萃取60min，8000rpm离心5min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后移入色谱瓶，使用高效液相色谱测定TNT含量，液相色谱参数为流动相为水：甲醇＝50：50，流速为0.7mL/min，柱温为33℃。
经测定，曝气反应12天，TNT降解率为94.2％，其降解动态如图3所示；曝气反应22天，TNT降解率达到最大值为98.4％。
重复降解实验
为了确定本发明固定化苏云金芽孢杆菌的持续可重复使用性，按照实施例1的步骤制备固定化苏云金芽孢杆菌(图4中的Fixed bacteria)，进行模拟TNT污染土壤(100mg/LTNT)的降解实验，每个循环结束后，用无菌蒸馏水洗涤固定化芽孢杆菌的固定化载体颗粒三次，再次加入到TNT土壤进行反应，以固定化载体颗粒(图4中的Biochar)为对照，测定TNT降解率。重复操作5次，其TNT降解率仍高达93.4％，结果如图4所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.苏云金芽孢杆菌在降解土壤TNT中的应用，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.7882。
2.一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)载体配置及菌株固定化：将保藏编号为CGMCC No.1.7882的苏云金芽孢杆菌的发酵培养液接入固定化载体中，培养，喷雾干燥得到固定化苏云金芽孢杆菌；
(2)降解土壤中TNT：将步骤(1)得到的固定化苏云金芽孢杆菌撒入待修复的含TNT土壤中，混合均匀，翻土，保证土壤通气及微生物活性；或者，将含TNT土壤与水混合调成泥浆加入泥浆反应器中，向泥浆中加入步骤(1)得到的固定化苏云金芽孢杆菌并混合均匀，进行反应将TNT降解。
3.根据权利要求2所述的一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述苏云金芽孢杆菌的发酵培养液由以下步骤得到：将苏云金芽孢杆菌的种子菌液按10.0-15.0％的接种量接种于发酵培养液中，30-35℃通气搅拌发酵12-24h，测定发酵培养液微生物含量≥2.0～5.0×108CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，步骤(1)中，苏云金芽孢杆菌的发酵液的接种量与固定化载体投入量为100mL:(2-8)g，培养条件为30-37℃、24-48h、150-180r/min。
5.根据权利要求2所述的一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固定化载体的制备步骤为：将玉米秸秆生物炭、硅藻土按重量比为(3-6)：(4-7)混合均匀，120-130℃灭菌10-30min，60-70℃烘干，得到固定化载体。
6.根据权利要求2所述的一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，步骤(2)中，固定化苏云金芽孢杆菌的撒入量为1-2kg/m2，土壤含水率为10-15％，翻土间隔为5天。
7.根据权利要求2所述的一种利用苏云金芽孢杆菌降解土壤中TNT的方法，其特征在于，步骤(2)中，泥浆中TNT含量为1000mg/kg，固定化苏云金芽孢杆菌的加入量为泥浆重量的20-25％，反应时间为7-12天。
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