CN116059451A - 一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医用材料创面修复技术领域，涉及一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤主体结构为分散的纳米纤维相互交联形成的纳米多孔三维结构；通过静电纺丝技术制备聚左旋乳酸‑己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜，然后以纳米纤维膜为原料通过高速匀浆技术和冷冻干燥技术制备出多孔气凝胶人工皮肤；本发明创新性的将气凝胶技术应用于深层创面修复人工皮肤领域，设计出的多孔气凝胶人工皮肤可加速全层真皮基质再生和血管化，促进深层创面原位愈合，使患者免受植皮手术的痛苦。该气凝胶人工皮肤可模拟真实皮肤的力学性能和形状，完美适配各种创面形状和不同的创面部位，为创面治疗提供更个性化的治疗方案。

Description

一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤及其制备方法
技术领域：
本发明属于医用材料创面修复技术领域，具体涉及一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤及其制备方法和应用。以聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质为原料，通过静电纺丝、高速匀浆技术和冷冻干燥技术制备出多孔气凝胶人工皮肤，可加速全层真皮基质再生和血管化，实现深层皮肤创面的原位修复，避免患者遭受植皮痛苦。
背景技术：
烧伤或热力损伤是指因炽热的流体烫伤、固体接触烧伤或火焰烧伤而引起的组织细胞部分或全部毁损性损伤。深度烧伤包括深Ⅱ度、Ⅲ度烧伤，是指伤及真皮乳头层以下，乃至全层皮肤烧伤。深度烧伤患者面临极大的肢体痛苦和精神压力，也给家庭、社会造成巨大的经济负担。目前治疗深度烧伤的主要手段仍是移植自体皮，患者需要遭受多次手术的痛苦，且大面积烧伤时常会面临供皮区不足的问题。植皮成功后，缺少真皮的创面愈合后也面临凹陷、受皮区疤痕增生等问题，影响皮肤的外观和功能。因此，研制适用于深度烧伤治疗的人工皮肤一直是国内外亟待解决的需求。烧伤的创面愈合是一个复杂而有序的动态过程，经过炎性细胞、修复细胞等的迁移、增殖，细胞外基质分泌等，最后完成再上皮化或形成瘫痕。当创面愈合进入增殖期，肉芽组织(由毛细血管、成纤维细胞及炎性细胞组成)填补皮肤缺损，是深度烧伤创面愈合的关键所在。其中，如何有效引导成纤维细胞与血管内皮细胞的生物学行为与创面愈合的速度和质量密切相关。此外，深度烧伤面积、深浅各异，对创面修复材料的可塑性和力学性能提出较高要求。
静电纺丝技术是一种在高压静电下用聚合物溶液制备直径为微/纳米级别纤维材料的高度通用技术，由静电纺丝制备的生物可降解材料已被广泛应用于生物医药领域。例如中国专利CN201710645250.4公开了一种贴附透气人工皮肤感受器的制备方法，包括：(1)配制聚乙烯醇溶液；(2)配制丝素溶液；(3)静电纺丝；(4)将室温干燥后的纳米纤维在气压下处理；(5)石墨烯载银；(6)离心，真空干燥得到石墨烯银纳米复合材料；(7)利用气相沉积法镀在纳米丝素聚乙烯醇纤维上，得到贴附透气人工皮肤感受器，该发明的人工皮肤具有良好的生物相容性功能，在一定外力作用下会发生电阻改变，且具有良好的物理机械性能；中国专利CN202110899768.7公开的一种可光热触发生长因子阶段性释放的人工皮肤材料及其制法。本发明以可降解聚合物材料、可降解天然高分子及相变材料为主要原料并加入抗菌药物、多种生长因子，通过静电纺丝制备成具有多级修复效果的支架材料，材料中加入不同种类抗菌药物，以实现多重抗菌效果；在两层纤维层之间沉积含有不同种类种生长因子的相变材料颗粒，可光热触发多种生长因子的时空可控有序释放，提供伤口愈合不同阶段所需微环境。
气凝胶通常是指以纳米级颗粒或聚合物分子链的相互聚集形成纳米多孔结构，在纳米孔洞中充满气态分散介质的三维多孔轻质固体材料。气凝胶具有高孔隙率、高表面积、高液体吸收率、低堆积密度和超轻等特性。以静电纺丝技术、高速匀浆技术和冷冻干燥技术为基础制备的气凝胶材料具备成为优秀人工皮肤的潜质。
目前尚未发现关于具有本研究制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合气凝胶人工皮肤的研究报道。
发明内容：
本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，提供一种具有三维多孔结构的深层创面修复人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤具有促进深层皮肤创面原位快速愈合性能、优良的生物相容性、低免疫原性和适宜的力学性能。
为了实现上述目的，本发明提供具有三维多孔结构的深层创面修复气凝胶人工皮肤，其主体结构为分散的纳米纤维相互交联形成的纳米多孔三维结构，孔内充满空气；纳米纤维的成分为人工合成聚合物和天然来源的生物材料。
所述的人工合成聚合物为聚左旋乳酸-己内酯共聚物。
所述的天然来源的生物材料为脱细胞真皮基质。
本发明还提供所述具有三维多孔结构气凝胶人工皮肤的制备方法，具体步骤包括：
(1)制备纺丝液：以聚左旋乳酸-己内酯共聚物和脱细胞真皮基质为原料制备纺丝液；
(2)制备复合纳米纤维膜：以步骤(1)制备的纺丝液为原料，通过静电纺丝法制备纳米纤维膜；
(3)制备三维多孔结构气凝胶人工皮肤：将步骤(2)制备的纳米纤维膜溶于溶剂中进行均质，然后入模、冷冻干燥，得到具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤。
所述步骤(1)的具体步骤为：将聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质按比例分散于溶剂一中，得到纺丝液；
所述溶质分散比例为：聚左旋乳酸-己内酯与脱细胞真皮基质的质量比为7:3。
所述溶剂一为六氟异丙醇，溶质与六氟异丙醇的质量体积比为0.1g-0.2g:1mL。
所述步骤(2)中制备复合纳米纤维膜的具体步骤为：将平板作为接收装置，使用纺丝液进行单针头静电纺丝，得到聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基复合纳米纤维膜。
所述静电纺丝参数为：电压为10-15kV，流速为1-3mL/h，针头为21号，接收距离为15-20cm。
所述步骤(3)中制备气凝胶人工皮肤的具体步骤为：将复合纳米纤维膜分散于溶剂中，使用高速匀浆机均质溶液，得到纳米短纤维均质液；将该纳米短纤维均质液倒入模具中，经冰箱预冻、冷冻干燥，得到三维多孔气凝胶人工皮肤；所述溶剂为叔丁醇，纳米纤维膜与叔丁醇的质量比为0.05g-0.10g:1g。
所述高速匀浆机均质溶液的转速为10000-15000rpm，均质时间为0.5-1h。
所述预冻条件为：-20℃预冻0.5-1h，-80℃冷冻过夜。
所述冷冻干燥时间为24h。
本发明还提供所述具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤在制备创面修复材料中的应用。
本发明所述具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤，是由分散的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维相互交联形成的纳米多孔三维结构，孔内充满空气。该气凝胶人工皮肤可以按需通过不同的模具制备出模拟真实皮肤形状和力学性能的不同三维结构。
本发明选用聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质作为制备气凝胶人工皮肤的原材料。聚左旋乳酸-己内酯是由左旋乳酸和己内酯聚合反应得到的，结合了两种材料的优点：既有适宜的降解时间，且降解产物不会对人体造成毒害；又有较高的韧性，为气凝胶人工皮肤提供较强的力学支撑。脱细胞真皮基质来源广泛，可利用鱼皮、猪皮和牛皮等经过物理和化学方法将组织去表皮、脱细胞制备而成；其主要由纤维性结构构成，包括多种胶原蛋白以及层黏连蛋白、硫酸角质素、弹力素和纤维结合素等，具有无菌、低毒性、无免疫原性、高弹性、质地柔软等特点。另外，脱细胞真皮基质可引导宿主成纤维细胞向内部生长，促进毛细血管形成，并逐渐被宿主改建重塑，具有极佳的生物相容性。整体而言，三维多孔结构的气凝胶人工皮肤制备成本低，制备技术简单，可实现大规模量产，有利于产品市场化。
本发明所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤，因其所含成分的特有功效和模仿天然细胞外基质的结构特点，可以促进和引导创面中成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移，加速全层真皮基质再生和血管化，从而促进深层创面快速原位愈合。此外，该气凝胶人工皮肤可模拟真实皮肤的力学性能和形状，不仅可以抵御外界微生物入侵，为创面营造湿性愈合条件，还可完美适配各种创面形状和不同的创面部位，为创面治疗提供更个性化的治疗方案。
本发明提出了具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的概念模型，目前主要针对深度烧伤等深层创面缺损做进一步的研究，在创面修复和组织再生工程中具有重要的研究意义和应用价值。本发明以聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质为原料制备出三维多孔结构气凝胶人工皮肤，不仅可以抵御外界微生物入侵，为创面营造湿性愈合条件，还可帮助缺损组织快速建立一个能够模拟天然细胞外基质结构和功能的微环境，通过引导创面愈合中关键细胞的生物学行为实现深层创面修复的原位愈合，使患者免受植皮手术的痛苦。
本发明与现有技术相比，有益效果为：
(1)本发明创新性地选取兼具力学性能和降解性的聚左旋乳酸-己内酯与富含多种促细胞生长物质的脱细胞真皮基质作为制备创面修复材料的基础原材料，使该气凝胶人工皮肤具有极佳的生物相容性及低免疫原性；
(2)本发明创新性的将气凝胶技术应用于深层创面修复人工皮肤领域，设计出的多孔气凝胶人工皮肤可加速全层真皮基质再生和血管化，促进深层创面原位愈合，使患者免受植皮手术的痛苦。该气凝胶人工皮肤可模拟真实皮肤的力学性能和形状，完美适配各种创面形状和不同的创面部位，为创面治疗提供更个性化的治疗方案。
(3)本发明具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的原材料来源广泛，制备方法简单环保，可实现大规模量产，有利于产品市场化。本发明也为静电纺丝纳米材料的功能化、皮肤创面的临床治疗和组织修复工程的发展提供了新思路。
附图说明：
图1为本发明涉及的实施例1制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜的电子显微镜图。
图2为本发明涉及的实施例2复合纳米纤维膜的拉伸力学实验结果示意图。
图3为本发明涉及的实施例3复合纳米纤维膜的生物相容性实验结果示意图。
图4为本发明涉及的实施例4复合纳米纤维膜接种人成纤维细胞生长3天后细胞骨架和细胞核荧光显微镜照片；其中A为人成纤维细胞的细胞骨架荧光显微镜照片，B为人成纤维细胞的细胞核荧光显微镜照片，C为人成纤维细胞的细胞骨架和细胞核合并图。
图5为本发明涉及的实施例1制备的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的电子显微镜图和接种人脐带血管内皮细胞后电子显微镜图；其中A为300倍视野下气凝胶人工皮肤的电子显微镜图，B为500倍视野下气凝胶人工皮肤的电子显微镜图，C为接种人脐带血管内皮细胞生长3天后，500倍视野下气凝胶人工皮肤的电子显微镜图。
图6为本发明涉及的实施例6具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的压缩力学实验结果示意图。
图7为本发明涉及的实施例7具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的动物实验结果示意图；其中A为第0、3和7天伤口愈合过程的照片，B为第3和7天伤口愈合率的示意图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及具有三维多孔结构的创面修复气凝胶人工皮肤的制备方法，以聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜为原料进行制备，具体步骤包括：
(一)制备聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜：
(1)制备纺丝液：将0.15g脱细胞真皮基质剪成0.5×0.5cm的正方形，以及称取0.35g聚左旋乳酸-己内酯，将二者溶于5mL六氟异丙醇中，常温下磁力搅拌至完全溶解，得到纺丝溶液；
(2)制备复合纳米纤维膜：取5mL纺丝液，将普通平板作为接收装置，将纺丝液吸入5mL规格注射器中，连接21号不锈钢针头并与13kV高压相连接，流速为3mL/h，持续时间1.5h，得到聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜；
(二)制备气凝胶人工皮肤：
(1)制备复合纳米纤维膜均质液：将步骤(一)制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质1g复合纳米纤维膜剪成0.5×0.5cm的正方形后溶于10g叔丁醇中，使用高速匀浆机均质溶液，转速为10000rpm，持续时间为0.5h，得到复合纳米纤维膜均质液；
(2)制备气凝胶人工皮肤：将复合纳米纤维膜均质液转移到模具中，放入-20℃冰箱预冻0.5h，再放入-80℃冰箱过夜，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥24h，得到具有三维多孔结构的创面修复气凝胶人工皮肤。
所述脱细胞真皮基质为青岛海洋生物医药研究院提供的鱼皮源脱细胞基质。
所述聚左旋乳酸-己内酯购买于深圳市迈启生物材料有限公司。
实施例2：
本实施例为实施例1制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜的拉伸力学实验，具体步骤为：将制备好的复合纳米纤维膜裁剪成长×宽：10mm×50mm大小的实验样本。用螺旋测微仪测量每个实验样本的厚度。使用万能测试仪在室温条件下用十字头速度以20mm/min的速度来测量拉伸强度。所得数据绘制出应力/应变曲线示意图，结果见图2。从图2可知，复合纳米纤维膜的抗拉强度、断裂伸长率和杨氏模量分别为：8.12±0.16MPa、289.30±7.65％和5.42±1.60MPa。说明复合纳米纤维膜具有较佳的韧性。
实施例3：
本实施例为实施例1制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜的生物相容性实验，具体步骤为：制备好的复合纳米纤维膜用打孔器制备成直径为1cm大小的圆片状实验样本作为实验组，直径为1cm大小的圆型空白玻片作为对照组，放入24孔板，乙醇蒸汽及紫外线照射杀菌后每孔接种成纤维细胞0.8×104个，在第1、3、5、7天使用细胞计数试剂盒(CCK-8)对成纤维细胞增殖活性进行测定：每孔中加入含有10％CCK-8试剂的培养基，在37℃，5％ CO2培养箱中孵育2h，之后使用多功能酶标仪在450nm处测定每孔内含CCK-8试剂培养基的吸光度(即OD值)，OD值越高说明细胞数量越多，从而评估脱复合纳米纤维膜的生物相容性，结果见图3。从图3可以看出，接种到复合纳米纤维膜上的成纤维细胞数量比空白玻片上的成纤维细胞数据增加显著，说明在成纤维细胞在复合纳米纤维膜上增殖情况良好，即复合纳米纤维膜具有极佳的生物相容性和促进成纤维细胞增值的性能。
实施例4：
本实施例为实施例1制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜对成纤维细胞的形态试验：将成纤维细胞接种于复合纳米纤维膜后培养3天，用4％多聚甲醛固定20min，0.1％ TritonX-100溶液渗透5min，用1％牛血清白蛋白溶液封闭1h，然后用phalloidin-iFluor 488和DAPI染色肌动蛋白细胞骨架和细胞核。在每个过程之间，样品用PBS洗涤三次。荧光显微图采用荧光正置显微镜(尼康，东京，日本)获得，结果如图4所示。图4荧光显微图显示了成纤维细胞在复合纳米纤维膜上的细胞形态。成纤维细胞的细胞骨架呈穿梭状，形态拉伸。总体结果表明，复合纳米纤维膜对成纤维细胞伸展有积极影响，有助于真皮组织的快速再生。
实施例5：
本实施例为实施例1制备的气凝胶人工皮肤的形貌观察和对人脐带血管内皮细胞形态实验：将实施例1制备的气凝胶人工皮肤剪裁成长×宽×高：10mm×10mm×10mm大小的实验样本。对样本喷金30s，拍摄扫描电子显微镜，结果见图5A和5B。将人脐带血管内皮细胞接种于气凝胶人工皮肤表面后培养3天，用4％多聚甲醛固定20min，用去离子水洗涤样品3次后，用乙醇梯度脱水法脱水；对样本喷金30s，拍摄扫描电子显微镜，结果见图5C，人脐带血管内皮细胞在气凝胶人工皮肤上长势良好，相互融合连接成片，有助于创面的快速血管化。
实施例:6：
本实施例为实施例1制备的气凝胶人工皮肤的压缩力学实验，具体步骤为：使用模具将气凝胶人造皮肤制成统一圆柱体样品用于压缩测试。使用万能测试仪在25℃的环境温度下评价气凝胶的压缩性能。压缩测试以2mm/min的速度进行。所得数据绘制出压力/应变曲线示意图，结果见图6。从图6可以看出，气凝胶人工皮肤的抗压强度和压缩模量分别为：0.023±0.05MPa和0.011±0.02MPa，说明气凝胶人工皮肤，具备较佳可塑性与支撑能力，且柔软有弹性。
实施例7：
本实施例为实施例1制备的气凝胶人工皮肤的动物实验，具体步骤为：取280±10g的SD大鼠9只，适应性喂养2天后，术前24h背部备皮。应用2％的戊巴比妥钠0.5mL腹腔注射麻醉，于大鼠背部用80℃热水烫伤10s，每只大鼠制造3个直径为1.5cm的圆形创面，建立大鼠深Ⅱ度烧烫伤模型，每隔一天观察创面情况。
创面制备完成后将大鼠背部创面随机分为3组，分别为空白组、油纱组和气凝胶人工皮肤组，其中空白组不做处理，油纱组给予大鼠创面覆盖凡士林纱布(即油纱)；气凝胶人工皮肤组给予大鼠创面气凝胶人工皮肤处理；分别于术后0、3和7天数码相机拍照创面愈合大体观结果见图7A。Image-Pro Plus 6.0软件分析创面愈合情况，结果见图7B。
从图7可以看出，第3天时，空白组和纱布组明显处于炎症感染期，而气凝胶人工皮肤组的大鼠创面已结痂，第7天时，气凝胶人工皮肤组的伤口愈合率明显高于其他两组，伤口部位经上皮化几乎完全关闭。由此说明，本发明的气凝胶人工皮肤能加速伤口的愈合。
实施例8：
本实施例涉及具有三维多孔结构的创面修复气凝胶人工皮肤的制备方法，具体步骤包括：
(一)制备聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜：
(1)制备纺丝液：将0.3g脱细胞真皮基质剪成0.5×0.5cm的正方形，以及称取0.7g聚左旋乳酸-己内酯，将二者溶于5mL六氟异丙醇中，常温下磁力搅拌至完全溶解，得到纺丝溶液；
(2)制备复合纳米纤维膜：取5mL纺丝液，将普通平板作为接收装置，接收距离为15cm，将纺丝液吸入5mL规格注射器中，连接21号不锈钢针头并与15kV高压相连接，流速为1mL/h，持续时间1.5h，得到聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜；
(二)制备气凝胶人工皮肤：
(1)制备复合纳米纤维膜均质液：将1g步骤(一)制备的聚左旋乳酸-己内酯/脱细胞真皮基质复合纳米纤维膜剪成0.5×0.5cm的正方形后溶于10g叔丁醇中，使用高速匀浆机均质溶液，转速为15000rpm，持续时间为0.5h，得到复合纳米纤维膜均质液；
(2)制备气凝胶人工皮肤：将复合纳米纤维膜均质液转移到模具中，放入-20℃冰箱预冻0.5h，再放入-80℃冰箱过夜，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥24h，得到具有三维多孔结构的创面修复气凝胶人工皮肤。

Claims (10)

1.一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤，其特征在于，主体结构为分散的纳米纤维相互交联形成的纳米多孔三维结构，孔内充满空气；纳米纤维的成分为人工合成聚合物和天然来源的生物材料。
2.根据权利要求1所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤，其特征在于，人工合成聚合物为聚左旋乳酸-己内酯共聚物。
3.根据权利要求1所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤，其特征在于，所述的天然来源的生物材料为脱细胞真皮基质。
4.一种具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)制备复合纳米纤维膜：以聚左旋乳酸-己内酯共聚物和脱细胞真皮基质为原料通过静电纺丝技术制备复合纳米纤维膜；
(2)制备三维多孔结构气凝胶人工皮肤：将步骤(2)制备的纳米纤维膜溶于溶剂中进行均质，然后入模、冷冻干燥，得到具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤。
5.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：将聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质分散于六氟异丙醇中，得到纺丝液；将平板作为接收装置，使用纺丝液进行单针头静电纺丝，得到聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基复合纳米纤维膜；聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质的质量比为7:3；聚左旋乳酸-己内酯和脱细胞真皮基质的总质量与六氟异丙醇的体积比为0.1g-0.2g:1mL。
6.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中静电纺丝参数为：电压为10-15kV，流速为1-3mL/h，针头为21号，接收距离为15-20cm。
7.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中制备气凝胶人工皮肤的具体步骤为：将复合纳米纤维膜分散于溶剂中，使用高速匀浆机均质溶液，得到纳米短纤维均质液；将该纳米短纤维均质液倒入模具中，经冰箱预冻、冷冻干燥，得到三维多孔气凝胶人工皮肤；所述溶剂为叔丁醇，纳米纤维膜与叔丁醇的质量比为0.05g-0.10g:1g。
8.根据权利要求7所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述高速匀浆机均质溶液的转速为10000-15000rpm，均质时间为0.5-1h。
9.根据权利要求7所述的具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述预冻条件为：-20℃预冻0.5-1h，-80℃冷冻过夜；所述冷冻干燥时间为24h。
10.如权利要求1所述具有三维多孔结构的气凝胶人工皮肤在制备创面修复材料中的应用。
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