CN116059392A - 配体偶联物及其应用 - Google Patents

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CN116059392A CN202211073029.3A CN202211073029A CN116059392A CN 116059392 A CN116059392 A CN 116059392A CN 202211073029 A CN202211073029 A CN 202211073029A CN 116059392 A CN116059392 A CN 116059392A
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邵军
顾龙军
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Abstract

一种配体偶联物，一种包含该配体偶联物的试剂盒，以及一种治疗能受益于T‑效应细胞激动的疾病的方法。

Description

配体偶联物及其应用
技术领域
本申请涉及癌症治疗和免疫调节领域。更具体地，本申请涉及一种配体偶联物，一种包含该配体偶联物的试剂盒，以及一种治疗能受益于T-效应细胞激动的疾病的方法。
背景技术
OX40(也称“CD134”或“TNFRSF4”)是一类重要的T细胞共刺激分子，为肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族中的一员。OX40的配体OX40L(又称CD252)通常以三聚体的形式和3个OX40蛋白结合形成六聚体复合物，从而激活下游NF-κB、PI3K以及AKT等信号通路，持续激活这些下游信号可以刺激细胞因子的产生，从而增强效应T细胞的杀伤能力。已有相当多的抗OX40抗体被开发出来以用于治疗癌症和调节免疫。
TLR9(Toll样受体9)是Toll样受体家族成员之一，主要在树突细胞(DCS)和B细胞上表达，是肿瘤治疗中十分有前景的靶点之一。TLR9自然识别的配体是细菌DNA中含有非甲基化CpG的序列。天然的和人工合成的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)能以TLR9依赖的方式刺激机体固有免疫应答，引发免疫调节级联反应，最终产生Th1和促炎细胞因子和趋化因子，还能改善树突细胞、单核细胞和巨噬细胞的抗原呈递功能，诱导B细胞的增殖，刺激NK细胞的免疫保护活性，诱导机体内免疫应答反应。CpG OND由于具有良好的促进免疫应答的效果而常在临床研究中被用作免疫增强剂，但CpG ODN通常是以单链的形式单独地被使用。
虽然TLR9被认为是十分有前景的靶点，但TLR9激动剂在临床中仍存在一定的局限性，其全身给药可能引发毒性反应，瘤内局部注射虽然可提高人体的耐受性，但药物可能从作用部位迅速代谢，导致疗效衰减，因此临床需要每周或每两周一次瘤内局部给药，以维持抗肿瘤的疗效。此外，虽然多核苷酸TLR9激动剂的临床前和II期试验的结果是有希望的，但是当与化学疗法方案组合时，全身给予多核苷酸TLR9激动剂并未改善非小细胞肺癌患者的存活率。
因此，仍需要改进的递送TLR9激动剂的方法，以更好的发挥TLR9激动剂的作用，并减少患者在施用TLR9激动剂时的痛苦和改善治疗效果。
发明内容
本申请的一个方面提供了一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够与T-效应细胞激动剂产生协同作用。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够上调T-效应细胞激动剂的靶点的表达。
在一些实施方式中，有效载荷为TLR9激动剂。在一些实施方式中，TLR9激动剂是寡核苷酸。在一些实施方式中，TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。在又一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与细胞表面分子结合。在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。在一些实施方式中，所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。在一些实施方式中，所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000031
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
在一些实施方式中，配体偶联物具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000041
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗体。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031、信达生物的IBI101、恒瑞医药的SHR-1806、科望生物的ES102、百时美施贵宝的BMS-986178、辉瑞的PF-04518600、艾伯维的ABBV-368或祐和生物的TH002。一些实施方式中，抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐和所述T-效应细胞激动剂被同时施用。在一些实施方式中，施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后一段时间，再施用所述T-效应细胞激动剂，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。在一些实施方式中，施用所述T-效应细胞激动剂之后一段时间，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐通过静脉注射的方式施用。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂通过腹腔施用、静脉施用或皮下施用，优选的，通过腹腔注射施用。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周两次；且T-效应细胞激动剂的施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐以每次1-400mg的剂量进行施用。在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂以每次1-600mg的剂量进行施用。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，优选的，所述受试者是人。
在一些实施方式中，能受益于T-效应细胞激动剂的疾病是癌症或免疫性疾病。在一些实施方式中，癌症选自下组：肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、食道癌、肺癌、肾癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、睾丸癌、皮肤癌、前列腺癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，免疫性疾病选自下组：结缔组织病、系统性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
本申请的另一个方面提供了一种试剂盒，其包含(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
在一些实施方式中，有效载荷为TLR9激动剂。在一些实施方式中，TLR9激动剂是寡核苷酸。在一些实施方式中，TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与细胞表面分子结合。在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。在一些实施方式中，所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体靶向不同的细胞表面分子，所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000071
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
在一些实施方式中，配体偶联物具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000081
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗体。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031、信达生物的IBI101、恒瑞医药的SHR-1806、科望生物的ES102、百时美施贵宝的BMS-986178、辉瑞的PF-04518600、艾伯维的ABBV-368或祐和生物的TH002。一些实施方式中，抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031。
在一些实施方式中，试剂盒被设置为使所述配体偶联物或其药学上可接受的盐和所述T-效应细胞激动剂被同时施用。在又一些实施方式中，试剂盒被设置为施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后一段时间，再施用所述T-效应细胞激动剂，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。在另一些实施方式中，试剂盒被设置为施用所述T-效应细胞激动剂之后一段时间，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
本申请的又一个方面提供了一种试剂盒双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，所述双配体或多配体偶联物包含与靶向细胞表面分子的配体部分连接的有效载荷，其中所述有效载荷是免疫刺激序列。
在一些实施方式中，有效载荷为TLR9激动剂。在一些实施方式中，所述TLR9激动剂是寡核苷酸。在一些实施方式中，所述TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。在一些实施方式中，所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，配体偶联物的双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。在一些实施方式中，所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。在一些实施方式中，所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
在一些实施方式中，配体偶联物的至少两个配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。
在一些实施方式中，配体偶联物的配体部分具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000101
在一些实施方式中，配体偶联物的配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
在一些实施方式中，配体偶联物的连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
在一些实施方式中，配体偶联物的具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000111
附图说明
图1显示了针对CR19501和CR19503的不同剂量的单独给药组中，小鼠的肝脏发生肿大现象。
图2显示了针对CR19501和CR19503的不同剂量的单独给药组中，小鼠的脾脏发生肿大现象。
图3显示了针对不同给药方案，小鼠的体重变化。
图4显示了针对不同给药方案，末次给药后即时的小鼠的肝脏重量变化。
图5显示了针对不同给药方案，末次给药后即时的小鼠的脾脏重量变化。
图6显示了针对不同给药方案，末次给药后恢复4周后的小鼠的肝脏重量变化。
图7显示了针对不同给药方案，末次给药后恢复4周后的小鼠的脾脏重量变化。
发明详述
以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处的具体实施方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员基于本发明的宗旨和本文的描述，可很容易地得出多种等同方式和修改，应理解这样的等同实施方式包含在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包含公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入本申请。
除非上下文另外明确指出，否则本文所使用的单数形式“一”、“一个”、“一种”和“该”或“所述”包括复数引用。
本文所使用的诸如“包括”、“包含”、“含有”、“含有”和“具有”等术语是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未叙述的要素或方法步骤。术语“由……组成”是封闭式的。
本申请的一个方面公开了一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
本申请的一个方面公开了一种增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的一个方面公开了一种增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的方法，所述方法包括向所述受试者施用双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述受试者已经被施用了T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的一个方面公开了(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂的组合的用途，其用于一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
本申请的一个方面公开了(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂的组合的用途，其用于一种增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的一个方面公开了双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐的用途，其用于一种增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的方法，所述方法包括向所述受试者施用双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述受试者已经被施用了T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的一个方面公开了(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂的组合在制备一种用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
本申请的一个方面公开了双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐在制备一种用于治疗受试者中疾病的药物中的用途，其中所述受试者已经被适用了T-效应细胞激动剂，所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
本申请的一个方面公开了了T-效应细胞激动剂在制备一种用于治疗受试者中疾病的药物中的用途，其中所述受试者已经被施用双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
本申请的一个方面公开了(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂的组合在制备一种增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的药物中的用途，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的一个方面公开了双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐在制备一种用于增强免疫应答/增强癌症治疗效果/增强T-效应细胞激动剂效果的药物中的用途，其中所述受试者已经被施用了T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的另一个方面公开了一种试剂盒，其包含(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
本申请的又一个方面公开了一种双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，所述双配体或多配体偶联物包含与靶向细胞表面分子的配体部分连接的有效载荷，其中所述有效载荷是免疫刺激序列。
T-效应细胞激动剂
在本申请中使用的术语“T-效应细胞激动剂”是指能够与T-效应细胞结合并直接引起T-效应细胞活化、或间接引起T-效应细胞活化的任何分子或试剂。T-效应细胞激动剂能提高T细胞效应，延长T细胞的存活时间，抑制调节性T细胞(Treg)的分化和活性，增强效应T细胞的杀伤能力，以增强免疫应答。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗体。
在本申请中使用的术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体、双特异性抗体或相应的抗原结合片段。天然完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(complementarity determining region；CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文中所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的约定来限定或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》.12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,免疫学相关蛋白质的序列(Sequences ofProteins of immunological Interest),第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院公共卫生署(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental andComparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组学研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,B细胞分子生物学(Molecular Biology of B cells)(第二版),第26章,481-514,(2015))。三个CDR插在被称为构架区(framework region；FR)(轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)的侧翼链段(stretch)之间，所述侧翼链段比CDR更高度保守且形成支撑高度可变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五种主要类别或同型为大免疫球蛋白A(IgA)、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。若干主要抗体类别分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
在一些实施例中，本文提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。在本申请中使用的术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个CDR或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂是抗OX40抗体。一般认为，T细胞活化需要至少两个信号，第一信号T细胞识别MHC-肽化合物，在识别过程中还需要各种信号刺激。OX40(也称“CD134”或“TNFRSF4”)是一类重要的T细胞共刺激分子，为肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族中的一员。OX40的配体OX40L(又称CD252)通常以三聚体的形式和3个OX40蛋白结合形成六聚体复合物，从而激活下游NF-κB、PI3K以及AKT等信号通路，持续激活这些下游信号可以刺激细胞因子的产生，从而增强效应T细胞的杀伤能力。
在本申请中使用的术语“抗OX40抗体”可以是现在已知的或者未知的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031、信达生物的IBI101、恒瑞医药的SHR-1806、科望生物的ES102、百时美施贵宝的BMS-986178、辉瑞的PF-04518600、艾伯维的ABBV-368或祐和生物的TH002。一些实施方式中，抗OX40抗体是商业购买自BioXCell的BE0031(克隆：OX-86；种型：Rat IgG1,κ；纯度：大于95％；RRID：AB_1107592；分子量：150kDa；商品链接：https://bxcell.com/product/m-cd134-ox40/)。
疾病
在本申请中使用的术语“能受益于T-效应细胞激动的疾病”是指当机体内T-效应细胞被活化后，症状能够在一定程度上被减轻、延迟或治愈，和/或相关生理或生化参数部分或完全恢复正常的疾病。在一些实施方式中，能受益于T-效应细胞激动剂的疾病是癌症或免疫性疾病。在一些实施方式中，癌症选自下组：肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、食道癌、肺癌、肾癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、睾丸癌、皮肤癌、前列腺癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，免疫性疾病选自下组：结缔组织病、系统性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够与T-效应细胞激动剂产生协同作用。在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够上调T-效应细胞激动剂的靶点的表达。
在本申请中使用的术语“有效载荷”指的是拟递送至靶细胞或组织的分子或物质。非限制性地，有效载荷可以是旨在用于治疗或预防对象中的疾病的任意分子或物质。
在一些实施方式中，有效载荷为免疫刺激序列。
在本申请中使用的属于“免疫刺激序列”是指一类核苷酸或核苷酸类似序列，在施用该序列后能激活免疫细胞，例如促进或增加T效应细胞表达共刺激分子(例如OX40、4-1BB和/或CD3等等)、诱导INF-α产生和引起NK细胞的活化；和/或刺激B细胞的能力(例如刺激B细胞增殖和分泌IgM)。在一些实施方式中，所述免疫刺激序列能够促进和增加T效应细胞表达OX40。
在一些实施方式中，有效载荷为TLR9激动剂。TLR9(Toll样受体9)是Toll样受体家族成员之一，主要表达于树突细胞(DCS)和B细胞，是肿瘤治疗中十分有前景的靶点之一。TLR9自然识别的配体是细菌DNA中含有非甲基化CpG的序列。天然的和人工合成的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)能以TLR9依赖的方式刺激机体固有免疫应答。
在一些实施方式中，TLR9激动剂是寡核苷酸。在一些实施方式中，TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸(ODN)。在本领中，CpG OND由于具有良好的促进免疫应答的效果而常在临床研究中被用作免疫增强剂。但CpG ODN通常是以单链的形式单独地被使用。CpG ODN通常具有9-100个的碱基长度，优选的，CpG ODN具有18-50个碱基长度。更优选的，CpG ODN具有20-40个碱基长度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基长度。在又一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本申请使用的术语“配体”可以包括各种各样的化学分子或肽，其对所选定的靶点具有特异性的结合亲和性，所选定的靶点可以是细胞表面分子，例如细胞表面受体、细胞表面抗原、细胞、组织、器官等。在一些实施方式中，配体可以与靶细胞表面上表达的蛋白或标记物(即“细胞表面分子”)特异性结合。在一些实施方式中，本申请的配体以10-6～10-11M(Kd值)的亲和性与细胞表面蛋白或标记物结合。在一些实施方式中，本申请的配体以至少10-7、至少10-8、至少10-9M(Kd值)的亲和性与细胞表面蛋白或标记物结合。在一些实施方式中，本申请的配体以低于10-6、低于10-7、低于10-8M(Kd值)的亲和性与细胞表面蛋白或标记物结合。在一些实施方式中，本申请的配体以一定的亲和性与细胞表面蛋白或标记物结合，所述一定的亲和性是指与非靶细胞表面蛋白或标记物的亲和性相比，配体对靶细胞表面蛋白或标记物的亲和性高至少两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍或更多倍。在一些实施方式中，本申请的细胞表面蛋白或标记物在靶细胞(例如，癌细胞)中的表达显著高于在正常细胞中的表达。在本申请中使用的术语“显著”指的是统计学上的显著差异，或者可以由本领域技术人员认识到的显著性差异。
在本申请中使用的术语“配体部分”指的是包含双配体或多配体的能够靶向至靶部位、靶组织、靶器官、靶细胞或靶细胞内区域(例如细胞表面分子)的任意分子或部分。在一些实施方式中，相比于非靶部位、非靶组织、非靶器官、非靶细胞或非靶细胞内区域，配体部分使得包含该配体部分的双配体或多配体偶联物在靶部位、靶组织、靶器官、靶细胞或靶细胞内区域分配的更多，例如，多至少10％、20％、50％、80％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高。在一些实施方式中，相比于不含配体部分的化合物，带有所述配体部分的偶联物或或其药学上可接受的盐在靶部位、靶组织、靶器官、靶细胞或靶细胞内区域分配的更多，例如，多至少10％、20％、50％、80％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更高。在一些实施方式中，配体部分能够触发或促进含有此类配体部分的偶联物与靶分子的特异性结合，触发或促进靶细胞对偶联物的内吞作用，触发或促进偶联物在靶细胞周围富集和/或进入靶细胞。
在一些实施方式中，本申请的细胞表面分子(蛋白或标记物)在靶细胞(例如，癌细胞)中的表达水平是在正常细胞中的表达水平的2倍至1,000,000倍，例如在靶细胞(例如，癌细胞)中的表达水平比在正常细胞中的表达水平高2倍至10倍、2倍至100倍、2倍至1,000倍、2倍至10,000倍、2倍至100,000倍、2倍至1,000,000倍(可以等于上述数值范围内的任意值，包括该范围的端点)。在一些实施方式中，细胞表面受体在靶细胞(例如，癌细胞)中的表达水平比在正常细胞中的表达水平高至少10倍、或者至少100倍、或者至少1,000倍、或者至少10,000倍、或者至少100,000倍。在一些实施方式中，当与靶细胞(例如，癌细胞)上的细胞表面分子(蛋白或标记物)的水平比较时，正常细胞上的细胞表面分子的水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，本申请所述的细胞表面分子在正常细胞中是不能检测到的。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与细胞表面分子结合。在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。在一些实施方式中，所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。在一些实施方式中，所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
FOLR1(叶酸受体1)是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖蛋白，它以纳摩尔的亲和力结合叶酸，从而促进受体介导的内吞作用。快速生长的实体恶性肿瘤，包括卵巢癌和肺癌，都依赖于叶酸进行代谢和核酸合成。在一些实施方式中，本申请所述的配体部分包括靶向FOLR1的配体。在一些实施方式中，靶向FOLR1的配体为叶酸或叶酸类似物。在一些实施方式中，叶酸类似物选自5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、甲氨蝶呤和5,10-亚甲基四氢叶酸。
PSMA(前列腺特异性膜抗原)指存在于前列腺上皮细胞膜的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由750个氨基酸组成，其具有19个胞内区氨基酸、24个跨膜区氨基酸和707个胞外区氨基酸。前列腺特异性膜抗原在正常前列腺上皮细胞中表达，但其在前列腺癌细胞中的表达水平要高得多。相对于传统用于临床检测的前列腺特异抗原，前列腺特异性膜抗原是一种更加敏感和特异的前列腺癌肿瘤标记物，尤其是在激素难治性前列腺癌及前列腺癌转移灶中均为高表达，在区分前列腺癌和其他类型恶性肿瘤时具有高敏感度和特异性。同时，在多种非前列腺来源的实体瘤(如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和结直肠癌等)中，前列腺特异性膜抗原也高度特异地表达于肿瘤血管内皮细胞上。
在一些实施方式中，本申请的靶向PMSA的配体可以选自由以下组成的组：2-[[甲基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[乙基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丙基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丁基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[环己基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[苯基羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[2-(四氢呋喃基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(2-四氢吡喃基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基乙基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丙基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丁基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基丁基)甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(4-苯基丁基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；和2-[[(氨甲基)羟基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[甲基羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[乙基羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丙基羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丁基羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[苯基羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羟基氧膦基]氧]戊二酸；和2[[((2-苯基乙基)甲基)羟基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(N-羟基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-甲基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-丁基-N-羟基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-苄基-N-羟基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-苯基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-2-苯基乙基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-乙基-N-羟基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-丙基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-3-苯基丙基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基-N-4-吡啶基)氨基甲酰]甲基]戊二酸；2-[[(N-羟基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(甲基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(苄基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(苯基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(2-苯基乙基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(乙基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(丙基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羟基(3-苯基丙基)酰胺]甲基]戊二酸；和2-[[N-羟基(4-吡啶基)酰胺]甲基]戊二酸；2-[(亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(甲基亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亚硫酰基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亚硫酰基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亚硫酰基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亚硫酰基]甲基]戊二酸；2-[(苄基亚硫酰基)甲基]戊二酸；2-[(磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(甲磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(乙磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(丙磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(丁磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(苯基磺酰基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)磺酰基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)磺酰基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)磺酰基]甲基]戊二酸；2-[(苄基磺酰基)甲基]戊二酸；2-[(亚砜亚胺基(sulfoximinyl))甲基]戊二酸；2-[(甲基亚砜亚胺基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亚砜亚胺基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亚砜亚胺基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亚砜亚胺基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亚砜亚胺基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亚砜亚胺基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亚砜亚胺基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亚砜亚胺基]甲基]戊二酸；和2-[(苄基亚砜亚胺基)甲基]戊二酸；N-[甲基羟基氧膦基]谷氨酸；N-[乙基羟基氧膦基]谷氨酸；N-[丙基羟基氧膦基]谷氨酸；N-[丁基羟基氧膦基]谷氨酸；N-[苯基羟基氧膦基]谷氨酸；N-[(苯基甲基)羟基氧膦基]谷氨酸；N-[((2-苯基乙基)甲基)羟基氧膦基]谷氨酸；和N-甲基-N-[苯基羟基氧膦基]谷氨酸。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的双配体或多配体直接连接或者通过间隔区连接。在一些实施方式中，所述间隔区由氨基酸组成。在一些实施方式中，所述间隔区由天然氨基酸或非天然氨基酸组成。在一些实施方式中，间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸。在一些实施方式中，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。在一些实施方式中，所述间隔区可在特定的生理环境下通过蛋白酶裂解或还原裂解。在一些实施方式中，间隔区可以被由靶细胞特异性表达或将由靶细胞表达的蛋白酶裂解。
在本申请中使用的属于“可裂解”或“裂解”包括了在本申请提供的偶联体化合物上进行的代谢过程或反应过程，从而将有效载荷与配体部分之间的连接子，或配体之间的间隔区破坏以释放游离的有效载荷或配体。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000221
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。本申请所述的“click反应”为一类具有高效性和高选择性的化学合成方法。click反应通过形成高效连接单元把几个分子片段拼接起来，整个反应过程简单、快捷且副产物少。一些click反应的实例包括但不限于硫醇与烯烃的加成反应、叠氮化物与炔烃的环化反应。
在本申请中使用的术语“连接子”指的是将有效载荷与配体部分共价连接的分子或部分。连接子包括用于将有效载荷与配体部分连接的官能团。在一些实施方式中，官能团可以含有两个反应性部分，一个用于与有效载荷连接，另一个用于与配体部分连接。在一些实施方式中，官能团彼此之间是不同的。在一些实施方式中，官能团包括含有巯基反应性部分、胺反应性部分或羧酸反应性部分的基团。在一些实施方式中，官能团彼此之间是相同的。
在一些实施方式中，连接子足够稳定以避免在血液循环过程中意外释放有效载荷，以增加有效载荷到靶细胞或组织的有效量。在一些实施方式中，连接子能够在靶细胞周围或内部释放有效载荷以有效发挥免疫刺激的功能。
在一些实施方式中，连接子是不可裂解的。在本申请中使用的不可裂解连接子指的是在细胞内代谢期间基本保持完整的连接子。在一些实施方式中，连接子是可裂解的。在一些实施方式中，可裂解官能团在一般情况下是足够稳定的，但是其在靠近或聚集于靶细胞时，或进入靶细胞后倾向于裂解以释放有效载荷。在一些实施方式中，可裂解官能团在靶细胞中的裂解效率比在血液或血清中的裂解效率高至少10、20、30、50、100倍或更多倍。在一些实施方式中，本申请的可裂解连接子可以被水解、酶促反应、或还原反应、或通过pH改变所裂解。在一些实施方式中，连接子在特定生理环境下(例如，在适宜pH环境下)是可裂解的。
在一些实施方式中，双配体或多配体偶联物的连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
在一些实施方式中，配体偶联物具有以下结构：
Figure BDA0003829991380000241
施用
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐和所述T-效应细胞激动剂被同时施用。
在一些实施方式中，施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后一段时间，再施用所述T-效应细胞激动剂。在一些实施方式中，施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后1分钟到3天，再施用所述T-效应细胞激动剂。在一些实施方式中，施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后0.1-48小时，再施用所述T-效应细胞激动剂。在一些实施方式中，施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时，再施用所述T-效应细胞激动剂。
在一些实施方式中，施用所述T-效应细胞激动剂之后一段时间，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，施用所述T-效应细胞激动剂之后1分钟到3天，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，施用所述T-效应细胞激动剂之后0.1-48小时，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，施用所述T-效应细胞激动剂之后0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐。
本申请提供的T-效应细胞激动剂以及配体偶联物或其药学上可接受的盐，可以通过所属领域中已知的任何途径给药，例如肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内、阴道内、上表皮、瘤内、经皮或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、经粘膜、眼内、舌下、经直肠或局部)途径。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐通过静脉注射的方式施用。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂通过腹腔施用、静脉施用或皮下施用，优选的，通过腹腔注射施用。
在一些实施方式中，本申请所述的配体偶联物和/或T-效应细胞激动剂以治疗有效量进行施用。在本申请中使用的术语“治疗有效量”指的是所述配体偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物在一定程度上减轻对象中疾病或病症的一种或多种症状的量；使与疾病或病症相关或导致疾病或病症的一个或多个生理或生化参数部分或完全恢复正常的量；和/或降低疾病或病症发病的可能性的量。
本申请所述的配体偶联物和/或T-效应细胞激动剂的有效量将取决于所属领域中已知的各种因素，如个体的体重、年龄、既往病史、当前药品、健康状态以及发生交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及给药途径和疾病发展程度。如由这些和其它情况或要求所指示，所属领域的技术人员(例如医生或兽医)可按比例减少或增加剂量。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周两次；且T-效应细胞激动剂的施用频次为每周两次。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐以每次1-400mg的剂量进行施用。优选的，以每次25mg-150mg的剂量进行施用。更优选的，以每次25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg或150mg的剂量进行施用。在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂以每次1-600mg的剂量进行施用。优选的，以每次25mg-250mg的剂量进行施用。更优选的，以每次25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg或250mg的剂量进行施用。在一些实施方式中，T-效应细胞激动剂的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
在一些实施方式中，配体偶联物或其药学上可接受的盐，或者药物组合物的量足以在对象中抑制疾病或病症，或者预防性地抑制或阻止疾病或病症的发病。尽管治疗有效量可以在不同对象中改变，但是其范围通常为从0.01至100mg/kg，例如0.01至90mg/kg、0.01至80mg/kg、0.01至70mg/kg、0.01至60mg/kg、0.01至50mg/kg、0.01至40mg/kg、0.01至30mg/kg、0.01至20mg/kg、0.01至10mg/kg、0.01至5mg/kg、0.01至4mg/kg、0.01至3mg/kg、0.01至2mg/kg、0.01至1mg/kg、0.01至0.1mg/kg。本申请所述的治疗有效量可以等于上述数值范围内的任意值，包括该范围的端点。
在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，优选的，所述受试者是人。在本申请中使用的术语“受试者”指的是人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。受试者也可以是家畜，例如，牛、猪、羊、家禽和马，或家养动物，例如，狗和猫。对象可以是雄性(例如，男性)或雌性(例如，女性)，可以是老年，成年、青少年、儿童或婴儿。人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人或其他种族背景人士，或者是这些种族背景的混合。
本申请的一个方面公开了一种制备配体偶联物的方法，所述方法包括将本申请所述配体部分与有效载荷连接。在一些实施方式中，配体部分与有效载荷直接连接。在一些实施方式中，配体部分与有效载荷通过连接子连接。
本申请的一个方面公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本申请所述的药物组合物用于静脉内、皮下、口服、肌内或心室内施用。在一些优选的实施方式中，所述配体偶联物或其药学上可接受的盐或所述药物组合物通过静脉内施用。
在本申请中使用的术语“药学上可接受的”指的是在合理的医学判断范围内，其适用于与人和其他动物的细胞接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比是相称的。
在本申请中使用的术语“药学上可接受的盐”指的是本申请的配体偶联物的相对无毒性的、无机和有机酸加成盐和碱加成盐。代表性的酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、羟乙基磺酸盐、二对甲苯甲酰基酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸月桂基磺酸盐等。碱加成盐包括药学上可接受的金属和胺盐。适宜的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝盐。在一些实施方式中，钠盐和钾盐是优选的。适宜的无机碱加成盐由金属碱制备，所述金属碱包括例如氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁和氢氧化锌。适宜的胺碱加成盐由具有足够碱性的胺制备，以形成稳定的盐，并且优选包括以下常用于药物化学的胺，因为其毒性较低并且是医疗用途可接受的：氨、乙二胺、N-甲基葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三羟甲基氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)以及二环己胺等。
在本申请中使用的术语“药学上可接受的载体”指的是用于向对象递送本申请提供的偶联体化合物的药学上可接受的溶剂、混悬剂或任意其他药学上惰性的载剂，其不干扰偶联体化合物的结构和性质。某些这样的载体能够将偶联体化合物配制成例如片剂、丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂和软锭剂，供对象口服摄入。某些这样的载体能够将偶联体化合物制成注射、输注或局部施用的制剂。
用于本申请提供的药物组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于，例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性载剂(例如，氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或者右旋糖和乳酸林格氏注射液)、非水性载剂(例如，植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抗微生物剂、等渗剂(例如，氯化钠或右旋糖)、缓冲剂(例如，磷酸或柠檬酸缓冲剂)、抗氧剂(例如，硫酸氢钠)、麻醉剂(例如，盐酸普鲁卡因)、混悬剂/分散剂(例如，羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如，EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸))、乳化剂(例如，聚山梨醇酯80(吐温-80))、稀释剂、佐剂、赋形剂、或无毒性辅助物质、本领域公知的其他成分或其各种组合。适宜的成分可以包括例如填充剂、粘合剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
在一些实施方式中，药物组合物是注射制剂。注射制剂包括无菌水溶液或分散剂、混悬剂或乳剂。在所有情况下，注射制剂应该是无菌的并且应该是流体以便于注射。注射制剂应在生产和储存条件下保持稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。注射制剂应保持适当的流动性。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过使用表面活性剂等保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂实现阻止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
在一些实施方式中，药物组合物可以通过与一种或多种其他药物混合使用。在一些实施方式中，药物组合物包含至少一种其他药物。在一些实施方式中，其他药物是抗肿瘤药、心血管药、抗炎药、抗病毒药、消化系统药、神经系统药、呼吸系统药、免疫系统药、皮肤病药、代谢药等。
在一些实施方式中，可以通过适宜的途径向有需要的对象施用药物组合物，包括但不限于口服、注射(例如，静脉内、肌内、皮下、皮内、心内、鞘内、胸膜内、腹膜内注射等)、粘膜(例如，鼻内、口内施用等)、舌下、直肠、经皮、眼内和肺部施用。在一些实施方式中，药物组合物可以静脉内、皮下、口服、肌内或心室内施用。在一些实施方式中，药物组合物可以静脉内注射。
本申请的另一个方面公开了一种用于治疗对象中的疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本申请所述的偶联体化合物或其药学上可接受的盐，或者本申请所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括将一种或多种治疗剂与所述偶联体化合物或其药学上可接受的盐，或者所述药物组合物联合施用。
本申请的又一个方面公开了本申请所述的偶联体化合物或其药学上可接受的盐，或者本申请所述的药物组合物在用于制备治疗对象中的疾病的药物中的用途。
以下将通过具体实施例更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地意识到可以对多种非关键参数进行改变或修改以产生基本上相同的结果。
实施例
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包含在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包含在本发明的范围内。
实施例1配体偶联物的制备
1.配体部分的制备
(1)CR19208的制备和纯化
Figure BDA0003829991380000301
将Rink Amide-AM树脂装载于固相反应柱中，加入二氯甲烷，氮气鼓泡至溶剂中，使树脂溶胀30分钟，抽干二氯甲烷；用DBLK脱除Fmoc保护基团，称取Fmoc-Lys(Dde)-OH、HOBt和HBTU，用DMF及二氯甲烷溶解，0℃冰水浴下向上述溶液中加入DIPEA，混合使其活化10分钟，将该溶液加入上述反应柱中，反应2小时后抽干溶剂，洗涤反应柱中的树脂3遍。随后用DBLK脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照结构依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。随后用DBLK脱除Fmoc保护基团，称取中间体CR19607(结构如下所示)、HOBt和PyBop，用DMF及二氯甲烷溶解，0℃冰水浴下向上述溶液中加入DIPEA，混合使其活化10分钟，将该溶液加入上述反应柱中，反应2小试后抽干溶剂，洗涤反应柱中的树脂3遍，用水合肼的DMF溶液脱保护2次。称取Fmoc-Glu-OtBu、HOBt和HBTU，用DMF及二氯甲烷溶解，0℃冰水浴下向上述溶液中加入DIPEA，混合使其活化10分钟，将该溶液加入上述反应柱中，反应2小试后抽干溶剂，洗涤反应柱中的树脂3遍。然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，称取蝶酸、HOAt、EDC.HCl和DIPEA，溶于DMSO中，在25℃下反应20小时。树脂用裂解液裂解后过滤，滤液倒入MTBE中，析出固体，用MTBE洗，得到粗品，粗品经Pre-HPLC制备得到配体-01(即CR19208)。
Figure BDA0003829991380000311
(2)CR20302的制备和纯化
Figure BDA0003829991380000312
称取CR19208(1.0eq)和CR20301(5.0eq)于250mL三口瓶中，加入40ml乙腈及50ml水使其溶解，冰水浴下用饱和NaHCO3溶液调节溶液pH至7～7.5。撤走冰水浴室温反应，中控反应完毕后，获得CR20302反应液。
将获得的CR20302反应液用布氏漏斗过滤，使用2倍量水冲洗滤渣后合并上清液，用0.45μm有机膜过滤上清液，滤液稀释后上样，制备纯化体系流动相A：乙腈，流动相B：10mmol/L碳酸氢铵水溶液，采用50*250mm色谱柱(填料为UniSil 10-120C18 Ultra)，流速为每分钟50ml，检测波长为220+254nm，收集产品馏分，冻干得CR20302，纯度99.75％，ESI+[M+2H]2+：816.76。
2.配体偶联物的制备和纯化
称取CR19501(1.0eq)和CR20302(2.8eq)于1L三口瓶中，加入300ml乙腈及280ml水使其溶解，冰水浴，内温控制10℃，氮气保护并避光，用饱和NaHCO3溶液调节溶液pH至7.5～8。撤走冰水浴室温反应，中控反应完毕后，获得CR19503反应液。
将获得的CR19503反应液用布氏漏斗(0.45μm有机膜)过滤，滤液上样，制备纯化体系流动相A：100mmol/L三乙胺水溶液，醋酸调至pH＝6.0，流动相B：ACN，采用50*250mm色谱柱(填料为UniSil 10-120 C18 Ultra)，流速为每分钟50ml，检测波长为220+254nm，收集产品馏分，该馏分盐置换上样，体系流动相A：乙腈，流动相B:20mmol/L醋酸钠水溶液，采用50*250mm色谱柱(填料为UniSil 10-120 C18 Ultra)，流速为每分钟50ml，检测波长为220+254nm，A:B＝5:95冲洗两倍体积，后用流动相A：乙腈，流动相B：纯水，洗脱柱子，收集产品馏分，冻干得产品CR19503，纯度99.71％，ESI-[M-H]-:11404.5。
CR19503
Figure BDA0003829991380000331
实施例2配体偶联物在CT26.WT模型中的药效学研究-1
CDX模型：CT26.WT
实验方案：将准备好的细胞接种于BALB/c小鼠右侧皮下，当肿瘤体积扩增到约100mm3时随机分组，设置模型对照组和给药组，实验分组和给药方案见表1，其中测试物OX40为抗OX40抗体(购买于BioXCell；货号BE0031；克隆：OX-86；种型：Rat IgG1,κ；纯度：大于95％；RRID：AB_1107592；分子量：150kDa；商品链接：https://bxcell.com/product/m-cd134-ox40/)，CR19501为CpG(序列如SEQ ID NO:1所示)。
表1.动物实验分组和给药方案
Figure BDA0003829991380000341
*：50μg/25μl是指注射物为25μl(通过将活性物质溶解于PBS获得)，其中含有50μg活性物质。
**：5mg/kg是指根据小鼠体重施用抗OX40抗体，其中每千克体重对应施用5mg抗体。
***：45μg/0.1ml是指注射物为0.1ml，其中含有45μg活性物质。
#：qw*3w是指每周给药一次，实验周期为3周，即1个实验周期给药共计3次。
##：单次是指实验研究过程中仅给药1次。
###：biw*3w是指每周给药两次，实验周期为3周，即1个实验周期给药共计6次。
分组给药后，监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。分组给药后，每周测量两次小鼠体重，计算体重变化率；同时以游标卡尺测量肿瘤长径、短径，并计算肿瘤体积、相对肿瘤增值率、肿瘤体积抑瘤率等指标。肿瘤体积公式为TV＝0.5a×b2，其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径。
实验结果：如表2所示，CR19501作为单个药物施用(组2)时，在50μg/25μl剂量下没有明显的抑瘤作用。配体偶联物CR19503作为单个药物施用(组4、5和6)时，在45μg/0.1ml和75μg/0.1ml剂量下具有明显的抑瘤作用，其中组4、5和6的相对肿瘤抑制率TGI(％)分别达到了72％、83％和75％。在75μg/0.1ml剂量下，1只小鼠肿瘤达到了完成消退。抗OX40抗体作为单个药物施用(组3)时，在5mg/kg剂量下没有明显的抑瘤作用。CR19501与抗OX40抗体联合用药后，药效有所提高(组7，TGI＝81％)。配体偶联物CR19503与抗OX40抗体联合用药后，有相当高的药效(组8，TGI＝93％；组9，TGI＝96％)，且组内数只小鼠肿瘤达到了完全消退。
表2.对CDX模型(CT26.WT)的生长抑制作用
组别 肿瘤抑制率(％)
组1 --
组2 54
组3 57
组4 72
组5 83
组6 75
组7 81
组8 93
组9 96
实施例3配体偶联物在CT26.WT模型中的药效学研究-2
CDX模型：CT26.WT
实验方案：将准备好的细胞接种于BALB/c小鼠右侧皮下，当肿瘤体积扩增到约85mm3时随机分组，设置模型对照组和给药组，实验分组和给药方案见表3。
表3.动物实验分组和给药方案
Figure BDA0003829991380000361
分组给药后，监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。分组给药后，每周测量两次次小鼠体重，计算体重变化率；同时以游标卡尺测量肿瘤长径、短径，并计算肿瘤体积、相对肿瘤增值率、肿瘤体积抑瘤率等指标。肿瘤体积公式为TV＝0.5a×b2，其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径。
实验结果：如表4所示，配体偶联物CR19503分别以45μg/只和90μg/只剂量在一周一次的给药频率并联合抗OX40抗体(5mg/kg剂量，一周两次给药频率)对小鼠同源移植结直肠癌模型CT26.WT的肿瘤生长均产生了明显的抗肿瘤效果。且在同等剂量下，多次给药(联合抗OX40抗体)的给药方案下的抗肿瘤效果高于单次给药(联合抗OX40抗体)的给药方案。
表4.对CDX模型CT26.WT的生长抑制作用
组别 肿瘤抑制率(％)
组1 --
组2 50
组3 62
组4 71
组5 41
组6 52
组7 59
实施例4配体偶联物在BALB/c小鼠模型中的安全性评价研究-1
实验方案：70只雌性小鼠根据体重大小随机分组，分为以下7组：空白对照组、CR19501低、中、高剂量组和配体偶联物CR19503低、中、高剂量组，分组当天定义为分组后第0天，分组后第0天开始给药。动物分组和给药方案详见表5。
表5.动物实验分组和给药方案
Figure BDA0003829991380000371
Figure BDA0003829991380000381
实验结果：小鼠对不同剂量的CR19501和配体偶联物CR19503的耐受良好，体重呈增长趋势，实验期间无小鼠死亡。
实验终点解剖取肝、脾，结果如图1和图2显示，CR19501不同剂量给药组中，小鼠的肝脏、脾脏发生明显肿大现象，与肝、脾脏重量分析结果一致，表明CR19501存在一定的肝脏、脾脏毒副作用，且有一定的剂效关系(需要进一步进行病理学检查确认)。CR19503不同剂量给药组中，小鼠的肝脏、脾脏发生明显肿大现象，与肝、脾脏重量分析结果一致，表明CR19503存在一定的肝脏、脾脏毒副作用，且有一定的剂效关系(需要进一步进行病理学检查确认)。
实施例5配体偶联物在BALB/c小鼠模型中的安全性评价研究-2
实验方案：120只雌性小鼠根据体重随机分入15组，每组8只，分组当天定义为分组后第0天。分组后第0天开始给药。CR19501和配体偶联物CR19503给药体积为0.1mL/只；抗OX40抗体根据小鼠最近一次的体重调整给药量，给药体积为10μl/g。120只雌性小鼠根据体重大小随机分组。实验分组和给药方案见表6。
表6.动物实验分组和给药方案
Figure BDA0003829991380000382
Figure BDA0003829991380000391
实验结果：小鼠体重总体呈增长趋势(见图3)。给药后第13天，组8中1只小鼠发生死亡。给药后第16天，组15中1只小鼠发生死亡。给药后第20天，组6中1只小鼠发生死亡；组9中1只小鼠发生死亡；组12中1只小鼠发生死亡。研究结果表明，无论是单独用药，还是联合用药，配体偶联物CR19503都具有一定的耐受性。
肝脏、脾脏重量结果显示，在末次给药后即时取材时，配体偶联物CR1950327.5μg/只单次给药组(组10)、配体偶联物CR19503 55μg/只单次给药与抗OX40抗体联用组(组14)的小鼠的肝脏、脾脏重量显著低于多次给药组。与对照组小鼠肝脏、脾脏重量相比，无显著性差异(见图4和图5)。在末次给药后恢复4周后取材时，各给药组小鼠的肝脏、脾脏明显恢复，重量与对照组相比，无显著性差异(见图6和图7)，研究结果表明，偶联物化合物CR19503的毒副作用是可以恢复的。

Claims (71)

1.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，其中所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列，所述疾病是能受益于T-效应细胞激动的疾病。
2.根据权利要求1所述的方法，所述双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够与T-效应细胞激动剂产生协同作用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐能够上调T-效应细胞激动剂的靶点的表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述有效载荷为TLR9激动剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述TLR9激动剂是寡核苷酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述双配体或多配体偶联物的所述配体部分与细胞表面分子结合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述双配体或多配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，所述间隔区中的氨基酸中的羧酸被酰胺化。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述配体部分具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000021
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000031
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂是抗体。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031、信达生物的IBI101、恒瑞医药的SHR-1806、科望生物的ES102、百时美施贵宝的BMS-986178、辉瑞的PF-04518600、艾伯维的ABBV-368或祐和生物的TH002，优选的，所述抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐和所述T-效应细胞激动剂被同时施用。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后一段时间，再施用所述T-效应细胞激动剂，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中施用所述T-效应细胞激动剂之后一段时间，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐通过静脉注射的方式施用。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂通过腹腔施用、静脉施用或皮下施用，优选的，通过腹腔注射施用。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂的施用频次为每周一次、每周两次、每周三次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次；优选的所述施用频次为每周一次；优选的所述施用频次为每周两次。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用频次为每周两次；且所述T-效应细胞激动剂的施用频次为每周两次。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐以每次1-400mg的剂量进行施用。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述配体偶联物或其药学上可接受的盐的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂以每次1-600mg的剂量进行施用。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述T-效应细胞激动剂的施用剂量随治疗过程逐渐减少。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，优选的，所述受试者是人。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述能受益于T-效应细胞激动剂的疾病是癌症或免疫性疾病。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症选自下组：肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、食道癌、肺癌、肾癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、睾丸癌、皮肤癌、前列腺癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫性疾病选自下组：结缔组织病、系统性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
37.一种试剂盒，其包含(1)双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐和(2)T-效应细胞激动剂，所述双配体或多配体偶联物具有与配体部分连接的有效载荷，所述有效载荷是免疫刺激序列。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述有效载荷为TLR9激动剂。
39.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述TLR9激动剂是寡核苷酸。
40.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。
41.根据权利要求40中任一项所述的试剂盒，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。
42.根据权利要求40或41所述的试剂盒，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的试剂盒，所述双配体或多配体偶联物的所述配体部分与细胞表面分子结合。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的试剂盒，所述双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的试剂盒，其中所述配体靶向不同的细胞表面分子，所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述双配体或多配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。
48.根据权利要求37-47中任一项所述的试剂盒，其中所述配体部分具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000061
49.根据权利要求37-48中任一项所述的试剂盒，其中所述配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
51.根据权利要求37-50中任一项所述的试剂盒，其中所述配体偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000081
52.根据权利要求37-51中任一项所述的试剂盒，其中所述T-效应细胞激动剂是抗体。
53.根据权利要求37-52中任一项所述的试剂盒，其中所述T-效应细胞激动剂是抗OX40抗体或其抗原结合片段。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031、信达生物的IBI101、恒瑞医药的SHR-1806、科望生物的ES102或祐和生物的TH002，优选的，所述抗OX40抗体选自BioXCell的BE0031。
55.根据权利要求37-54中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被设置为使所述配体偶联物或其药学上可接受的盐和所述T-效应细胞激动剂被同时施用。
56.根据权利要求37-54中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被设置为施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐之后一段时间，再施用所述T-效应细胞激动剂，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
57.根据权利要求37-54中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被设置为施用所述T-效应细胞激动剂之后一段时间，再施用所述配体偶联物或其药学上可接受的盐，优选的，所述一段时间是1分钟到3天。
58.一种双配体或多配体偶联物或其药学上可接受的盐，所述双配体或多配体偶联物包含与靶向细胞表面分子的配体部分连接的有效载荷，其中所述有效载荷是免疫刺激序列。
59.根据权利要求58所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述有效载荷为TLR9激动剂。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述TLR9激动剂是寡核苷酸。
61.根据权利要求59所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述TLR9激动剂为含有1个或多个非甲基化的CpG基序的CpG寡核苷酸。
62.根据权利要求61所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1-11所示的核苷酸中的任一条核苷酸序列。
63.根据权利要求61或62所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，所述双配体或多配体部分分别与不同的细胞表面分子结合。
65.根据权利要求64所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞表面分子在癌细胞中高表达。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述细胞表面分子分别为FOLR1和PSMA。
67.根据权利要求66所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述至少两个配体直接连接或者通过间隔区连接；优选的，所述间隔区为1个氨基酸、2个氨基酸或3个氨基酸；优选的，所述间隔区为半胱氨酸、赖氨酸、半胱氨酸-赖氨酸、赖氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-赖氨酸、半胱氨酸-谷氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸、天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸或赖氨酸-半胱氨酸-赖氨酸，可选的，上述氨基酸中的羧酸被酰胺化。
68.根据权利要求58-67中任一项所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体部分具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000101
69.根据权利要求58-68中任一项所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述配体部分与有效载荷直接连接或通过连接子连接；优选的，通过click反应完成所述连接；优选的，所述配体部分通过巯基与所述有效载荷连接。
70.根据权利要求69所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述连接子包含以下结构：-S-、-S-(CH2)6-O-、-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-或-S-(CH2)6-O-P(＝S)(OH)-O-。
71.根据权利要求58-70中任一项所述的配体偶联物或其药学上可接受的盐，其中
所述配体偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003829991370000111
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