CN116059368A - Smo抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用 - Google Patents
Smo抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供SMO抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用。本发明创造性地发现SMO抑制剂可在高糖刺激下保护内皮细胞，减轻内皮细胞功能障碍，具体为降低LDH、减少细胞凋亡、减少炎症细胞因子TNF‑α、MCP‑1和IL‑6的产生。进一步地，本发明发现SMO抑制剂能够通过提高血管的血流流速，增加血管内径，改善血管内膜增厚变化以及减少炎症细胞因子的产生来改善内皮细胞功能障碍，进而实现了预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的目的。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，涉及SMO抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用。
背景技术
糖尿病(DM)是世界范围内的主要公共卫生问题，是心血管事件和心血管死亡的既定独立危险因素。糖尿病的典型特征是高血糖。最常见的糖尿病类型是1型糖尿病，在这种糖尿病中，胰岛素的绝对缺乏会导致胰腺细胞的破坏，此外还有2型糖尿病，胰岛素抵抗可能导致高血糖。糖尿病容易产生多种并发症，这些并发症几乎会涉及到身体的每一个组织，同时糖尿病是导致高心血管发病率和高死亡率、失明、肾衰竭和截肢等病症的主要原因。此外，青少年和40岁以下的年轻人早期诊断2型糖尿病与疾病的严重程度有关，这样会导致严重并发症的过早发展。
糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症，是慢性肾脏疾病的主要原因。大约40％的糖尿病患者会发展为糖尿病肾病，其特点是蛋白尿和血压升高，肾功能下降，并发展为终末期肾脏病(ESRD)。这些发人深醒的统计数字强调了追溯糖尿病及其并发症的根本原因的重要性，以便于为这种疾病的治疗提供干预的最佳措施。当发展成为终末期肾病后，则需要进行透析改善病情。
动静脉内瘘(Arteriovenous Fistula，AVF)是终末期肾脏病患者接受血液透析血管通路的首选。AVF的使用寿命长，并发症少，为血液透析治疗创造了有利条件。然而，AVF的初级通畅率较低，一项meta分析显示，AVF的初级通畅率1年为60％，在2年为51％。经皮腔内血管成形术(PTA)是血管狭窄引起的AVF功能障碍的一线治疗方法。然而，部分患者在血透通路再通后会面临继发性狭窄。PTA后，由于静脉新内膜增生(VNH)引起的再狭窄导致AVF再狭窄，导致通畅性差。研究表明，次级通畅率在1年时为71％，在2年为64％。
随着经济的发展和人均寿命的延长，我国糖尿病的患病率正在急剧增高。糖尿病及其并发症对患者的健康和生命造成威胁，甚至导致残废和早亡，给社会造成巨大的资金和资源上的浪费。糖尿病伤害全身大小血管，因此，血管集中的地方就会成为糖尿病并发症的“重灾区”，包括肾脏、大中血管、视网膜、神经系统等。每年需要的医疗费用是个庞大的数字。糖尿病及其并发症的防治是本发明面临的一个重大公共卫生问题。
尽管糖尿病肾病进行AVF是一个治疗的方案，是大多数患者的治疗福音，但是在有一些患者在进行频繁透析后会出现瘘管狭窄的问题，通畅率不理想。即使在狭窄后进行再通畅手术干预，次级通畅率也不理想。这其中涉及到引发瘘管狭窄的机制，但目前其具体机制还不够明确，仍缺乏有效的预防治疗方法与后续治疗靶点。所以本发明亟需寻找新的治疗靶点和安全有效的新药来缓解和减轻糖尿病肾病AVF狭窄发病过程中的关键分子事件。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供SMO(Smoothened)抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用。所述动静脉内瘘通路狭窄包括糖尿病肾病血液透析中的动静脉内瘘狭窄。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供SMO抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺(Cyclopamine)、维莫德吉(vismodegib)或格拉吉布(glasdegib)中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如环巴胺和维莫德吉的组合、格拉吉布和环巴胺的组合、维莫德吉和格拉吉布的组合或环巴胺+格拉吉布+维莫德吉的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
优选地，所述药物的剂型包括溶液剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括稀释剂、崩解剂、调味剂、粘合剂、赋形剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的产品中的应用。所述产品例如动物饲料添加剂等，可用于动静脉内瘘通路狭窄相关的科研中。
第二方面，本发明提供SMO抑制剂在制备预防或治疗由内皮损伤引起的血管炎的药物中的应用。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第三方面，本发明提供SMO抑制剂在制备维持或提高血管内的血流速度的药物中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备维持或提高血管内的血流速度的产品中的应用。所述产品例如动物饲料添加剂等，可用于血管相关的科研中。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第四方面，本发明提供SMO抑制剂在制备增加血管内径的药物中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备增加血管内径的产品中的应用。所述产品例如动物饲料添加剂等，可用于血管相关的科研中。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第五方面，本发明提供SMO抑制剂在制备预防或改善血管内膜增厚的药物中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备改善血管内膜增厚的产品中的应用。所述产品例如动物饲料添加剂等，可用于血管相关的科研中。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第六方面，本发明提供SMO抑制剂在制备降低乳酸脱氢酶的药物中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备降低乳酸脱氢酶的产品中的应用。所述产品例如动物饲料添加剂等，可用于乳酸脱氢酶相关的科研中。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第七方面，本发明提供SMO抑制剂在制备TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂或MCP-1拮抗剂中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备TNF-α拮抗剂、IL-6拮抗剂或MCP-1拮抗剂中的应用。所述应用例如TNF-α、IL-6拮抗剂或MCP-1拮抗剂相关的基础研究等。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第八方面，本发明提供SMO抑制剂在制备血管内皮细胞的细胞凋亡抑制剂中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的制备血管内皮细胞的细胞凋亡抑制剂中的应用，所述应用例如血管内皮细胞的凋亡机制等基础研究。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
第九方面，本发明提供SMO抑制剂在制备降血糖的食品、保健品或药物中的应用。
本发明还提供SMO抑制剂在以非诊断/治疗为目的的降血糖产品中的应用。例如动物饲料添加剂等，可用于与血糖水平相关的科研中。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首先对高糖导致血管内皮细胞功能障碍的机制进行研究，创造性地发现：1、高糖处理下内皮细胞的Hedgehog(Hh)信号通路高度活化，导致了内皮细胞功能障碍；2、高糖诱导内皮细胞的SMO、STK36和SHH的表达水平显著升高，它们是Hh信号通路中的关键基因，其中SMO是上调最高的基因；3、靶向(敲低)SMO基因可以保护处于高糖状态的内皮细胞，改善其功能障碍(表现为降低LDH(乳酸脱氢酶)、减少细胞凋亡、提高细胞活力、促进细胞增殖、恢复细胞迁移能力、抑制炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的表达)。
基于上述机制研究，本发明进一步发现并证实了：1、SMO抑制剂可保护高血糖诱导的内皮细胞，改善内皮细胞功能障碍(表现为降低LDH、减少细胞凋亡、减少炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的产生)；2、SMO抑制剂通过提高血管的血流流速，增加血管内径，改善血管内膜增厚变化以及减少炎症细胞因子的产生来改善内皮细胞功能障碍，进而实现了预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的目的；3、与其他SMO抑制剂相比，环巴胺(Cyc)在保护高血糖诱导的内皮细胞，改善内皮细胞功能障碍方面效果最好，从而能够更有效地预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄。
本发明通过在糖尿病肾病AVF大鼠模型中进行药物(SMO抑制剂)干预治疗，成功减轻了AVF发生狭窄的现象，保护血管内皮细胞功能，改善了AVF的通畅率，显著延长了透析通路的使用时限。
本发明从改善糖尿病肾病AVF发生狭窄入手，利用SMO抑制剂实现了防止糖尿病肾病AVF血管内皮细胞发生功能障碍而造成的AVF狭窄，保持血流量，改善AVF的通畅率，显著延长透析通路使用的时间的目的，且所述采用SMO抑制剂进行预防或治疗的方案具有安全、有效、无副作用的特点。
附图说明
图1是实施例1中高糖刺激HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的转录组测序的分析结果图；其中NG代表正常糖，HG代表高糖。
图2是实施例1中体外HUVEC高糖刺激实验验证Hh信号通路中SMO基因上调的结果图；A是不同糖浓度条件下HUVEC中SMO表达的qRT-PCR分析，B是不同糖浓度条件下HUVEC中SMO表达的蛋白质印迹分析，其中B的上方图是蛋白质印迹代表性图，B的下方图是蛋白质印迹分析结果的定量评估，Man代表渗透压对照组，具体为5.5mM葡萄糖+34.5mM甘露醇；5.5代表5.5mM葡萄糖，即正常糖组；11.1代表11.1mM葡萄糖；25代表25mM葡萄糖；40代表40mM葡萄糖，即高糖组；GAPDH是蛋白质免疫印迹实验中的内参蛋白。
图3是实施例2中SMO基因敲低提高高糖刺激下HUVEC细胞活力、减少其凋亡、促进其增殖的结果图，A是细胞活力结果；B是细胞调亡结果；C是细胞增殖的荧光结果(比例尺：50μm)，D是细胞增殖的定量结果；其中shSMO表示SMO敲低；shCtrl表示对照组，即未进行SMO敲低；HG表示高糖处理；Man为渗透压对照组。
图4是实施例2中SMO基因敲低改善高糖诱导HUVEC的LDH释放、迁移能力及降低其炎症因子表达的结果图；A是LDH测定结果；B是伤口愈合(划痕实验)测定结果，左图代表不同时间点的划痕迁移图(比例尺：25μm)，右图是对划痕迁移分析结果的定量评估；C是对炎症因子TNF-α、MCP-1和IL-6表达的qRT-PCR分析结果；其中HG表示高糖处理；Man为渗透压对照组；shSMO表示SMO敲低；shCtrl表示对照组，即未进行SMO敲低。
图5是实施例3中不同SMO抑制剂对高糖处理的HUVEC的影响结果图，A是SMO表达水平的结果；B是细胞活力结果；C是IL-6表达水平的结果；D是TNF-α表达水平的结果；E是MCP-1表达水平的结果；其中HG表示高糖处理；NG表示正常糖处理；HG+Cyc代表高糖处理下给予Cyclopamine干预；HG+Vis代表高糖处理下给予Vismodegib干预；HG+Gla代表高糖处理下给予Glasdegib干预。
图6是实施例3中SMO抑制剂Cyc改善高糖刺激下内皮细胞活力、LDH释放和细胞凋亡情况的结果图；A是HUVEC的细胞活力结果；B是PEC的细胞活力结果；C是HUVEC的LDH释放结果；D是HUVEC的细胞凋亡结果；E是PEC的的细胞凋亡结果；其中PEC表示原代血管内皮细胞(Primary EC)；HG表示高糖处理；NG表示正常糖处理；Man代表渗透压对照组；HG+Cyc代表高糖处理下给予Cyclopamine干预。
图7是实施例3中Cyc降低高糖诱导的细胞炎症因子表达的结果图；A、B、C分别是HUVEC中IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA表达水平结果；D是炎症因子的蛋白质印迹代表性图；E、F、G分别是IL-6、TNF-α、MCP-1的蛋白质印迹定量结果；其中“-”表示不经Cyc干预，“+”表示经Cyc干预；5.5代表5.5mM葡萄糖，即正常糖组；11.1代表11.1mM葡萄糖；25代表25mM葡萄糖；40代表40mM葡萄糖；GAPDH是蛋白质免疫印迹实验中的内参蛋白。
图8是实施例3中SMO抑制剂Cyc降低高糖刺激下细胞炎症因子的分泌水平的结果图；A、B、C分别是HUVEC中IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌水平结果；其中“-”表示不经Cyc干预，“+”表示经Cyc干预；5.5代表5.5mM葡萄糖，即正常糖组；11.1代表11.1mM葡萄糖；25代表25mM葡萄糖；40代表40mM葡萄糖。
图9是实施例4中Cyc对糖尿病AVF大鼠的体重的影响结果图。
图10是实施例4中Cyc对糖尿病AVF大鼠的血糖水平的影响结果图。
图11是实施例4中大鼠AVF的体外超声检查结果图，A是在0s、15s和30s时AVF吻合口附近的血流超声，B是超声下AVF吻合口附近的血管直径，C是超声下AVF吻合口附近的峰值流速。
图12是实施例4中大鼠AVF吻合血管的苏木精-伊红染色变化结果图，比例尺为50μm。
图13是实施例4中SMO、IL-6、TNF-α、MCP-1和Cleaved caspase-3在大鼠AVF组织中的免疫组织化学特征图。比例尺：50μm。
图14是实施例4中Cyc降低糖尿病AVF大鼠炎症因子的表达结果图；A、B、C分别为血浆中TNF-α、MCP-1和IL-6的水平，第0、1和14周分别代表正常期、糖尿病期和糖尿病AVF时期；D是大鼠血管AVF组织中SMO、TNF-α、MCP-1和IL-6的蛋白质印迹代表图；E、F、G、H分别是IL-6、TNF-α、MCP-1和SMO的蛋白质印迹分析结果的定量评估。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
术语定义
本发明中使用的术语“动静脉内瘘(AVF)”是指一种血管吻合的小手术，将前臂靠近手腕部位的动脉和邻近的静脉作一缝合，使吻合后的静脉中流动着动脉血，形成一个动静脉内瘘，主要用于血液透析治疗，为血液透析治疗提供充足的血液，为透析治疗的充分性提供保障。
本发明中使用的术语“内皮细胞功能障碍”是指内皮细胞功能的各种非适应性改变，对止血、局部血管张力、氧化还原平衡以及急慢性炎症反应有重要影响。
本发明中使用的术语“糖尿病肾病AVF大鼠”是指将SD大鼠建立糖尿病模型后，再进行外科手术干预，对髂动脉和髂静脉进行吻合造瘘成AVF模型。其构建方法详见实施例4。
以下实施例所涉及的实验方法具体如下：
RNA测序(RNA-seq)
将HUVEC接种在6孔板(4×103-1×105)中，分别在不同糖处理条件下培养48小时后，收集各处理组的细胞。用PBS洗涤细胞，然后加入TRIzol。RNA提取、测序文库构建和测序由上海烈冰生物医药科技有限公司进行。使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。使用DESeq包鉴定差异表达基因(DEGs)。差异表达基因的鉴定标准为P<0.01且变化倍数(FoldChange)大于1.5。
荧光定量PCR(qPCR)
首先使用Trizol法从HUVEC中提取总RNA。使用Evo M-MLV RT Premix预混物合成cDNA，用于qPCR。使用基因特异性引物(表1)和
Green Premix Pro Taq HS qPCRKit试剂盒进行荧光定量PCR。使用2-ΔΔCT方法计算相对mRNA表达量。
表1定量实时PCR的引物序列
细胞凋亡检测
将HUVEC接种到6孔板中并用不同浓度的葡萄糖处理。培养48小时后收集细胞，以冷的PBS洗两次，以标记缓冲液(1×)重悬细胞至1×106细胞/mL，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI(碘化丙啶)。将细胞混匀，在室温下避光孵育15分钟左右。每管中另加300μL标记缓冲液，在1h内上样。Annexin-V和PI分别用于标记早期和晚期凋亡细胞。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷酯酰丝氨酸以高亲和力进行特异性结合，是检测早期凋亡细胞的灵敏指标(早期凋亡细胞呈阳性)。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能够透过处于凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染色。
CCK8实验
在96孔板中每孔接种1×104HUVEC，加入不同浓度的糖进行分组处理，5.5mM葡萄糖作为正常糖浓度，Man作为渗透压对照。培养48小时后，向每孔加入10μL CCK8溶液后再在孵箱中培养0.5-4小时。实验原理为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。最后用酶标仪检测在450nm波长处的光吸收值。在一定的范围内，活细胞数与吸收值成正比。实验中，每个实验组设3个以上的复孔，取其平均值。
细胞增殖EdU检测
将HUVEC接种在96孔板中(4×103-1×105细胞/每孔)，分别于正常糖(5.5mM葡萄糖)和高糖(40mM葡萄糖)的条件下培养48小时。然后，根据细胞增殖EdU试剂盒的说明，利用EdU检测细胞新合成的DNA，可结合细胞核标记物(DAPI)进行双重标记，检测细胞增殖，在荧光显微镜下观察结果。
ELISA(酶联免疫吸附)检测-细胞
将HUVEC接种到6孔板中，并用不同浓度的糖处理。在48小时后收集上清液，通过TNF-α、MCP-1和IL-6ELISA试剂盒检测上清液中的炎症细胞因子TNF-α，MCP-1和IL-6的表达，按照试剂盒说明书进行操作。
LDH(乳酸脱氢酶)测定
将HUVEC接种在6孔板(1.0×106个细胞/孔)中，在不同糖条件下处理，孵育48小时后，收集上清液，并使用LDH细胞毒性测定试剂盒分析LDH活性。
SMO基因敲低(质粒构建、慢病毒生产和慢病毒转导)
使用慢病毒系统产生稳定的敲低细胞系。SMO shRNA载体购自广州云舟生物科技公司。所有构建体均通过Sanger测序确认，本研究中使用的shRNA靶向序列详见表2。慢病毒生产：将慢病毒质粒转染到293T细胞中。然后，收集慢病毒上清液，转染48小时后用0.22μM滤器过滤。HUVEC感染慢病毒，感染48小时后，在培养基中加入嘌呤霉素(2μg/mL)，选择阳性感染细胞。
表2 SMO shRNA靶向序列(5'→3')
划痕实验
将HUVEC接种于6孔板中，在高糖(40mM葡萄糖)条件下孵育48小时后。将细胞接种在6孔板中，待生长至覆盖板的底部后，在无血清培养基中饥饿4-6小时后，用100μL无菌微量移液器吸头平行划线，枪头要垂直，不要倾斜。去除旧培养基，用无菌的PBS清洗细胞，去除划下的细胞，补加相应的培养基。分别在0、6、12和24小时，通过倒置显微镜观察细胞迁移情况，并使用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。
超声检查
使用13-24Mhz线性换能器的超高频高分辨率小动物超声成像系统检查髂血管的血流动力学变化。将大鼠用水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉并置于仰卧位。使用剃须器具去除腹股沟区域的毛发，以尽量减少超声衰减。在连续麻醉下，由经验丰富的实验者用超声检查大鼠。使用灰度和多普勒超声测量大鼠髂静脉近端(AVF的静脉侧)的峰值血流速度和血管直径。在测量峰值血流速度时，将多普勒样本量调整为0.5mm，根据血管直径和方向，照射角度保持恒定在小于60°。在髂血管瘘吻合口附近检测血管直径。所有观测数据均测量3次。
HE(苏木精-伊红)和IHC(免疫组织化学)染色
将石蜡包埋的组织切片进行HE染色。将血管组织标本进行脱蜡和再水化，并进行抗原修复，进行IHC染色。组织切片在室温下封闭至少1h，然后与TNF-α、MCP1、IL-6和SMO的抗体在4℃下孵育过夜。仔细清洗后，使用DAB-HRP法检测，在显微镜下进行观察。根据活细胞百分比和染色强度进行定量。
ELISA(酶联免疫吸附)检测-血浆
收集大鼠的外周血样本，分离出血浆。使用ELISA试剂盒(中国江苏酶免实业有限公司)测定血浆中细胞因子(TNF-α、MCP-1和IL-6)的浓度。
Western blot(蛋白质免疫印迹)
实验结束后收集大鼠的AVF组织，将组织进行酶消化，分离出血管内皮细胞，用RIPA和磷酸酶抑制剂混合液进行裂解血管内皮细胞，离心取上清，测定蛋白浓度，制备蛋白样品，进行电泳，260mA，60min分钟转膜。将转膜后的PVDF膜用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液浸泡，室温下，以60rpm的转速封闭1小时，然后TBST缓冲液轻缓清洗3次，每次清洗持续8-10分钟。然后加入对应的一抗稀释液(SMO、Cascpase3、TNF-α、MCP-1和IL-6)，稀释比例根据各抗体的要求而定，4℃环境下摇床孵育过夜；次日用TBST缓冲液清洗3次，每次持续8-10分钟。向PVDF膜加入对应抗物种来源的二抗稀释液，室温孵育1小时后，TBST缓冲液轻缓清洗3次，每次持续8-10分钟。显影：将发光液A液和B液按1:1比例混合，用滤纸轻轻吸干PVDF膜上残余水分，将混合好的发光液均匀滴加在PVDF膜上，于凝胶成像仪上进行蛋白印迹结果分析。
实施例1
细胞水平检测高糖引起血管内皮细胞功能障碍的机制
本发明首先在细胞水平上研究了高糖(HG)刺激细胞因子产生和释放并损害内皮细胞功能的机制研究。本发明将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用40mM葡萄糖处理48小时后对HUVEC进行了RNA测序(RNA-seq)分析。结果表明：HG处理后导致大多数代谢基因和信号通路的基因表达发生广泛变化。值得注意的是，HG诱导SMO、STK36和SHH的表达水平显著升高，它们是Hedgehog(Hh)信号通路中的关键基因。与此结果一致，与对照组(正常糖，NG)相比，KEGG通路富集分析还确定Hh信号通路是高糖处理的HUVEC中高度活化的通路。在Hh信号通路基因中，SMO是高糖处理的HUVEC中上调最高的基因(图1)。
为了验证上述RNA-seq结果，本发明检测了经不同处理的HUVEC中SMO的mRNA表达。与前面结果一致，高糖处理强烈上调SMO的mRNA表达(图2A)。蛋白质印迹分析也证实了HG刺激下在蛋白水平上对SMO的上调(图2B)。综上，实施例1的结果显示：1、高糖处理下HUVEC的Hedgehog(Hh)信号通路高度活化；2、高糖诱导HUVEC的SMO、STK36和SHH的表达水平显著升高，它们是Hh信号通路中的关键基因，其中SMO是上调最高的基因。
实施例2
Hh信号通路导致内皮功能障碍
在实施例1的基础上，本发明继续研究Hh信号通路是否会导致内皮功能障碍。首先构建了SMO敲低的细胞系，并在高糖条件下检查了它们的细胞因子产生、细胞活力、增殖和凋亡情况。结果显示，在高糖条件下，与对照组(未进行SMO敲低的细胞系)相比，SMO的敲除显著增加了HUVEC的活力(图3A)，减少了内皮细胞的凋亡(图3B)，并促进了内皮细胞的增殖(图3C)。此结果表明SMO的敲低可以保护高糖下的内皮细胞免受功能障碍。
为了进一步确定敲低SMO是否可以恢复内皮细胞的功能障碍，本发明检测了高糖处理下敲低SMO的HUVEC的LDH水平。结果正如预期的那样，与对照组相比，敲低SMO后HUVEC的LDH显著降低(图4A)；值得注意的是，敲低SMO后HUVEC的迁移能力也得到了明显恢复(图4B)；而且，敲除SMO还可以显著抑制HUVEC的炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的表达(图4C)。总的来说，这些结果充分表明了Hh信号通路导致内皮细胞功能障碍，靶向SMO可以保护处于高糖状态的内皮细胞，改善其功能障碍。
综上，实施例2的结果显示：1、高糖处理下，HUVEC的Hh信号通路高度活化，导致了内皮细胞功能障碍；2、靶向(敲低)SMO基因可以保护处于高糖状态的内皮细胞，改善其功能障碍(表现为降低LDH、减少细胞凋亡、提高细胞活力、促进细胞增殖、恢复细胞迁移能力、抑制炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的表达)。
实施例3
Hh信号通路SMO抑制剂的筛选及功能验证
本发明对几种SMO抑制剂，包括Cyc(环巴胺，Cyclopamine，购自广州市左克生物科技发展有限公司，MedChemExpress，HY-17024)、Vis(维莫德吉，vismodegib，购自广州市左克生物科技发展有限公司，MedChemExpress，HY-10440)和Gla(格拉吉布，glasdegib，购自广州市左克生物科技发展有限公司，MedChemExpress，HY-16391)进行了筛选，结果发现在用量(10μM)相等的条件下，Cyc在抑制SMO表达、增加高糖处理的HUVEC的细胞活力，以及抑制高糖处理的HUVEC的炎症因子TNF-α、MCP-1和IL-6的表达方面的效果最好(图5)。
为了测试SMO抑制剂是否可以重现敲低SMO基因的效果，本发明首先验证了在HG培养条件下在Cyc(10μM)存在下内皮细胞的细胞活力恢复情况。正如预期的那样，Cyc干预后可以在HG存在的情况下显著恢复HUVEC的细胞活力(图6A)。在体外HG条件下培养的原代血管内皮细胞(Primary EC，PEC)也获得了类似的结果(图6B)。此外，本发明还检测了Cyc干预后HUVEC中LDH的表达水平，发现Cyc干预后可以降低LDH(图6C)。与之相一致地，添加Cyc后显著降低了高糖条件下HUVEC和培养的原代血管内皮细胞的细胞凋亡(图6D-E)。
接下来测试了Cyc是否可以减轻炎性细胞因子的过度产生。结果显示Cyc可以在mRNA和蛋白质水平上抑制IL-6、MCP-1和TNF-α的表达(图7A-G)。
此外，通过ELISA(用10μM Cyc处理HUVEC后，检测细胞培养上清液中炎症因子的相对含量)在Cyc组中检测到TNF-α、MCP-1和IL-6水平降低(图8A-C)。总之，这些结果表明SMO抑制剂可以在体外挽救HUVEC和原代血管内皮细胞的功能，减少其炎性细胞因子的产生。这些数据提示SMO抑制可用作保护高血糖诱导内皮细胞的内皮功能障碍的方法。
综上，实施例3的结果显示：1、SMO抑制剂可保护高血糖诱导的内皮细胞，改善内皮细胞功能障碍(表现为降低LDH表达、减少细胞凋亡、减少炎症细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的产生)；2、与其他SMO抑制剂相比，Cyc在保护高血糖诱导的内皮细胞，改善内皮细胞功能障碍方面效果最好。
实施例4
Cyc对糖尿病AVF大鼠的治疗
(1)建立大鼠糖尿病模型
周龄6-8周的雄性SD大鼠，体重200-250g，购自北京维通利华公司。为了诱发糖尿病，大鼠过夜禁食，将65mg/kg Streptozotocin(STZ)(美国，sigma,S0130-1G)溶解于柠檬酸缓冲溶液(0.1M柠檬酸和0.1M柠檬酸钠)中，单次腹膜内注射于大鼠腹腔中。对照组接受等体积的媒介物-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)。在STZ注射后3天后，通过罗氏血糖仪(中国上海，Roche，LKBIO1500)测量的空腹血糖(FPG)≥300mg/dL的SD大鼠被认为患有糖尿病，并用于后续实验(图10)。
(2)建立大鼠AVF模型(AVF手术)
建立糖尿病模型后，使用SD大鼠进行AVF模型创建。通过腹腔内注射水合氯醛(0.3mL/100g)来麻醉大鼠，并在手术过程中将其放在手术台上。通过沿左侧腹股沟皱襞的3cm切口并通过缩回腹部肌肉组织和其他软组织来暴露髂血管区域。手术在显微镜下进行，髂动脉和静脉脱离周围筋膜和神经。然后，在暴露的远端结扎静脉，并在暴露的近端夹住非创伤性夹子，并在结扎的近端以45°角切割。在形成吻合口的部位，用微型手术刀在静脉中做一个小的纵向切口。用肝素生理盐水冲洗两条血管的管腔，并使用9-0单丝尼龙缝合线对静脉和动脉进行端侧间断缝合。通过吻合口鲜红色动脉血肉眼确认AVF流动。髂静脉近端可触及微弱脉搏。
(3)将大鼠分为Ctrl组、DM组、DM+Cyc组，每组4只，具体如下：
表3
试验期间每周测量大鼠的体重和血糖、于特定时间点(第0、1、14周)提取外周血进行分析，并于实验终点分离AVF组织进行进一步分析。
(4)Cyc对糖尿病AVF大鼠的体重及血糖水平的影响
体重的监测结果显示(图9)：未患糖尿病的大鼠(Ctrl组)体重逐渐增加，而患糖尿病的大鼠(DM组)体重逐渐减轻。与DM组相比，用SMO抑制剂Cyc治疗的糖尿病大鼠(DM+Cyc组)的体重随时间保持稳定。
血糖水平的监测结果显示(图10)：虽然与DM组相比，接受Cyc治疗的糖尿病大鼠(DM+Cyc组)的血糖水平有所降低，但仍与未患糖尿病的大鼠(Ctrl组)的血糖水平差异较大，这表明Cyc对于内皮细胞功能障碍的改善不是通过血糖水平的降低来实现的。
(5)Cyc改善血管的血流峰值流速及内径
为了评估SMO抑制剂是否可以预防或延缓瘘管狭窄，本发明对上述各组大鼠进行了血管彩色多普勒超声检查，以检测血管透析通路AVF的变化(图11A)。与未经治疗的DM组相比，经Cyc治疗的DM+Cyc组大鼠的血流流动较快。本发明还通过超声测量了AVF吻合处的血管直径。本发明的数据显示，与未患糖尿病的大鼠(Ctrl组)相比，未经治疗的糖尿病大鼠(DM组)的血管直径显著减小，表明血管透析通路变窄。有趣的是，与未治疗组相比，接受Cyc治疗的大鼠(DM+Cyc组)瘘管处的血管直径显著增加，甚至高于未患糖尿病的大鼠(Ctrl组)(图11B)，峰值流速观察到类似的趋势(图11C)，这表明Cyc有效地阻止了AVF狭窄的发生，表明Cyc能通过改善血管的血流峰值流速及内径来预防、延缓或阻止AVF狭窄的发生。
(6)Cyc改善糖尿病AVF血管内膜增厚变化并减少炎症细胞因子的产生
为了了解高糖对病变发展的影响，本发明对AVF吻合处的血管组织进行了苏木精-伊红染色。与非糖尿病组大鼠(Ctrl组)相比，糖尿病组大鼠(DM组)的内膜明显增厚，管腔相对狭窄。令人惊讶的是，使用SMO抑制剂Cyc进行干预后，血管内膜得到改善，血管管腔明显扩大(图12)。为了进一步研究Cyc对狭窄预防的影响是否与SMO抑制和内皮细胞功能障碍的减轻有关，本发明对瘘管周围的血管组织进行了免疫组织化学分析。结果表明(图13)，与非糖尿病组(Ctrl组)大鼠相比，糖尿病组(DM组)大鼠的SMO、TNF-α、MCP-1、IL-6和cleavedcaspase 3的表达水平升高，通过Cyc进行干预后，这些蛋白的表达水平受到显著抑制，说明Cyc的干预使减少了炎症细胞因子的产生。
本发明又进一步通过ELISA测量了各组大鼠外周血血浆中炎症因子的水平(图14A-C)，图上第0、1和14周分别代表正常期、糖尿病期和糖尿病AVF时期。正如预期的那样，本发明发现，与非糖尿病组(Ctrl组)大鼠相比，糖尿病组(DM组)大鼠血浆的TNF-α、MCP-1和IL-6显著增加。通过Cyc干预后，这些炎症因子显著减少。此外，本发明对大鼠血管AVF组织中分离得到的血管内皮细胞进行蛋白质免疫印迹实验，同样得到了Cyc干预使SMO、TNF-α、MCP-1和IL-6的表达水平显著降低的结果(图14D-H)。此结果表明，治疗性抑制SMO可以预防狭窄的发生，这可能是由于糖尿病引起的高血糖中内皮细胞产生的炎性细胞因子减少。
综上，实施例4的结果表明，SMO抑制剂Cyc通过提高血管的血流峰值流速，增加血管内径，改善血管内膜增厚变化以及减少炎症细胞因子的产生来改善内皮细胞功能障碍，进而实现了预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的SMO抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.SMO抑制剂在制备预防、延缓或减轻动静脉内瘘通路狭窄的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺；
优选地，所述药物的剂型包括溶液剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂；
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述辅料包括稀释剂、崩解剂、调味剂、粘合剂、赋形剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
3.SMO抑制剂在制备预防或治疗由内皮损伤引起的血管炎的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
5.SMO抑制剂在制备维持或提高血管内的血流速度的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
7.SMO抑制剂在制备增加血管内径的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
9.SMO抑制剂在制备预防或改善血管内膜增厚的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SMO抑制剂包括环巴胺、维莫德吉或格拉吉布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述SMO抑制剂包括环巴胺。
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