CN116043336A - 一种用于构建基因芯片检测的文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于构建基因芯片检测的文库的方法。本发明的方法包括：在待测样本扩增中引入能够进行切除测序接头的酶切位点来构建文库。其中，所述引入能够进行切除测序接头的酶切位点包括在扩增引物的测序接头中引入碱基U。本发明对于需要进行芯片检测的样本，不必须先进行传统的WGA扩增，只需要将文库进行接头切除即可，节省时间成本。

Description

一种用于构建基因芯片检测的文库的方法
技术领域
本发明是关于一种可直接用于基因芯片检测的文库优化方法和应用，可提升文库在基因芯片上检测性能。
背景技术
胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT)是一项辅助生殖技术。PGT分为PGT-A、PGT-M和PGT-SR，其中PGT-A是指非整倍体筛查，可以精准筛选出染色体数量正常的胚胎；PGT-M是筛查单基因疾病，检查其是否带有突变的遗传基因；而PGT-SR是指对染色体结构异常进行筛选。然而对于PGT-M和PGT-SR这类患者群体，在检测出整倍体胚胎后，还需进一步的SNP位点的检测，对其进行连锁分析，进而筛选出完全意义上正常的胚胎。对于PGT-M和PGT-SR这类样本的常用的检测方法为：首先对待检样本进行WGA即全基因组扩增，取部分WGA产物进行文库构建，进行拷贝数变异(CNV)检测筛选出整倍体胚；另取WGA扩增产物进行基因芯片检测或者利用二代测序的方法检测对其SNP位点进行扩增，从而根据检测出的SNP位点进行连锁分析，筛选出真正意义上正常的胚胎样本。
基因芯片，又称DNA微阵列，是一种极具价值的变异检测工具，可应用于科学研究和药物基因组检测、易感基因检测等的常规筛查。基因芯片的检测已具备相对成熟的质控标准，同时价格更便宜、检测周期更短，这让芯片在基因检测市场占有率越来越高。通常来讲，对于大量样本、周期要求高、数据准确或者需具备经济效益的研究或项目，基因芯片检测可择优考虑。
因二代测序原理的缘故，使得市面上现有的文库构建技术中，文库的长度不宜过长，一般文库长度范围为200-500bp左右，在整个文库长度中，测序接头的长度占据了整个文库长度的三分之一到二分之一的范围，这样一来如果直接利用文库样本进行基因芯片检测，文库接头必定会产生大量的无效数据，降低了数据的有效利用率，并且会导致在连锁分析的过程中造成因为有效位点不足而无法进行分析。
发明内容
本发明的一个目的在于一种构建基因芯片检测文库的方法，可提升文库在基因芯片上检测性能。
本发明的另一目的在于提供一种可用于基因芯片检测方法。
本发明的另一目的在于提供用于构建基因芯片检测文库的扩增引物。
本发明的另一目的在于提供用于构建基因芯片检测文库的试剂盒。
一方面，本发明提供了一种用于构建基因芯片检测的文库的方法，该方法包括：
在待测样本扩增中引入能够进行切除测序接头的酶切位点来构建文库。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述引入能够进行切除测序接头的酶切位点包括在扩增引物的测序接头中引入碱基U。
利用本发明可直接对文库样本进行芯片检测，并且能够增加SNP的检出数量和准确性，待测样本无需进行WGA扩增等一系列实验操作，通过本技术能够节省人力物力，并且能够缩短检测周期，一劳永逸。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，扩增引物包括通用引物和Barcode引物，通用引物和Barcode引物各自独立地引入1～7个、优选1～5个、更优选3个碱基U。扩增引物ILMN-UP和Barcode的“U”碱基个数过多会造成扩增效率低，产量过低，达不到检测量的要求，过少则会造成接头切除效率过低。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，通用引物和Barcode引物引入的碱基U数量相同。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，碱基U的引入位置不为3’端的最后一个碱基的位置。扩增引物的“U”碱基位置放在3’端的最后一个碱基的位置会引起扩增效率较低。更优选的距离引物3’端的位置越近越好。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，碱基U的引入位置不能太靠近引物5’端，这样会造成测序接头切除过短，在后续的基因芯片检测过程中SNP的质量得不到改善。优选地，碱基U的引入位置距离5’端位置的距离至少为整条引物序列的三分之一到二分一的长度。优选地，距离引物5’端最近的碱基U前至少有20个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，以illumina测序接头为例，其中扩增中的传统通用引物序列ILMN-UP为SEQ ID No.1，本发明的通用引物的核苷酸序列为在SEQ IDNo.1所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：
SEQ ID No.1：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT 3’。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，Barcode序列以K001为例，传统引物序列为SEQ ID No.2，本发明的Barcode引物的核苷酸序列为在SEQ ID No.2所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：：
SEQ ID No.2：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCT3’。
下划线部分的序列为不可替换序列，为不同Barcode的固定序列部分。
根据本发明的具体实施方案，本发明的构建用于基因芯片检测的文库的方法包括：
待测样本进行细胞裂解；
进行样本预扩增；
进行样本扩增以引入能够进行切除测序接头的酶切位点。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法还包括对扩增后的产物进行接头切除的过程。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，进行接头切除的过程包括：
使用可切除碱基U的酶对接头进行切除，之后使用单链消化酶进行单链消化。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，优选地，可切除碱基U的酶选自USEREnzyme、Uracil DNA glycosylase(UDG)中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，优选地，所述单链消化酶选自Mung BeanNuclease、Msz Exonuclease I中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，进行接头切除的过程包括：
配制含有文库DNA、rCutSmart Buffer10x及可切除碱基U的酶的反应体系；37℃孵育15min，之后60～95℃反应5min，反应结束后立即向PCR管中加入0.5μl单链消化酶(例如Mung Bean Nuclease或Msz Exonuclease I)混匀，整个加样过程请保持在冰盒上，避免在加样过程中DNA双链复性。加样完成后立即在30℃下孵育30min，得到切除接头的样品。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，优选地，切除接头的反应温度为60～85℃，更优选为70℃。
另一方面，本发明还提供了一种基因芯片检测方法，该方法包括：
按照本发明前述方法构建测序文库；
对所构建的文库进行基因芯片检测。
在本发明的一些具体实施方案中，文库构建完成后，取部分文库进行高通量测序(NGS)，另外一部分文库进行文库接头切除。在接头切除过程中使用USER Enzyme对接头进行切除，之后使用Mung Bean Nuclease进行单链消化，其原理为：利用USER Enzyme切除酶切位点碱基与其相邻碱基之间的磷酸骨架(原理见图1)。随后利用温度条件，将酶切位点至DNA 5’端的单链释放出来，并暴露出酶切位点至DNA 5’端的互补链，这时利用Mung BeanNuclease对酶切位点至DNA5’端的互补链进行单链消化(原理见图2)，反应结束后对产物进行回收，此时的产物就是不含有测序接头序列的干净的基因组序列。
在本发明的一些具体实施方案中，在接头切除的操作过程中，因Mung BeanNuclease、Msz Exonuclease I等单链消化酶只能消化单链核酸分子，USER Enzyme切除“U”碱基之后，此时的产物仍旧是双链结构，此时需要一个合适的温度条件将单链核酸释放出来。双链打开温度，既不能太高，也不能太低，过高会导致所有的双链都将打开变成单链，此时单链消化酶将使目的核酸片段同时消化，过低则无法使酶切位点至DNA5’端的双链打开，造成接头切除失败。本发明中温度范围60～95℃，优选的温度范围为60～85℃，更优选使用70℃为最适温度。
另一方面，本发明还提供了一种用于构建基因芯片检测文库的扩增引物，该扩增引物包括通用引物和Barcode引物，其中，通用引物和Barcode引物为前述的本发明的通用引物和Barcode引物。
另一方面，本发明还提供了一种用于构建基因芯片检测文库的试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的扩增引物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还包括可切除碱基U的酶、rCutSmart Buffer10x和/或单链消化酶。优选地，可切除碱基U的酶选自USER Enzyme、Uracil DNA glycosylase(UDG)中的一种或多种。优选地，所述单链消化酶选自Mung BeanNuclease、Msz Exonuclease I中的一种或多种。
综上所述，本发明在扩增中引入能够进行切除测序接头的酶切位点，为后续的基因芯片检测做准备。对于PGT-M和PGT-SR这类样本，可直接进行文库构建，同时实现NGS测序和基因芯片检测，解决了传统方法的痛点。本发明对于需要进行芯片检测的样本，不必再因为文库样本的SNP质量较差，无法达到检测需求而必须先进行传统的WGA扩增，取而代之的是只需要将文库进行接头切除即可，整个接头切除的过程45min即可完成，相较于传统的方法节省了大量了人力物力和时间成本。
附图说明
图1为本发明的进行文库接头切除的原理示意图。
图2为本发明的文库切除接头后对酶切位点至DNA5’端的互补链进行单链消化的原理示意图。
图3为本发明文库接头切除后的电泳图。
图4至图9为本发明具体实施例中样本的芯片数据Call Rate、Heterogeneity_Rate、ADO_Rate、MendelError_Rate、Count_CalledSites以及Count_HeterogenousSites进行展示的结果分析图。
图10为对实施例1到实施例5中的样本的基因芯片数据进行连锁分析的结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
文库构建方法见表1。
表1
Figure BDA0004021033140000051
Figure BDA0004021033140000061
接头切除方法见表2。
表2
试剂 50μL RNX FINAL CONC
文库DNA μl 投入文库总量350ng
rCutSmart Buffer10x 5μl 1X
USER Enzyme 0.5μl 0.5units
Nuclear-free Water to 50μl —
表2中的所有试剂均购自NEB。表2中的试剂配置完成后，进行如下反应：37℃孵育15min，70℃反应5min，反应结束后立即向PCR管中加入0.5μl Mung Bean Nuclease轻柔混匀，随后在30℃下孵育30min。
实施例1
通用引物ILMN-UP与Barcode引物中分别含有酶切位点的个数为1个。
ILMN-UP引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGAUCT 3’(SEQID No.3)。
Barcode引物序列为
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGAUCT3’(SEQ ID No.4)。
实施例2
通用引物ILMN-UP与Barcode引物中分别含有酶切位点的个数为2个。
ILMN-UP引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTUC CGAUCT 3’(SEQID No.5)。
Barcode引物序列为
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTUCCGAUCT3’(SEQ ID No.6)。
实施例3
通用引物ILMN-UP与Barcode引物中分别含有酶切位点的个数为3个。
ILMN-UP引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCUCTUC CGAUCT 3’(SEQID No.7)。
Barcode引物序列为
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCUCTUCCGAUCT3’(SEQ ID No.8)。
实施例4
通用引物ILMN-UP与Barcode引物中分别含有酶切位点的个数为5个。
ILMN-UP引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTUCCCUACACGACGCUCTU CCGAUCT 3’(SEQID No.9)。
Barcode引物序列为
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGUG UGCUCTUCCGAUCT3’(SEQ ID No.10)。
实施例5
通用引物ILMN-UP与Barcode引物中分别含有酶切位点的个数为7个。
ILMN-UP引物序列为：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCUACACUCTTUCCCUACACGACGCUCTU CCGAUCT 3’(SEQID No.11)。
Barcode引物序列为
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACUGGAGTUCAGACGUG UGCUCTUCCGAUCT3’(SEQ ID No.12)。
实施例3中的文库构建完成后进行接头切除实验后的电泳图见图3。
图3中，泳道1为文库接头切除后的电泳图。泳道2为对照样本，即完整的文库条带大小。从电泳条带中可以看到，泳道1的条带大小对比泳道2中的条带大小弥散呈下降趋势，电泳条带大小的变化说明测序接头已经被切除。
Illumina Asian Screening Array基因芯片检测结果分析
对实施例3中的5个样本的Illumina Asian Screening Array基因芯片数据CallRate、Heterogeneity_Rate、ADO_Rate、MendelError_Rate、Count_CalledSites以及Count_HeterogenousSites进行展示，其中EXAMPLE1为实施例3中的5个样本结果，Con为对照样本，即完整文库直接进行基因芯片测试的样本，分别见图4到图9，具体数据明细见表3。
表3
Figure BDA0004021033140000081
从图4至图9的结果中可以看出，在把文库接头进行切除后进行芯片检测，CallRate得到了大约5％的提升、Heterogeneity_Rate提高了40.46％，ADO_Rate和MendelError_Rate分别都得到了10倍以上效果的提升、Count_CalledSites以及Count_HeterogenousSites等位点数也得到了明显的提升。
对实施例1到实施例5中的样本的基因芯片数据进行连锁分析结果展示，见图10，其中实施例1到实施例5中的五个样本分别为220823_Test1、220823_Test2、220823_Test3、220823_Test4、220823_Test5，对照样本为220823_Con1、220823_Con2、220823_Con3，即没有进行本技术处理的3个对照样本。
从连锁分析的结果中可以看出，220823_Con1、220823_Con2、220823_Con3在连锁分析过程较本发明的5个实施例样本均有不同程度的位点缺失或者扩增失败的SNP位点，再次证明本发明的方法在芯片检测上的明显优势。

Claims (16)

1.一种用于构建基因芯片检测的文库的方法，该方法包括：
在待测样本扩增中引入能够进行切除测序接头的酶切位点来构建文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引入能够进行切除测序接头的酶切位点包括在扩增引物的测序接头中引入碱基U。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，扩增引物包括通用引物和Barcode引物，通用引物和Barcode引物各自独立地引入1～7个、优选1～5个、更优选3个碱基U；
优选地，通用引物和Barcode引物引入的碱基U数量相同。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，碱基U的引入位置不为3’端的最后一个碱基的位置，距离5’端位置的距离至少为整条引物序列的三分之一到二分一的长度；
优选地，距离引物5’端最近的碱基U前至少有20个碱基。
5.根据权利要求3或4任一项所述的方法，其中：
通用引物的核苷酸序列为在SEQ ID No.1所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：
SEQ ID No.1：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT 3’；
Barcode引物的核苷酸序列为在SEQ ID No.2所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：
SEQ ID No.2：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCT3’。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，该方法包括：
待测样本进行细胞裂解；
进行样本预扩增；
进行样本扩增以引入能够进行切除测序接头的酶切位点。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，该方法还包括对扩增后的产物进行接头切除的过程。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，进行接头切除的过程包括：
使用可切除碱基U的酶对接头进行切除，之后使用单链消化酶进行单链消化；
优选地，可切除碱基U的酶选自USER Enzyme、Uracil DNA glycosylase(UDG)中的一种或多种；
优选地，所述单链消化酶选自Mung Bean Nuclease、Msz Exonuclease I中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，进行接头切除的过程包括：
配制含有文库DNA、rCutSmart Buffer10x及可切除碱基U的酶的反应体系；37℃孵育15min，之后60～95℃反应5min，反应结束后立即向PCR管中加入0.5μl单链消化酶混匀，随后在30℃下孵育30min，即可得到切除接头的样品；
优选地，切除接头的反应温度为60～85℃，更优选为70℃。
10.一种基因芯片检测方法，该方法包括：
按照权利要求1-8任一项所述的方法构建测序文库；
对所构建的文库进行基因芯片检测。
11.一种用于构建基因芯片检测文库的扩增引物，该扩增引物包括通用引物和Barcode引物，其中，通用引物和Barcode引物各自独立地引入1～7个、优选1～5个、更优选3个碱基U。
12.根据权利要求11所述的扩增引物，其中，通用引物和Barcode引物引入的碱基U数量相同。
13.根据权利要求11或12所述的扩增引物，其中，碱基U的引入位置不为3’端的最后一个碱基的位置，距离5’端位置的距离至少为整条引物序列的三分之一到二分一的长度；
优选地，距离引物5’端最近的碱基U前至少有20个碱基。
14.根据权利要求12或13所述的扩增引物，其中：
通用引物的核苷酸序列为在SEQ ID No.1所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：
SEQ ID No.1：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT 3’；
Barcode引物的核苷酸序列为在SEQ ID No.2所示序列的基础上至少1～7个T替换为U：
SEQ ID No.2：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCT3’。
15.一种用于构建基因芯片检测文库的试剂盒，该试剂盒包括权利要求11-14任一项所述的扩增引物。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，该试剂盒还包括可切除碱基U的酶、rCutSmartBuffer10x和/或单链消化酶；
优选地，可切除碱基U的酶选自USER Enzyme、Uracil DNA glycosylase(UDG)中的一种或多种；
优选地，所述单链消化酶选自Mung Bean Nuclease、Msz Exonuclease I中的一种或多种。
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