CN116042823B - 用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用 - Google Patents

用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用。本发明中，首次披露了新型食管鳞癌预后和免疫治疗适用性预测的标志物，所述标志物选自PLEK2，IFI6和COL19A1。本发明的分子标志物具有理想的敏感性，可以用于免疫联合化疗的治疗方案的疗效评估和预后评估。本发明也提供了适于食管鳞癌预后和免疫治疗适用性预测的试剂盒。本发明为临床上食管鳞癌的诊断和治疗提供了新方案。

Description

用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，更具体地，本发明涉及用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用。
背景技术
食管鳞状细胞癌(食管鳞癌，ESCC)是指发生于食道，病理类型为鳞状细胞癌的恶性肿瘤。食管鳞状细胞癌是食管癌的主要形式，属于消化系统常见的恶性肿瘤之一，约占东亚地区食管癌患者的90％。尽管在早期诊断和综合治疗方面作出了巨大的努力和取得了显著的成就，但食管鳞癌的高发病率和死亡率仍然是一个严重的医学问题。
对于食管鳞癌的治疗，临床实践中，早期病例还是采取根治性手术切除或根治性的放射治疗；对于上中段的食管鳞癌患者，一般采取根治性的放射治疗；对于下段的早期食管鳞癌患者，则采取根治性的手术治疗，对于局晚期的食管鳞癌患者，采取化疗、放射治疗为主的综合治疗。
食管鳞状细胞癌后早期是没有典型症状的，具有隐蔽性；局晚期会出现食物反流、咽东西困难疼痛或呕血等症状。进行早期诊断的研究是必要的，然而此类诊断因疾病本身缺乏典型症状以及缺乏有效的诊断标志物，仍有较大的难度。
对于局部晚期食管鳞癌，手术后的新辅助放/化疗已被证明比单纯手术获得更有利的长期生存。新辅助化疗加免疫检查点抑制剂治疗局部晚期患者的临床疗效显著，主要病理缓解(MPR)率约为50.0％，病理完全缓解(CPR)率约为30％。然而，治疗结果仍存在差异。对于本质上对免疫治疗有耐药性的患者，这种方案可能会延迟患者的病情，错过根治性手术的机会，最终导致预后更差。
因此，研究食管鳞状的预后免疫治疗耐药及敏感分子标记物，在临床上愈加紧迫。需要在食管鳞癌免疫治疗及预后评估中建立检测更为方便，且能够预测患者预后及免疫治疗疗效的分子标志物或标志物组合，从而为食管鳞癌患者的诊断和治疗提供临床指导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于食管鳞癌预后及疗法疗效评估的分子标记物及其应用。
在本发明的第一方面，提供分子标记物在制备用于食管鳞癌的检测(如诊断)或预后的检测系统中的应用；所述分子标记物选自COL19A1、PLEK2、IFI6或其组合；所述检测系统包括检测试剂、试剂盒或检测装置。
在一种或多种实施方式中，所述检测或预后包括：根据分子标记物的表达：
(a)分析(评估)食管鳞癌患者的对于免疫联合化疗的敏感性(适用性)；较佳地还包括：制定治疗/用药方案；较佳地，所述免疫联合化疗为新辅助免疫联合化疗；
(b)分析(评估)食管鳞癌患者的主要病理缓解情况，和/或生存期；或
(c)进行食管鳞癌患者的食管鳞癌发展的风险分析(评估)或评分。
在一种或多种实施方式中，根据COL19A1的表达，若COL19A1表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者适合以免疫联合化疗作为治疗方案(或能从免疫联合化疗得到相对多的获益)，预后好(相对好)，生存期长(相对长)；若COL19A1表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者不适合以免疫联合化疗作为治疗方案(或能从免疫联合化疗得到相对少的获益)，预后差(相对差)，生存期短(相对短)。
在一种或多种实施方式中，根据PLEK2和/或IFI6的表达，若PLEK2和/或IFI6表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者预后好(相对好)，生存期长(相对长)；若PLEK2和/或IFI6表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者不适合以免疫联合化疗作为治疗方案，预后差(相对差)，生存期短(相对短)。
在一种或多种实施方式中，所述分子标志物包括基因水平的COL19A1、PLEK2或IFI6的转录本(mRNA)，gDNA，cDNA，DNA/RNA杂合体，或它们的片段；所述片段是特异性的，其足以将COL19A1、PLEK2或IFI6基因与其它分子进行区分。
在一种或多种实施方式中，所述分子标志物包括蛋白水平的COL19A1蛋白、PLEK2蛋白、IFI6蛋白，或它们的片段；所述片段是特异性的，其足以将COL19A1蛋白、PLEK2蛋白或IFI6蛋白与其它分子进行区分。
在一种或多种实施方式中，所述食管鳞癌为局部晚期(局晚期)的癌症。
在一种或多种实施方式中，食管鳞癌局部晚期为按照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和国际抗癌联盟(Union forInternational Cancer Control,UICC)建立的国际标准TNM分期体系的最新版(第8版)分期，第II-III期的癌症。
在一种或多种实施方式中，所述分子标记物独立地选自COL19A1、PLEK2或IFI6。
在一种或多种实施方式中，所述分子标记物为选自COL19A1、PLEK2或IFI6的任意两种。
在一种或多种实施方式中，所述分子标记物选自：PLEK2和IFI6，COL19A1和PLEK2，COL19A1和IFI6。
在一种或多种实施方式中，所述分子标记物为COL19A1、PLEK2和IFI6。
在一种或多种实施方式中，所述的“高(水平)表达”、“表达(水平)高”或“表达(水平)显著高”或类似的术语，是指为统计学意义上的基因/的“高表达”，例如，“高表达COL19A1的食管鳞癌”与“食管鳞癌”总人群(或统计学意义上足够量的人群)的平均COL19A1的表达相比，显著高5％、10％或20％以上，较佳地高30％或50％以上，更佳地高80％或100％以上。
在一种或多种实施方式中，所述的“低(水平)表达”、“表达(水平)低”或“表达(水平)显著低”或类似的术语，是指为统计学意义上的基因/的“低表达”，例如，“低表达PLEK2或COL19A1的食管鳞癌”与“食管鳞癌”总人群(或统计学意义上足够量的人群)的平均PLEK2或COL19A1的表达相比，显著低5％、10％或20％以上，较佳地低30％以上或50％以上，更佳地低80％或100％以上。
在一种或多种实施方式中，所述的“生存期长”或“预后好”是指统计学意义上的患者的生存期的延长或生存质量的改善，如与“食管鳞癌”总人群(或统计学意义上足够量的人群)的平均“生存期”相比，“生存期长”或“预后好”的患者的生存期显著延长5％以上、10％以上或20％以上，较佳地延长30％以上，更佳地延长50％以上。
在一种或多种实施方式中，所述的“生存期短”或“预后差”是指统计学意义上的患者的生存期减少或生存质量的降低，所述的“生存期长”或“预后好”是指统计学意义上的患者的生存期的延长或生存质量的改善，如与“食管鳞癌”总人群(或统计学意义上足够量的人群)的平均“生存期”相比，“生存期短”或“预后好差”的患者的生存期显著减少5％以上、10％以上、20％以上、30％以上，或50％以上。
在一种或多种实施方式中，所述的免疫联合化疗包括：以(a)化疗剂方案，及(b)免疫检查点抑制剂联合治疗。较佳地，该免疫联合化疗用于局部晚期食管鳞癌。
在一种或多种实施方式中，所述的化疗剂提供抗癌治疗效果的化学治疗剂或化疗活性剂，如小分子化合物药剂。
在一种或多种实施方式中，所述的化疗剂为能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂。
在一种或多种实施方式中，所述的化疗活性剂是具有抗癌药剂的作用(化学毒性或化学抑制性)的，抑制或阻止恶性细胞形成、成熟或增殖的药剂。
在一种或多种实施方式中，化疗方案或化疗剂包括(但不限于)：氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、顺铂(cis-platinum)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)等。
在一种或多种实施方式中，免疫检查点抑制剂包括(但不限于)：抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体。
在一种或多种实施方式中，免疫检查点抑制剂包括(但不限于)：特瑞普利单抗，信迪利单抗，卡瑞利珠单抗，替雷利珠单抗，赛帕利单抗，派安普利单抗，斯鲁利单抗，纳武利尤单抗，帕博利珠单抗，度伐利尤单抗，阿替利珠单抗等。
在一种或多种实施方式中，所述检测试剂包括(但不限于)：免疫检测试剂、PCR检测试剂、测序试剂、原位杂交试剂、Western Blolt试剂、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂；更佳地，所述检测试剂包括(但不限于)：特异性结合所述分子标记物编码的蛋白的抗体、特异性扩增所述分子标记物基因的引物、特异性识别分子标记物基因的探针。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中包括所述的检测试剂。
在一种或多种实施方式中，所述检测装置包括(但不限于)：免疫组化装置、基因测序仪器、芯片、探针组(模块)、引物探针组(模块)或电泳装置。
在本发明的另一方面，提供一种用于食管鳞癌的检测或预后的试剂盒或检测装置，其中包括用于食管鳞癌的检测或预后的检测试剂，包括(但不限于)：针对分子标记物的检测试剂，所述分子标记物选自COL19A1、PLEK2、IFI6或其组合。
在本发明的另一方面，提供一种用于食管鳞癌的检测或预后的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；
所述检测单元包括：测定分子标记物的表达水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置；所述分子标记物选自COL19A1、PLEK2、IFI6或其组合；
所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果(所测得的分子标记物的表达水平)进行分析处理的处理单元，获得食管鳞癌的检测或预后结果。
在一种或多种实施方式中，所述检测试剂包括(但不限于)：免疫检测试剂、PCR检测试剂、测序试剂、原位杂交试剂、Western Blolt试剂、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂；更佳地，所述检测试剂包括(但不限于)：特异性结合所述分子标记物编码的蛋白的抗体、特异性扩增所述分子标记物基因的引物、特异性识别分子标记物基因的探针。
在一种或多种实施方式中，所述检测装置包括(但不限于)：免疫组化装置、基因测序仪器、芯片、探针组(模块)、引物探针组(模块)或电泳装置。
在本发明的另一方面，提供一种食管鳞癌的检测或预后的方法，所述方法包括：利用特异性检测分子标记物的检测系统进行针对分子标记物的检测；所述分子标记物选自COL19A1、PLEK2、IFI6或其组合；所述检测系统包括检测试剂、试剂盒或检测装置。
在一种或多种实施方式中，所述方法包括：根据分子标记物的表达：(a)分析(评估)食管鳞癌患者的对于免疫联合化疗的敏感性(适用性)；较佳地还包括：制定治疗/用药方案；较佳地，所述免疫联合化疗为新辅助免疫联合化疗；(b)分析(评估)食管鳞癌患者的主要病理缓解情况，和/或生存期；或，(c)进行食管鳞癌患者的食管鳞癌发展的风险分析(评估)或评分。
在一种或多种实施方式中，所述方法包括：根据COL19A1的表达，若COL19A1表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者适合以免疫联合化疗作为治疗方案(或能从免疫联合化疗得到相对多的获益)，预后好(相对好)，生存期长(相对长)；若COL19A1表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者不适合以免疫联合化疗作为治疗方案(或能从免疫联合化疗得到相对少的获益)，预后差(相对差)，生存期短(相对短)；和/或，根据PLEK2和/或IFI6的表达，若PLEK2和/或IFI6表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者预后好(相对好)，生存期长(相对长)；若PLEK2和/或IFI6表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者不适合以免疫联合化疗作为治疗方案，预后差(相对差)，生存期短(相对短)。
在一种或多种实施方式中，所述的食管鳞癌的检测或预后的方法包括：辅助性的疾病分析方法，其不以获得疾病的诊断结果为直接目的、而仅提供辅助性分析/评估/评分。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、显示临床特征热图。
图2、显示一致性聚类的累积分布函数(CDF)曲线下面积，k为1～10；k＝4时66个样本的一致聚类矩阵。
图3、显示在回顾性队列中四种亚型在未接受辅助治疗的ESCC患者的总体生存预后和生存曲线。
图4、显示C1-C4亚型的基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分和肿瘤纯度的热图。
图5、显示主要病理学缓解者的差异基因表达分析(C2 Vs Non-C2)。
图6、显示单因素logistic回归分析，鉴定出9个预后相关基因。
图7、森林图显示9个基因与主要病理学缓解之间的关联。
图8、显示主要病理反应者的差异基因表达分析(C3 Vs Non-C3)。
图9、显示单因素COX回归分析，鉴定出6个预后相关基因。
图10、森林图显示6个基因与主要病理学缓解之间的关联。
图11、显示回顾性队列中PLEK2和IFI6的表达分层后的Kaplan-Meier分析。
图12、显示回顾性队列中PLEK2及IFI6的免疫组化结果。
图13、回顾性队列中3组(PLEK2high和IFI6high表达组，PLEK2high和IFI6low表达组/PLEK2low和IFI6high表达组，PLEK2low和IFI6low表达组)分层的无复发生存的Kaplan-Meier生存分析。
图14、显示回顾性队列中，3组(PLEK2high和IFI6high表达组、PLEK2high和IFI6low表达组/PLEK2low和IFI6high表达组，PLEK2low和IFI6low表达组)分层的生存及死亡率堆叠图。
图15、显示回顾性队列中，COL19A1的表达分层的总生存的Kaplan-Meier生存分析。
图16、显示回顾性队列中，COL19A1的免疫组化结果。
图17、显示前瞻性队列中，不同PLEK2表达组中非MPR和MPR患者分布的堆叠图。
图18、显示前瞻性队列中，不同IFI6表达组中非MPR和MPR患者分布的堆叠图。
图19、显示前瞻性队列中，PLEK2及IFI6的免疫组化结果。
图20、显示PLEK2及IFI6基因的AUC值的棒棒糖图。
图21、显示28个免疫细胞中PLEK2和IFI6基因与免疫细胞基因特征相关性的相关性热图(前瞻性队列)。
图22、显示37个样本中，非MPR组和MPR组28个免疫细胞的比例(箱线图)。
图23、显示间质型非MPR及MPR患者中：H&E，免疫组化和多重免疫荧光染色结果。
图24、显示前瞻性队列中COL19A1的免疫组化结果。
图25、显示COL19A1基因的AUC值的棒棒糖图。
图26、显示28个免疫细胞中COL19A1基因与免疫细胞基因特征相关性的相关性热图(A)及COL19A1高表达组和低表达组中的29种免疫相关签名的不同分布(B)(回顾性队列)。
图27、显示28个免疫细胞中COL19A1基因与免疫细胞基因特征相关性的相关性热(前瞻性队列)。
图28、显示免疫亚型非MPR及MPR患者中：H&E，免疫组化和多重免疫荧光染色结果。
具体实施方式
针对现有技术中缺乏食管鳞癌预后和免疫治疗适用性的不足，本发明人经过大量的分析、研究和筛选，首次披露食管鳞癌预后和免疫治疗适用性预测的标志物，所述标志物选自PLEK2，IFI6和COL19A1。本发明的分子标志物具有理想的敏感性，可以用于免疫联合化疗的治疗方案的疗效评估和预后评估。在此基础上，本发明也提供了适于食管鳞癌预后和免疫治疗适用性预测的试剂盒。本发明为临床上食管鳞癌的诊断和治疗提供了新方案。
如本发明所用，“分子标记物(标志物)”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。术语“标记物(标志物)”、“分子标记物(标志物)”或“生物标记物(标志物)”在整个发明公开中可互换使用。本发明中，除非另外说明，所述“分子标记物”是指“癌症(肿瘤)标志物”。本发明中，除非另外说明，所述癌症为食管鳞癌。
如本发明所用，所述的“检测”包括“评估”、“测定”、“分析”、“预测”、“评价”；所述的“评价”或“评估”也包括“评分”。
如本发明所用，所述“患者”、“受试者”或“个体”可以指生物体，在某些方面，受试者可以是人。提供样品的受试者可以包括潜在疾病风险的人群或确诊为疾病的人群。本发明中所述疾病指食管鳞癌。
如本发明所用，所述的“免疫联合化疗的敏感性”是指个体对免疫联合化疗的反应情况；一般而言，“免疫联合化疗的敏感性”高的人，其更适合于免疫联合化疗的疗法，从中获得更多的受益。就“免疫联合化疗的敏感性”高的人，临床医师可以给予进行免疫联合化疗的治疗建议。
如本发明所用，所述的“样本”与“样品”可互换使用，其包括从个体或分离的组织、细胞或体液中获得的、适合于进行肿瘤标志物检测的物质。在本发明的具体实施方案中，所述样本组织包括FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedding)，通常指人的或者动植物组织样本利用福尔马林固定、石蜡包埋形成的石蜡切片或者石蜡块样本。
如本发明所用，所述的“反应/获益”在本发明的语境中指示患有食管鳞癌受试者/患者显示对包含免疫联合化疗的治疗方案的反应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用预测接受治疗的患者是否显示反应。例如，反应可以反映为来自食管鳞癌患者的痛苦减轻，诸如肿瘤生长降低和/或停止、肿瘤的尺寸缩小和/或癌症的一种或多种症状改善。
如本发明所用，所述的“表达水平”可以指样品中本发明的标志物/指示物的基因/蛋白的浓度或量。在一些方式中，所述的“表达水平”可以指特定的mRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即mRNA在一个或多个被分析组织中的浓度。
如本发明所用，术语“高表达”、“表达水平高”等相互可以交换，并且在应用含义上应当意指与“对照”或“阈值”相比较，至少有5％、10％或20％，较佳地至少有30％或50％，更佳地至少有80％或100％或更为显著的提高。例如，可对至少存在一个表达强度超过阈值的基因重复用Student’s T-test进行检测，以确定显著性。
如本发明所用，术语“低表达”、“表达水平低”等相互可以交换，并且在应用含义上应当意指与“对照”或“阈值”相比较，至少有5％、10％或20％，较佳地至少有30％或50％，更佳地至少有80％或100％或更为显著的降低。例如，可对至少存在一个表达强度低于阈值的基因重复用Student’s T-test进行检测，以确定显著性。
如本发明所用，基因或蛋白表达的“对照”或“阈值”的设定是本领域技术人员在本发明的主旨的基础上易于设定的。选择合适的“对照”或“阈值”是实验设计的例行部分，例如可首先基于预后/疗法疗效已明确的受试者(患者)的样本进行相应基因/蛋白的表达水平进行具有统计学意义的分析，将所获得的表达值作为“对照”或“阈值”。
如本发明所用，所述的“试剂盒”可以指用于实施本发明公开的方法的材料或试剂的系统。
如本发明所用，对于癌症分期的界定，可以以本领域已有的界定标准进行。
如本发明所用，“/”可表示“和”，也可表示“或”。
本发明中，通过对食管鳞癌临床患者的样本进行深入的分析，鉴定与食管鳞癌进展相关的模块，并进一步筛选获得核心基因：COL19A1、IFI6和/或PLEK2。所述COL19A1与食管鳞癌的发生发展密切相关；所述IFI6或PLEK2与细胞凋亡和侵袭密切相关。它们作为分子标志物的联合应用，对于疾病的预后以及疗法疗效的评估更有意义。
基于本发明的新发现，揭示了食管鳞癌具有诊断意义的一组标志物：COL19A1、IFI6和/或PLEK2基因。本发明也揭示了食管鳞癌的预后及疗法疗效评估的标志物、试剂盒及方法。
所述的COL19A1基因的序列信息可参考GenBank登录号NM_001858，Ensembl号：ENSG00000082293，DNA序列地址：Homo sapiens chromosome 6,GRCh38.p14 PrimaryAssembly-Nucleotide-NCBI(nih.gov)，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
所述的IFI6基因的序列信息可参考GenBank登录号NM_002038、NM_022872、NM_022873；Ensembl号：ENSG00000126709；DNA序列地址：Homo sapiens chromosome 1,GRCh38.p14 Primary Assembly-Nucleotide-NCBI(nih.gov)，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
所述的PLEK2基因的序列信息可参考GenBank登录号NM_016445；Ensembl号：ENSG00000100558；DNA序列地址：Homo sapiens chromosome 14,GRCh38.p14 PrimaryAssembly-Nucleotide-NCBI(nih.gov)，本发明也可以涵盖其在生物体中的序列变体。
可以利用本发明披露的上述分子标志物，来作为评估食管鳞癌的发展及疗法疗效的判断标志(标志物)。从而可用于了解患病个体处于怎样的疾病状态，评价或预测预后疾病风险、预测免疫治疗适用性、制定治疗/用药方案。
作为一种方式，应用所述的分子标记物预测食管鳞癌的方法包括：(1)检测食管鳞癌患者样本中COL19A1、PLEK2和/或IFI6的表达水平；(2)基于(1)所得的表达水平：当PLEK2高表达时，提示该食管鳞癌患者预后不良，生存期短；当IFI6高表达时，提示该食管鳞癌患者预后不良，生存期短；当COL19A1高表达时，提示该食管鳞癌患者预后好，生存期长。
作为另一种方式，应用所述的分子标记物预测食管鳞癌的方法包括：(1)检测食管鳞癌患者样本中PLEK2，IFI6和COL19A1的表达水平；(2)基于(1)所得的表达水平，当PLEK2高表达时，提示该食管鳞癌患者不适用于新辅助免疫联合化疗；当IFI6高表达时，提示该食管鳞癌患者不适用于新辅助免疫联合化疗；当COL19A1高表达时，提示该食管鳞癌患者适用于新辅助免疫联合化疗。
本发明中，所述的免疫联合化疗是指免疫疗法与化学疗法相组合的食管鳞癌的治疗方法。
本发明中，化疗加免疫检查点抑制剂的治疗方案中，化疗剂包括能提供抗癌治疗效果的任何活性剂，而且可以是化学药剂或生物学药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂。优选的活性剂是那些起抗瘤(化学毒性或化学抑制性)药剂的作用的，其抑制或阻止恶性细胞形成、成熟或增殖。化疗方案或化疗剂的非限制性例子包括氟尿嘧啶(Fluorouracil)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cis-Platinum)、多西他赛(Docetaxel)、紫杉醇(Paclitaxel)等。应理解，本发明的实施例中非穷举地列举了若干种临床常用的化疗药物，而本发明的整体技术方案不仅限于此。
本发明中，化疗加免疫检查点抑制剂的治疗方案中，所述免疫检查点抑制剂可以应用本领域已知的免疫检查点抑制剂。本领域已知，免疫检查点分子(Immune CheeckPoint)是免疫系统中起抑制作用的调节分子，其对于维持自身耐受、防止自身免疫反应、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化等起着重要作用；免疫检查点分子表达于免疫细胞上，将抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，肿瘤形成免疫逃逸。本发明中，免疫检查点抑制剂为针对相应的免疫检查点的抑制药物，例如单抗类药物(抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体)，其通过阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。
本发明所述分子标记物的表达水平的测定可根据本领域熟知的已建立的标准程序(reference)。所述的测定可以在RNA水平进行，或者在RNA逆转录后检测cDNA水平，例如通过实时荧光定量PCR技术。在蛋白水平，例如通过免疫组化技术，ELISA。
作为一种可选的方式，根据所述分子标记物的蛋白质，可以利用特异性结合该蛋白质的抗体来实现检测，这可以针对临床样本、通过免疫组化染色来实施。常用免疫组化方法包括但不限于免疫荧光法、免疫酶标法、免疫胶体金法等。免疫荧光法利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察；当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。免疫酶标法中，以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫胶体金法中，以胶体金(金的水溶胶)这一特殊的金属颗粒作为标记物，胶体金能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响；用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子等作为探针，能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位、定量研究。
作为一种可选的方式，根据所述分子标记物的序列，可以设计特异性扩增它们的引物，来进行检测。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。针对一种分子标记物，一或多对引物的设置是可行的，多对引物的设置可以获得多组扩增产物，可能更有利于对结果的确证。
作为一种可选的方式，根据所述分子标记物的序列，可设计出适合的探针，固定在微阵列(microarray)或基因芯片上。所述的基因芯片一般包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针由连续核苷酸组成。为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，杂交相关位点最好位于所在探针的中部。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。所述探针还可以在其5’端包含一段氨基修饰的1-30聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。所述的基因芯片上包含针对至少一种针对本发明所述分子标记物的探针；更优选的，所述的基因芯片上包含针对两种或两种以上针对所述分子标记物的探针；最优选的，在一张或多张基因芯片上包含针对所有本发明所述的分子标记物的探针。针对一种分子标记物，一或多条探针的设置是可行的，多条探针的设置可能更有利于对结果的确证。
作为一种可选的方式，可以利用引物结合探针的方法，从而在定性和定量检测上更为灵敏快捷。例如，可采用Taqman实时荧光PCR检测技术：在PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的标记有荧光素的Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct(cycle threshold，Ct)值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，也即Ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析。
用PCR方法扩增基因特定片段的方法已经是本领域公知技术，本发明中没有特别的限制。对扩增产物进行标记可以通过采用5’端带标记基团的引物进行扩增的方法，也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法，或通过在杂交时加入与扩增产物特异性结合的检测探针的方法实现，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。
本发明还提供一种用于检测的试剂盒，所述试剂盒可包括用于存储、运输反应试剂或装置(例如在适当容器中的引物、探针等)和/或配合材料(例如：缓冲液、执行评估的书面说明等)或将其从一个位置递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可包括一个或多个包含相关反应试剂和/或配合材料的外壳(例如：盒子)。这些内容物可以同时或单独地投递给预期的接收者。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件等。
本发明也提供了一种用于评估食管鳞癌的发展及疗法疗效的系统，其包括检测单元以及数据分析单元；所述检测单元包括：测定所述分子标记物的表达水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置的试剂或装置；所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，获得食管鳞癌的检测或预后结果。所述检测试剂包括(但不限于)：特异性结合所述分子标记物编码的蛋白的抗体、特异性扩增所述分子标记物基因的引物、特异性识别分子标记物基因的探针等。特异性用于检测的装置可包括，但不限于：免疫组化装置(如ELISA检测试剂盒/模块/装置)、基因测序仪器、芯片、探针组(模块)、引物探针组(模块)或电泳装置等。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明首次通过生物信息学的技术找到与食管鳞癌预后相关标志物：PLEK2，IFI6和COL19A1；通过该基因的表达能预测食管鳞癌新辅助免疫联合化疗的适用性；
2)本发明首次提出由3个基因作为分子标记物构成的预测食管鳞癌患者的预后模式。
3)本发明为分析食管鳞癌患者的预后以及新辅助免疫联合化疗提供了可靠的方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中所涉及Affy软件包、Input R软件包、Limma软件包、WGCNA R软件包、Sva R软件包、Rms R软件包、Survcomp软件包、Consensus Cluster Profiler R软件包、Deseq2 R软件包、GSVA R软件包、Clusterprofiler R软件包、Ggplot2 R软件包、Proc R软件包、和Survival软件包均为现有技术，来源于https://cran.r-project.org或http://www.bioconductor.org/，加载后在R软件中运行。
后续实施例中，分期按照美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟建立的国际标准TNM分期体系的最新版(第8版)。
后续实施例中，“新辅助免疫联合化疗”是指化疗加免疫检查点抑制剂治疗；其中，化疗所用化疗剂为顺铂、紫杉醇；免疫检查点抑制剂为替雷利珠单抗/派姆单抗。
后续实施例中，“辅助化疗”中，患者所用化疗剂为顺铂+紫杉醇。
后续实施例中，“辅助放化疗(CRT)”中，所述CRT为顺铂+紫杉醇+放疗。
以上用药方案，由临床医师根据患者的身体状况、以合理用量进行治疗。
实施例1、样本收集及测序
1、纳入的患者标准
回顾性收集66例未经食管鳞癌新辅助免疫联合化疗的患者样本；前瞻性收集37例接受新辅助免疫联合化疗患者的样本。
2、样本和临床信息采集
回顾性样本免知情，前瞻性样本患者知情后采集患者新辅助治疗前的FFPE组织标本。
3、测序及数据分析
采用FFPE RNA Extraction Kit(商品号)试剂盒来提取FFPE样本中的总RNA(Total RNA)，实验步骤见说明书。使用核酸定量试剂盒测定RNA的浓度。样本RNA的浓度大于等于3.4ng/ul，总量应大于等于100ng。使用Agilent 2100进行RNA完整度质控，要求检测样本的DV200≥20％，若不符合要求，应重新取材或增加原始样本量再进行提取。按DV200值分别设定3个评级：(1)DV200≥70％；(2)30％≤DV200<70％；(3)DV200<30％，不同评级对应不同的RNA片段化处理方式。文库构建、杂交捕获及测序。
下机的数据：使用Affy软件包和Input R软件包处理转录组TPM测序数据。
在回顾性患者队列中，患者的中位年龄为60.8岁，其中21.2％为女性。所有患者均接受手术治疗，并有长期随访资料。随访结束时，66.7％(44/66)患者存活。其中II期44例，III期22例。其中14例(21.2％)患者接受了辅助化疗，5例(7.6％)患者接受了辅助放化疗。
在前瞻性患者队列中，所有患者接受新辅助免疫联合化疗治疗。19例(51.4％)达到主要病理缓解(MPR)(图1)。
实施例2、鉴定与肿瘤进展相关的模块，并进一步筛选核心基因
1、食管鳞癌分子分型分析
对回顾性队列中66例经过RNA测序的食管鳞癌患者样本的基因mRNA表达情况通过K-means聚类，发现当划分为4个簇的时候最佳(图2)，且四个分型中(C1/C2/C3/C4)，无论是66例中术后接受“辅助化疗”或“辅助放化疗”的人群，还是66例中未接受辅助治疗的人群均显示C3预后更好，而C2预后最差(图3)。
反褶积工具CIBERSORT通过在线工具(http://timer.comp-genomics.org/)评估样本中浸润免疫细胞的组成，对C1/C2/C3/C4亚型的基质细胞和免疫细胞进行TME内浸润间质/免疫评分。结果显示，C2是间质型，C3是免疫型(图4)。
2、鉴定核心基因
为了提取间质型亚组的特征标志物，接下来对来自回顾性队列的两类(C2和非C2组)患者的mRNA表达谱进行差异分析，利用R包DESeq2进行基因差异表达分析，筛选log2FC>1(差异倍数>1)，padj<0.1(P值矫正之后的数值)的基因。结果，找到121个上调基因与7330个下调基因(图5)。在前瞻性队列进行对上调基因进行Logistics回归分析，筛选出9个基因(p<0.05)(图6)。Logistics回归分析，森林图中9个基因与免疫新辅助疗效呈显著的正相关(图7)。
综合进行考虑，筛选获得与细胞凋亡和侵袭密切相关的IFI6和PLEK2基因，作为核心基因。
为了提取免疫型特征标志物，接下来对来自回顾性队列的两类(C3 Vs.非C3)患者的mRNA表达谱进行差异分析，利用R包DESeq2进行基因差异表达分析，筛选log2FC>1，padj<0.1的基因，在免疫激活亚组找到69个上调基因与358个下调基因(图8)，对上调基因进行COX回归分析，筛选出6个p<0.05的基因(图9)；在前瞻性队列进行Logistics回归分析，森林图中6个基因与免疫新辅助疗效呈显著的正相关(图10)。
综合进行考虑，筛选获得与食管鳞癌发生发展相关的基因COL19A1，作为核心基因。
实施例3、食管鳞癌相关基因与预后的关系
为了进一步验证上述实施例2中获得的三个基因在食管鳞癌的预后价值，发明人在独立的66例回顾性食管鳞癌队列中进行了免疫组化及患者生存的验证。
1、免疫组化检测
获取这些患者的肿瘤组织样品，进行免疫组化检测。免疫组化抗体见表1。
表1
2、由专业医师和病理专家对免疫组化染色结果进行阅片，评估每个指标的免疫组化染色并取平均值。
在该回顾性队列中，使用PLEK2或IFI6基因作为标志物，结果如图11所示，PLEK2或IFI6基因的表达高低的确可将食管鳞癌患者分成预后好和预后差(图11)。免疫组化图中，高表达PLEK2或IFI6的患者确实预后更差(图12)。
PLEK2联合IFI6两个基因的组合标志物，结果如图12所示，证实其的确可将食管鳞癌患者分成预后好和预后差(图13，P＝0.023；PLEK2&IFI6 high对比PLEK2&IFI6 low)。类似的结果可见图14患者的生存及死亡比例(P＝0.05)。
使用COL19A1基因作为标志物，结果如图15所示，在该回顾性队列中，使用COL19A1基因作为标志物，COL19A1高表达具有更长的总生存期(OS)趋势，并与更长的RFS相关(OR＝0.31，P＝0.044)。在免疫组化图中，COL19A1高表达患者预后更好，见图16。
实施例4、食管鳞癌相关基因与免疫治疗适用性关系
1、分析PLEK2/IFI6基因高表达患者对新辅助免疫联合化疗的敏感性
为了验证食管鳞癌中PLEK2和/或IFI6基因高表达的患者是否可从免疫治疗中获益，发明人进一步在66例回顾性患者及33例接受了新辅助PD-1联合化疗的患者的队列中比较了患者的生存数据及影像图，通过免疫组化及多重免疫荧光进行验证。
(1)多重免疫荧光检测
获取这些患者的肿瘤组织样品，进行多重免疫荧光检测。多重免疫荧光抗体如表2。
表2
(2)多重免疫荧光检测平台
采用Akoya OpalTM五色荧光平台进行多重免疫荧光检测。
比较前瞻性队列中PLEK2、IFI6和COL19A1差异表达患者的新辅助免疫联合化疗的差异。结果显示，PLEK2高表达患者的非-主要病理缓解(non-MRP)发生率显著高于PLEK2低表达患者(图17，P＝0.0321)。同样，IFI6高的患者的非MPR发生率高于IFI6低的患者(图18)。
此外，在蛋白水平上，IFI6或PLEK2在非MPR ESCC样品中高表达(图19)，且两个基因的AUC值分别为0.754和0.716，明显优于以往报道的IFN-γ和Effector T细胞相关模型(图20)。
分析每个样本的免疫得分(ssGSEA)，分析样本得分和具体基因表达的相关性(利用Pearson相关系数)。结果显示，PLEK2高表达与免疫激活特征如记忆性CD8+T细胞、肥大细胞、(未成熟/激活)B细胞和浆细胞样树突状细胞呈负相关。IFI6高表达组与较高水平的免疫抑制环境相关，其特征是免疫功能的负调控(图21)。
在前瞻性队列中，使用ssGSEA算法分析每个样本中28个免疫细胞群体的相对丰度。Non-MPR亚组Th17细胞明显富集。其他免疫细胞类型包括CD8T细胞、T滤泡辅助细胞(P＝0.028)、肥大细胞和浆细胞样树突状细胞(P＝0.0028)在MPR亚组中富集(图22)。
多重免疫荧光验证了不同治疗反应相关的TME特征，结果显示，在非MPR患者中，CD20+/CD27+/-、CD8+/CD27+/-有限，几乎没有Fc-epsilon+细胞(图23)。
同样，PLEK2和IFI6增强的患者，未成熟/活化B细胞(CD20+/CD27-和CD20+/CD27+)和(记忆)效应CD8+T细胞(CD8+/CD27+/-)的浸润更少(图23)。
因此，以PLEK2和/或IFI6基因高表达作为指示，证实PLEK2和/或IFI6基因高表达的患者的确对新辅助免疫联合化疗效果不佳。
PLEK2和IFI6显著低表达的MPR患者，MPR患者显示未成熟/活化的B细胞、(记忆)效应CD8+T细胞和Fc-epsilon+肥大细胞浸润程度显著更高(图23)。
因此，以PLEK2和/或IFI6基因低表达作为指示，证实PLEK2和/或IFI6基因低表达的患者的确对新辅助免疫联合化疗有显著的响应。
2、分析COL19A1高表达患者对新辅助免疫联合化疗的敏感性
为了验证食管鳞癌中COL19A1高表达患者是否可从新辅助免疫联合化疗中获益，发明人进一步在66例回顾性及33例接受了新辅助PD-1联合化疗的患者的前瞻性队列中进行了验证。
对于前瞻性患者队列，免疫组化分析显示，COL19A1高表达的患者可以从新辅助免疫联合化疗中获益(图24)。COL19A1显著优于之前报道的IFN-γ和效应T细胞相关模型(AUC值0.667)(图25)。
分析每个样本的免疫得分(ssGSEA)，进一步分析样本得分和具体基因表达的相关性(利用Pearson相关系数)，结果显示，在回顾性队列中，使用COL19A1基因作为标志物，COL19A1基因上调与免疫效应细胞(记忆B细胞、未成熟B细胞和激活B细胞)正相关(图26A)。并且，COL19A1高表达组的免疫浸润水平：B细胞(P＜0.001)、检查点分子(P＝0.022)和T细胞(P＝0.044)显著高于COL19A1低表达组(图26B)。
前瞻性队列中，Memory B细胞、未成熟B细胞和激活B细胞也与COL19A1表达显著正相关(图27)。
同时，使用多重免疫荧光评估了基线肿瘤组织中CD27和CD20的表达水平。正如预期的那样，观察到大量CD20+和CD27+b细胞浸润，这预示着新辅助免疫联合化疗响应(图28)。
以上结果表明，COL19A1基因高表达患者比低表达患者更能从新辅助免疫联合化疗中获益，更适合进行新辅助免疫联合化疗。
实施例5、标志物的临床应用
收集临床食管鳞癌患者，常规方法制备肿瘤组织样本，利用抗PLEK2蛋白抗体、抗IFI6蛋白抗体、抗COL19A1蛋白抗体(表1)，分别分析样本中PLEK2蛋白、IFI6蛋白、COL19A1蛋白的表达水平。蛋白的高表达和低表达根据常规的统计学方式评价，与前面实施例中评价方式相同。
结果分析：
(a)当PLEK2高表达时，提示该食管鳞癌患者预后不良，生存期短，同时也可预期该患者对于新辅助免疫联合化疗的疗效将较为不理想；当PLEK2低表达时，提示该食管鳞癌患者预后相对较好，生存期相对长；
(b)当IFI6高表达时，提示该食管鳞癌患者预后不良，生存期短，同时也可预期该患者对于新辅助免疫联合化疗的疗效将较为不理想；当IFI6低表达时，提示该食管鳞癌患者预后相对较好，生存期相对长；
(c)当COL19A1高表达时，提示该食管鳞癌患者预后好，生存期长，同时也可预期该患者适合进行新辅助免疫联合化疗，建议患者进行该治疗；当COL19A1低表达时，提示该食管鳞癌患者预后不良，生存期短。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (7)

1.分子标记物在制备用于区分适于新辅助免疫联合化疗的食管鳞癌患者的检测系统中的应用；所述分子标记物为COL19A1；所述检测系统包括检测试剂，含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置；所述检测试剂包括：免疫检测试剂、PCR检测试剂、测序试剂、原位杂交试剂、Western Blot试剂；
其中，所述新辅助免疫联合化疗为化疗加免疫检查点抑制剂治疗；用于所述化疗的药物为：顺铂，紫杉醇；所述免疫检查点抑制剂为：抗PD-1抗体；
进行所述区分时，根据COL19A1的表达，若COL19A1表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者适合以所述新辅助免疫联合化疗作为治疗方案，预后好，生存期长；若COL19A1表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者不适合以新辅助免疫联合化疗作为治疗方案，预后差，生存期短。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，区分适于新辅助免疫联合化疗的食管鳞癌患者后还包括：根据分子标记物的表达：制定所述新辅助免疫联合化疗的治疗/用药方案。
3.如权利要求1～2任一所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为免疫检测试剂或测序试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括：特异性结合所述分子标记物编码的蛋白的抗体、特异性扩增所述分子标记物基因的引物、特异性识别分子标记物基因的探针。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测装置包括：免疫组化装置、基因测序仪器、芯片、探针组、引物探针组或电泳装置。
6.一种系统在制备用于区分适于新辅助免疫联合化疗的食管鳞癌患者的检测装置中的应用，所述系统包括检测单元以及数据分析单元；
所述检测单元包括：测定分子标记物的表达水平的检测试剂，或含有所述检测试剂的试剂盒或检测装置；所述分子标记物为COL19A1；所述检测试剂包括：免疫检测试剂、PCR检测试剂、测序试剂、原位杂交试剂、Western Blot试剂；
所述数据分析单元包括：用于对检测单元的检测结果进行分析处理的处理单元，区分出适于新辅助免疫联合化疗的食管鳞癌患者；
其中，所述新辅助免疫联合化疗为化疗加免疫检查点抑制剂治疗；用于所述化疗的药物为：顺铂，紫杉醇；所述免疫检查点抑制剂为：抗PD-1抗体；
进行所述区分时，根据COL19A1的表达，若COL19A1表达水平显著高则表明该食管鳞癌患者适合以所述新辅助免疫联合化疗作为治疗方案，预后好，生存期长；若COL19A1表达水平显著低则表明该食管鳞癌患者不适合以新辅助免疫联合化疗作为治疗方案，预后差，生存期短。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，区分适于新辅助免疫联合化疗的食管鳞癌患者后还包括：根据分子标记物的表达，制定所述新辅助免疫联合化疗的治疗/用药方案。
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